肖 寒，劉秀妨，鄭 淋，趙謀明，黃明濤

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

膠原蛋白是哺乳動物體內含量最豐富的一類蛋白質，占體內總蛋白含量的30%以上，廣泛分布于皮膚、動脈、肌腱、軟骨和大多數(shù)細胞外基質中。膠原蛋白含有大量重復的“Gly-X-Y”氨基酸序列（Gly為甘氨酸；X、Y為任意氨基酸，其中X主要為脯氨酸，Y主要為羥脯氨酸），可形成三股肽鏈規(guī)律纏繞的螺旋結構，從而賦予膠原蛋白較高的機械強度及穩(wěn)定性。膠原蛋白的這一特性在支持組織結構和保護機體器官上具有重要作用，但是卻因其結構穩(wěn)定、難以水解，導致蛋白利用率較低。目前，水解膠原蛋白的方法主要有化學法和酶法?；瘜W法主要通過酸或堿作用使膠原蛋白纖維溶脹，肽鍵斷裂。此類方法經濟簡便，但是水解率較低，易破壞氨基酸結構，所得膠原蛋白肽質量不高。酶法水解條件溫和，普通蛋白酶（如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶等）酶解時，通過化學法或高溫輔助使膠原蛋白分子變性為明膠則更利于深度水解。而膠原蛋白酶是一種能在生理條件下識別天然膠原蛋白特殊三股螺旋區(qū)域，并對其進行水解的蛋白酶。使用膠原蛋白酶水解膠原蛋白更易獲得具有生物活性的膠原蛋白肽，是提高膠原蛋白水解水平的重要手段。

膠原蛋白酶主要存在于微生物和動物中，在少數(shù)植物中也見報道。它們通常以鋅離子和鈣離子為輔因子，具有多個結構域，在催化結構域中存在保守的鋅結合基序HEXXH（圖1A）。相較于動物源膠原蛋白酶，微生物源膠原蛋白酶的分子質量普遍更大、結構域更復雜（圖1B）、底物適應性更強，且未發(fā)現(xiàn)存在酶原形式，無需通過激活酶原產生酶活性。目前已經篩選到多種可分泌膠原蛋白酶的菌株，如溶組織梭狀芽孢桿菌（，現(xiàn)更名為）、產氣莢膜梭菌（）、破傷風梭菌（）和蠟樣芽孢桿菌（）等。其中，以來源于溶組織梭狀芽孢桿菌的膠原蛋白酶研究最為廣泛，是目前公認的用于鑒定分析新型膠原蛋白酶的標準酶，也是可商品化獲取的微生物源膠原蛋白酶。

圖1 微生物源和動物源膠原蛋白酶序列及結構域比較Fig. 1 Comparison of the sequence and domain of collagenase from microbial and animal sources

1953年，Mandl等首次通過示差沉淀法從溶組織梭狀芽孢桿菌的發(fā)酵液中分離出含有膠原蛋白酶的組分。隨后，Yoshihara和Matsushita等研究發(fā)現(xiàn)溶組織梭狀芽孢桿菌可分泌兩種不同的膠原蛋白酶ColG和ColH。根據(jù)兩種膠原蛋白酶對天然膠原蛋白底物和特異性合成肽底物FALGPA（-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala）水解活性的差異，ColG和ColH又分別稱為I型膠原蛋白酶（對天然膠原蛋白的水解活性較高）和II型膠原蛋白酶（對FALGPA水解活性較高）。近年來，學者圍繞兩種膠原蛋白酶進行了大量的研究報道。本文在國內外最新研究進展的基礎上，對溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的結構特征、水解機理、生產現(xiàn)狀和實際應用等進行歸納總結，并對其未來的研究方向進行展望，以期能夠為微生物源膠原蛋白酶的進一步開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 微生物源膠原蛋白酶結構特征

微生物源膠原蛋白酶通常具有多個結構域（圖2），分別是前肽、激活結構域、肽酶結構域、PKD和CBD。按照其功能又可將激活結構域和肽酶結構域歸為催化功能模塊，將PKD和CBD歸為膠原募集模塊。膠原募集模塊的差異也是不同菌種來源的膠原蛋白酶在結構差異性上的重要體現(xiàn)。

圖2 微生物源膠原蛋白酶結構域比對Fig. 2 Domains of different microbial collagenases

1994年，Yoshihara等從溶組織梭狀芽孢桿菌JCM 1403中克隆膠原蛋白酶基因，發(fā)現(xiàn)該基因的開放閱讀框含有3 066 個堿基對，共編碼1 021 個氨基酸。1999年，Matsushita等從溶組織梭狀芽孢桿菌JCM 1403的培養(yǎng)上清液中純化出與ColH的N末端氨基酸序列不同的膠原蛋白酶ColG，該蛋白含有1 118 個氨基酸，由（3 357 bp）編碼。

前肽可進一步分為信號肽和前導肽。ColG的前肽包括110 個氨基酸，其中前45 個氨基酸為信號肽。而ColH的前肽為40 個氨基酸，前30 個氨基酸為信號肽。信號肽是引導新合成蛋白質進入分泌通路的短肽，可將蛋白質定位到含不同膜結構的亞細胞器中。但是，目前膠原蛋白酶在溶組織梭狀芽孢桿菌中的具體分泌途徑未知，該信號肽介導蛋白質的分泌區(qū)域尚不清楚。Eckhard和Ducka等在大腸桿菌中重組表達膠原蛋白酶時發(fā)現(xiàn)缺少前肽序列也可以得到具有催化活性的膠原蛋白酶，認為該結構并不是蛋白正確折疊所必需的。

肽酶結構域是發(fā)揮膠原蛋白肽水解活性的重要結構，當其單獨存在時，其水解短肽的能力與全長膠原蛋白酶相近，但卻喪失了水解天然膠原蛋白的活性。當激活結構域與肽酶結構域共同存在時，水解天然膠原蛋白的活性恢復。溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶是擁有多模塊結構的鋅金屬蛋白酶，其N端的肽酶結構域中具有保守的HEXXH鋅結合基序，該基序與其下游間隔28～32 個氨基酸的另一谷氨酸共同形成鋅離子配位結構。Eckhard等解析了ColG的晶體結構，發(fā)現(xiàn)Zn與His523、His527、Glu555和一個水分子可形成一個四面體結構，水分子以氫鍵的形式與Glu524相連。Sch?nauer等解析了ColH與抑制劑復合時的晶體結構，認為His455、Glu456、His459和Glu487與Zn形成配位結構。

膠原募集模塊中的CBD可特異性地識別結合膠原蛋白的三股螺旋結構，是膠原蛋白酶水解不溶性天然膠原蛋白的重要結構，其傾向于結合在膠原蛋白三股螺旋較松散的部分。PKD與膠原蛋白的結合不緊密，但可以進一步強化CBD與纖維狀膠原蛋白的結合能力。如圖3所示，ColG含有兩個串聯(lián)CBD和一個PKD，Ca的存在可以使ColG中兩個CBD之間的連接部分由-螺旋轉變?yōu)?折疊，增強CBD與膠原蛋白的結合，也使其不易被其他蛋白酶水解，提高了全長膠原蛋白酶的穩(wěn)定性。ColH含有一個CBD和兩個PKD，CBD可以沿著膠原蛋白纖維滑動，找到更容易水解的位點，兩個PKD的存在使其對膠原蛋白的親和力更強。根據(jù)這一結構特征，二者可協(xié)同水解膠原蛋白，即ColG先錨定在膠原蛋白纖維最脆弱的區(qū)域使原纖維溶脹，ColH結合在這些溶脹的區(qū)域進行水解。

圖3 ColG和ColH的結構示意圖[21,23]Fig. 3 Structures of ColG and ColH[21,23]

此外，膠原蛋白酶譜實驗表明，這兩種酶除了116 kDa的全長形式，對C末端部分水解還可得到若干殘余的N末端（如源自ColG的67、78 kDa和82 kDa片段；源自ColH的98、105 kDa片段），且依舊具有酶解明膠的能力，因而也被稱為明膠酶。這些殘余片段對明膠的酶解活性甚至高于全長形式的膠原蛋白酶，但只有全長的膠原蛋白酶才能消化不溶性膠原蛋白，這也說明膠原蛋白酶C末端的膠原募集模塊在水解天然膠原蛋白中發(fā)揮了重要作用。

2 膠原蛋白酶的水解機理

2011年，Eckhard等首次對膠原蛋白酶ColG進行整體晶體結構解析，并通過分別異源表達該酶各個結構域推測其水解膠原蛋白和微原纖維膠原蛋白（由5 條三股螺旋纏繞而成）的機理，大致分為以下3 個步驟，如圖4所示。

圖4 膠原蛋白和微原纖維膠原蛋白的水解模型[21]Fig. 4 Collagenolytic models of triple-helical and microfibrillar collagen[21]

首先膠原蛋白酶的肽酶結構域與膠原蛋白三股螺旋結合（圖4A）；此時膠原蛋白酶處于開放狀態(tài)，激活結構域未與底物相互作用，膠原蛋白尚未發(fā)生水解；隨后膠原蛋白酶閉合，激活結構域與三股螺旋發(fā)生相互作用（圖4B）。水解過程中，膠原蛋白酶漸漸打開成半開放構象，使3 個-鏈解旋并依次降解（圖4C）。在三股螺旋被徹底水解后，膠原蛋白酶便恢復至初始開放狀態(tài)，進行下一輪水解。對于由5 條三股螺旋纏繞形成更為復雜的微原纖維膠原蛋白，水解步驟也大致相同，但每次只水解一個三股螺旋膠原蛋白，其余部分被排到酶外等待下一次水解（圖4D～F）。

膠原蛋白酶ColG和ColH的酶切位點都是膠原蛋白“Gly-X-Y”重復序列中Y與Gly之間的肽鍵，但二者底物偏好性不同，首選的切割位點也有差異（表1），共同存在時表現(xiàn)出對膠原蛋白的協(xié)同降解作用。ColG的首選底物為三股螺旋膠原蛋白，首選切割位點為N末端和C末端。而ColH水解底物的親和力從大到小依次為多肽、變性膠原蛋白和三股螺旋膠原蛋白，首選切割位點為序列內部。

表1 I型和II型溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的特性Table 1 Characteristics of type I and type II collagenases from Clostridium histolyticum

Eckhard等利用蛋白酶裂解位點的蛋白質組學鑒定（proteomic identification of protease cleavage sites，PICS）分析了膠原蛋白酶ColG和ColH的切割位點特異性，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白酶ColG和ColH在P2和P2’位置顯示出對Pro的明顯偏好，在P3和P1’中顯示出對Gly的偏好。這與典型膠原蛋白中大量存在的Gly-Pro-X和Gly-X-Hyp序列一致，解釋了溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶水解天然膠原蛋白的高度特異性。

3 膠原蛋白酶活力檢測方法

膠原蛋白酶的酶活力檢測方法主要有平板法、顯色法和熒光法等。

平板法可用于初步篩選具有膠原蛋白水解活性的菌株。具體方法是將具有膠原蛋白酶活性的菌株在明膠平板上進行培養(yǎng)后，用酸性汞試劑處理平板，未被降解的明膠變性沉淀，可觀察到菌落周圍出現(xiàn)水解圈，通過水解圈與菌落直徑比值的大小可以初步判斷該菌株分解膠原蛋白能力的強弱。該方法操作簡便，可用于初步鑒定膠原蛋白酶水解活性，但是水解圈大小根據(jù)觀察時間不同而有所區(qū)別，且靈敏度較低，多用于定性檢測。

顯色法中，茚三酮顯色法是一種常規(guī)的膠原蛋白酶酶活檢測方法，通過酶水解底物釋放至體系中游離氨基酸的含量來表征膠原蛋白酶的水解活力。該方法通常以可溶性膠原蛋白、不溶性膠原蛋白和變性膠原蛋白明膠等作為底物，以甘氨酸或亮氨酸的生成當量來定義酶活力單位U。Zhang Yanfang等對常規(guī)的茚三酮顯色法進行優(yōu)化，將660 μg明膠溶解在343 μL反應緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，含有5 mmol/L CaCl和1 μmol/L ZnCl）中，加入7 μL質量濃度1 mg/mL膠原蛋白酶，37 ℃孵育，再加入等量終止液（含有12%（/）聚乙二醇6000和25 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉）終止反應。隨后取100 μL反應液加入500 μL茚三酮顯色試劑，80 ℃水浴10 min，冷卻后再加入500 μL HO并混合均勻，在570 nm波長處測定吸光度。優(yōu)化后反應形成的紫色絡合物更加穩(wěn)定，且不需要強酸沉淀、離心和其他額外處理來去除未反應底物和膠原蛋白酶。該方法經濟方便，但是特異性低，若未經純化直接取培養(yǎng)液上清進行測定，容易受到菌株分泌的其他蛋白酶或者培養(yǎng)液中殘留氨基酸的影響，從而對實驗結果造成干擾。

除了以天然或變性膠原蛋白為底物，一些人工合成的特異性底物也常用于膠原蛋白酶活力的檢測，如Azocoll、FALGPA（-(3-[2-furyl]acryloyl)--leucylglycyl--prolyl--alanine）和Pz-PLGPA（PZ--prolyl--leucyl-glycyl--prolyl--arginine）等。Azocoll是一種與偶氮染料連接的膠原蛋白，被膠原蛋白酶水解后染料釋放，可通過測定520 nm波長處吸光度來計算酶活力。FALGPA和Pz-PLGPA是人工合成的膠原蛋白酶寡肽底物，不易被其他蛋白酶水解。其中，F(xiàn)ALGPA是美國Sigma-Aldrich公司用來定義膠原蛋白酶產品酶活力的常用底物，通過測定酶與底物反應后345 nm波長處吸光度的減少量計算水解量，1 個FALGPA unit指在25 ℃、pH 7.5的條件下，每分鐘水解1 μmol的FALGPA。而Pz-PLGPA法則以反應后在320 nm波長處測吸光度的增量定義酶活力單位，1 個PZ unit指在25 ℃、pH 7.1的條件下，每分鐘催化水解1 μmol的Pz-PLGPA。此類方法通常較為靈敏，且測得的酶活力較準確，但使用合成短肽作為底物測得的酶活力不能直接體現(xiàn)該膠原蛋白酶對天然膠原蛋白的水解活性。

除了這些常見的底物，Saikumari等合成了一種新的熒光底物，能專一地被溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶切割而不受其他蛋白酶影響，該底物水解后受336 nm激發(fā)光激發(fā)后，在490 nm波長處的發(fā)射熒光顯著增強，反應快速靈敏。Go等利用鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）與游離氨基酸結合產生熒光的特點，在膠原蛋白酶與底物反應后的反應液中加入質量濃度1 mg/mL OPA（0.1 mol/L PBS，pH 7.4），被360 nm激發(fā)光激發(fā)后，檢測460 nm波長處的熒光強度。此類方法快捷靈敏，能在較短的時間內獲得大量數(shù)據(jù)，但熒光試劑通常較為昂貴，檢測成本較高。

除了上述方法，膠原蛋白酶譜法也用于膠原蛋白酶活力的檢測。膠原蛋白酶譜法是一種基于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的檢測方法。樣品在含有底物蛋白的聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離或在電泳后將凝膠浸泡在底物溶液中，再通過孵育、染色、脫色的方法顯示條帶。一般使用考馬斯亮藍染色后脫色，在藍色背景下可觀察到白色條帶（底物降解后不被著色），條帶的灰度與膠原蛋白酶活力成正比。Inanc等用含有質量濃度0.3 mg/mL提取自鼠尾肌腱的I型膠原蛋白的凝膠進行電泳，經去除SDS、孵育、染色、脫色后可見清晰條帶。該方法十分靈敏，檢測限可低至1 ng膠原蛋白酶，并且可以基于膠原蛋白酶標準曲線來量化未知樣品中的膠原蛋白酶活力性水平。此外，膠原蛋白與膠原蛋白酶的酶解反應引起的物理變化（例如濁度和黏度的變化）也被用于分析膠原蛋白酶酶活力。

4 膠原蛋白酶生產現(xiàn)狀

4.1 發(fā)酵生產

目前商業(yè)化的膠原蛋白酶主要來自溶組織梭狀芽孢桿菌，通過培養(yǎng)溶組織梭狀芽孢桿菌再從其培養(yǎng)上清液中分離純化所需的膠原蛋白酶。該方法的優(yōu)勢在于溶組織梭狀芽孢桿菌將膠原蛋白酶分泌到培養(yǎng)基中，可以在簡單的液體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，獲得膠原蛋白酶的效率較高。但該方法所得的膠原蛋白酶粗制劑中還含有棕色色素、梭菌蛋白酶、氨基肽酶和幾種中性蛋白酶。梭菌蛋白酶的存在導致粗酶制劑會對成骨細胞和胰島細胞產生細胞毒性，也會導致純化后期和貯存運輸過程中膠原蛋白酶的降解。上清液中其他酶類以及多種C末端截短的膠原蛋白酶的存在增加了膠原蛋白酶分離純化時工藝的難度，且容易造成不同批次的膠原蛋白酶粗制劑活性差異較大。目前，研究人員主要從優(yōu)化溶組織梭狀芽孢桿菌的培養(yǎng)基和改進純化方式兩大方面著手提高膠原蛋白酶的純度。

Wegman等采用以植物氮源為主的培養(yǎng)基培養(yǎng)溶組織梭狀芽孢桿菌，結果發(fā)現(xiàn)降低葡萄糖質量濃度（質量濃度小于5 g/L）和增加鹽質量濃度（質量濃度大于5 g/L）能顯著降低梭菌蛋白酶的含量，純化過程可以在室溫下進行，并且無需添加蛋白酶抑制劑，所得的膠原蛋白酶制劑酶活與標準膠原蛋白酶相當，純度大于95%，在4 ℃存放17 d后仍能保持活性且未見降解。該方法分離的得到的I型膠原蛋白酶以可溶性鼠尾膠原蛋白（soluble rat tail collagen，SRC）為底物測得酶活力為1 967～3 327 U/mg，II型膠原蛋白酶以合成肽Carbobenzooxy-glycyl--prolylglycyl-glycyl--prolyl--alanine（zGPGGPA）為底物，測得酶活力為81 934～119 522 U/mg。

Sabatino等采用非動物源性培養(yǎng)基培養(yǎng)strains 004制備冷凍保存的菌種庫，以蛋白胨為主要氮源制備培養(yǎng)液，并采用分批補料發(fā)酵方式進行發(fā)酵，發(fā)酵結束后經0.2 μm過濾器、離子交換色譜、疏水層析和切向流過濾得到純化的膠原蛋白酶，總產量為280～350 mg/L，純度大于97%。該方法可以擴大到20 L規(guī)模發(fā)酵，且批次質量穩(wěn)定，分離的得到的I型膠原蛋白酶以SRC為底物，測得酶活力為1 700～3 500 U/mg，II型膠原蛋白酶以合成肽zGPGGPA為底物，測得酶活力為43 000～69 000 U/mg。

4.2 異源表達

為獲取較高純度的膠原蛋白酶，以便進一步對膠原蛋白酶的生化性質、酶結構、催化機理、構效關系展開研究，同時拓展其在生物技術和醫(yī)學等領域應用，研究人員嘗試通過基因工程的手段重組表達生產膠原蛋白酶。目前相關研究已經在不同的表達體系中開展，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和產氣莢膜梭菌等。

大腸桿菌具有生長迅速、遺傳背景清晰、易于基因編輯等優(yōu)點，是研究最廣泛的模式生物。1994年，Yoshihara等在大腸桿菌中首次克隆了源自溶組織梭狀芽孢桿菌的膠原蛋白酶基因。隨后，相關的重組表達研究陸續(xù)開展。2009年，Ducka等在大腸桿菌中表達和純化了溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶ColG和ColH，即以pMBP-Parallel2為載體，BL21為宿主進行誘導發(fā)酵，采用固定化金屬親和色譜初步純化、直鏈淀粉親和色譜再次純化，去除N端標簽后再采用離子交換色譜和尺寸排阻色譜進行最終純化，實現(xiàn)了質量濃度至少10 mg/L的產量，純度達到95%。Bertuzzi等通過密碼子優(yōu)化、可溶性優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化等策略，將密碼子優(yōu)化后的膠原蛋白酶ColG和ColH基因序列分別克隆到pMAL-c2X載體中，轉化菌株接種到TB培養(yǎng)基（補充有質量濃度100 μg/mL氨芐青霉素和質量分數(shù)0.2%葡萄糖）中，30 ℃、260 r/min培養(yǎng)，當菌液OD≈0.6時加入終濃度0.3 mmol/L的異丙基---硫代半乳糖苷誘導重組蛋白表達，30 ℃、260 r/min培養(yǎng)3 h可獲得約質量濃度160 mg/L的ColG或ColH。與市售的溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶相比，該重組膠原蛋白酶以Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala為底物時酶活力約是Liberase（瑞士Roche公司）的1.7 倍，且在處理胰島細胞時，僅用NB 8 Broad Range（德國NordMark公司）1/5的酶量便可達到相同的提取效果。

除了以大腸桿菌為表達載體，膠原蛋白酶也可在其他原核體系進行異源表達。1996年，Jung等采用DB104異源表達ColH，發(fā)現(xiàn)相比LB培養(yǎng)基，表達載體在含有0.5 mol/L琥珀酸鈉的改良LB培養(yǎng)基中穩(wěn)定性較高。重組膠原蛋白ColH產量約為0.66 mg/L，以Pz-PLGPA為底物測得酶活力為1 210 U/mg。1998年，Matsushita等也在DB104中表達了C末端融合GST標簽的ColH，以Pz-PLGPA為底物測得酶活力為771.5 U/mg，以I型膠原蛋白為底物測得酶活力為1 413.8 U/mg。此外，2008年Tamai等構建了質粒pFN，在產氣莢膜梭菌中表達了C末端帶有6×His標簽的膠原蛋白酶ColH，純化得到的蛋白質量濃度約10 mg/L，以Pz-PLGPA為底物測得酶活力為1 028 U/mg，以I型膠原蛋白為底物測得酶活力為1 216 U/mg。他們發(fā)現(xiàn)C末端帶有6×His標簽的膠原蛋白酶對I型膠原蛋白的水解活性較不帶標簽的ColH低，推測是由于C末端的6×His標簽影響CBD結構域與膠原蛋白的親和力，從而影響膠原蛋白酶對不溶性膠原蛋白的水解活性。此外，在膠原蛋白酶N末端的6×His標簽對其酶活也有一定影響，這可能是由于6×His標簽干擾了催化活性中心Zn的正確定位從而影響了膠原蛋白酶的活力。目前溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶的異源表達主要集中在原核體系（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、產氣莢膜梭菌），真核體系中的研究報道較少。大腸桿菌表達體系可以實現(xiàn)異源蛋白的高水平表達，膠原蛋白酶的產量已到達160 mg/L。該系統(tǒng)具有豐富的功能元件和完善的分子遺傳操作平臺，有利于研究的深入開展，但是該系統(tǒng)容易形成包涵體，有待通過研究提高可溶性膠原蛋白酶的產量。枯草芽孢桿菌表達體系具有高效的蛋白胞外分泌能力，且無明顯的密碼子偏好性，但是該系統(tǒng)存在質粒不穩(wěn)定的問題，可用的生物元件相對較少。產氣莢膜梭菌與溶組織梭狀芽孢桿菌同源性高，有利于溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶的正確折疊表達，但是該系統(tǒng)在代謝工程中應用較少。真核系統(tǒng)可實現(xiàn)蛋白質的翻譯后修飾，如糖基化和磷酸化等，也能實現(xiàn)胞外分泌及可溶性表達，利于下游純化，但是目前溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶在真核生物中的異源表達鮮見報道。在畢赤酵母中進行基礎表達的研究曾有報道，但未進行表達優(yōu)化，也未進一步對表達所得的膠原蛋白酶進行純化研究。

綜上所述，溶組織梭狀芽孢桿菌源膠原蛋白酶異源表達的產量和酶活力仍有待提升，需綜合考量酶自身特性和宿主的蛋白分泌特征，利用相應的代謝工程手段進行全局調控從而實現(xiàn)高效表達。

5 膠原蛋白酶的實際應用

5.1 生物醫(yī)藥

膠原蛋白是細胞外基質和結締組織中的主要結構蛋白，其異常的合成和積累常常會導致纖維化相關疾病，因此，在生物醫(yī)藥領域常采用注射膠原蛋白酶的手段治療相關疾病，如腰椎間盤突出、掌筋膜攣縮和佩羅尼病等。掌筋膜攣縮是掌腱筋膜中膠原蛋白的沉積導致掌指關節(jié)發(fā)生攣縮，使手指的正常功能受損的疾病，多發(fā)于中老年男性。2010年2月美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準了溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶用于掌筋膜攣縮的非手術療法。膠原蛋白酶注射療法與掌筋膜切斷術等手術療法相比具有副作用更少、作用溫和、患者滿意度高等優(yōu)勢。Syed等的體外研究表明溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶能有效地消化病灶處的細胞外基質，而不會對非膠原組織成分產生明顯的細胞毒性或結構損傷，但該方法也存在復發(fā)率較高的問題。Villegas等制備了一種膠原蛋白酶納米膠囊，并在局部真皮纖維化的小鼠模型中進行了實驗。該膠囊可在生理條件下逐漸釋放封裝的膠原蛋白酶，藥效最長可達10 d。與注射游離膠原蛋白酶相比，注射膠原蛋白酶納米膠囊的小鼠真皮纖維化面積顯著減少，且并未觀察到其他不良影響。

膠原蛋白酶還可應用于傷口清創(chuàng)，清除傷口處壞死或污染的組織有助于傷口的恢復，對于一些慢性、不愈合的傷口具有較好的效果，在臨床上應用廣泛。以溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶為主要成分的膠原蛋白酶軟膏Santyl是唯一一種獲得FDA批準用于傷口和燒傷清創(chuàng)的酶制劑。研究表明，溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶可以在7 個特定的位點對膠原蛋白進行切割，清除壞死組織的同時也產生一些副產物（生物活性肽），可以刺激成纖維細胞、角質形成細胞和內皮細胞的遷移和增殖，改善傷口的炎癥反應，促進血管生成和傷口愈合。Waycaster等對使用Santyl軟膏治療慢性皮膚潰瘍的臨床效果和治療成本進行了分析，認為膠原蛋白酶軟膏無論是單獨使用或是輔以其他的治療手段均可以有效清創(chuàng)，且不受使用群體和診療環(huán)境的限制。與使用水凝膠敷料或手術清創(chuàng)的方法相比，使用膠原蛋白酶治療的患者復診清創(chuàng)的次數(shù)更少，傷口恢復更快，綜合而言花費的治療成本較低。此外，膠原蛋白酶還用于治療青光眼、子宮肌瘤、慢性完全閉塞病變、基因治療等方面，相關的臨床研究有待進一步發(fā)展。

細胞培養(yǎng)是分子生物學、生物技術以及生物制藥等研究和產業(yè)領域的重要技術，有效的細胞分離是其關鍵環(huán)節(jié)，通常使用酶來使細胞組織解聚。由于膠原蛋白是細胞外基質的重要成分且膠原蛋白酶不損傷細胞膜，用膠原蛋白酶處理含有大量膠原纖維的組織后，可獲得各種細胞功能正常、形狀完整且存活率高的細胞，多年來已被廣泛應用于細胞分散、組織分離和實驗室細胞培養(yǎng)，成功用于分離骨骼肌干細胞、內皮細胞、脂肪基質細胞、神經細胞以及胰島等。Ishii等利用膠原蛋白酶分離得到的骨骼肌干細胞保留了細胞的表面抗原，并且具有良好的再生能力。胰蛋白酶雖然也常用于細胞解離，但天然膠原蛋白的三股螺旋區(qū)對胰蛋白酶有較強的抵抗作用。因此，對于一些高膠原蛋白含量的纖維組織和對胰蛋白酶敏感的組織更適合使用膠原蛋白酶進行細胞分離，二者與其他酶復合使用可以得到更好的分離效果。

5.2 食品加工

在食品工業(yè)中，使用酶來輔助食品加工是常見的方法，它可以提高食品的營養(yǎng)和功能特性。在膠原蛋白酶的作用下，膠原蛋白被水解成膠原蛋白肽。研究表明攝入膠原蛋白肽可能有助于機體合成膠原蛋白，具有多種健康益處，如改善皮膚健康、減緩關節(jié)疼痛和預防骨質疏松等。Yang Xinghao等利用膠原蛋白酶水解魚骨、魚皮、魚鱗等海產品副產物，發(fā)現(xiàn)水解物具有較高的抗氧化活性。Song Yihang等利用重組膠原蛋白酶水解牛骨膠原蛋白，通過響應面法優(yōu)化水解條件，使用質量濃度110 μg/mL的膠原蛋白酶在35 ℃、pH 8條件下制得可溶性膠原蛋白肽，并從中鑒定出5 種新型抗氧化肽。Yi Jierong等使用膠原蛋白酶水解草魚魚皮得到的水解物具有血管緊張素轉換酶抑制活性和抗氧化活性，可用于開發(fā)降血壓功能性食品，還能延長食品的保質期。2020年6月，美國膠原蛋白品牌Vital Proteins多數(shù)股權被雀巢健康科學收購，這是其首次收購膠原蛋白生產企業(yè)，標志著行業(yè)巨頭對膠原蛋白領域的重視。近年來，我國膠原蛋白市場處于蓬勃發(fā)展階段，2019年中國膠原蛋白的市場規(guī)模增長至9.83億 美元，約占全球市場的6.40%，預計到2027年，中國膠原蛋白的市場規(guī)模將達到15.76億 美元，膠原蛋白肽作為功能食品配料和膳食補充劑具有可觀的應用前景。

在肉類嫩化方面，肉的嫩度與結締組織中膠原蛋白的含量密切相關，膠原蛋白水解酶可以通過消化膠原蛋白使肉變嫩，并在肉制品中產生良好的風味，因此在肉類工業(yè)中得到了廣泛的應用。其他動植物蛋白酶對底物的特異性不強，用其處理肉制品可能會帶來一些不良的風味，影響肉制品的感官品質，而用膠原蛋白酶處理能針對性地水解膠原蛋白，降低結締組織的韌性使肉類嫩化。

6 結 語

溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶可高效水解膠原蛋白，在生物醫(yī)藥、食品加工等行業(yè)得到了廣泛應用，是最具代表性的微生物源膠原蛋白酶。目前，對溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的組成和結構已有了較為清晰的認識，同時該酶也在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和產氣莢膜梭菌中實現(xiàn)了異源表達，但是仍然有以下問題有待解決。

在分泌機制方面，膠原蛋白酶在溶組織梭狀芽孢桿菌中的具體分泌機制未知，前導肽的具體功能作用及ColG和ColH分子截短形式的產生機理有待研究。在酶產量方面，針對純化標簽對膠原蛋白酶活力的影響以及蛋白產量低等問題，可通過選擇不同的表達體系（如嘗試真核表達體系：釀酒酵母或畢赤酵母等），并對異源表達體系進行代謝途徑改造來進一步提高生產效率。在實際應用方面，為提高膠原蛋白酶的穩(wěn)定性和生物利用度，還可通過包埋法、吸附法和共價結合法等對膠原蛋白酶進行固定化。在酶學性質拓展方面，可利用計算機輔助設計進行酶工程化改造提高酶活力、穩(wěn)定性和底物特異性等。此外，由于膠原蛋白酶為模塊化酶，可對不同膠原蛋白酶的優(yōu)勢模塊進行交換，獲取更具有優(yōu)勢的膠原蛋白酶。