解冬曉，李昊楠，孟榮華，李培海，張夢啟，翟宏斌，劉可春，馬耀宏，李曉彬,*

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物研究所，山東 濟南 250103；2.鄒城市疾病預防控制中心，山東 濟寧 273500；3.北京大學深圳研究生院，廣東 深圳 518000）

血管生成是在原有血管基礎上生成新血管的過程，此過程受多種誘導因子和抑制因子的相互作用，從而維持機體處于正常生理健康狀態(tài)。當血管生成不足時，會引起神經缺損、高血壓、腦缺血性中風、骨質疏松、閉塞性血管炎、糖尿病性周圍血管病變和心肌梗死等一系列相關疾病。尋找具有促進血管生成作用的藥物是治療上述缺血性疾病的重要策略，也是當今臨床研究的熱點。

血管生成藥物的發(fā)現(xiàn)需要借助血管生成模型，常見的血管生成模型包括體外模型（內皮細胞模型和大鼠動脈環(huán)模型）、體內模型（角膜微囊、雞胚絨毛尿囊膜、圓盤血管生成模型和海綿-基質膠模型等）和整體動物模型（斑馬魚模型和爪蟾蝌蚪模型）。其中，斑馬魚模型具有體型小、產卵多、發(fā)育周期短、胚胎透明等優(yōu)點，兼具細胞模型的高通量性和動物模型的高內涵性，與人類基因組的同源性高達87%。斑馬魚符合“3R”原則（reduction, replacement, refinement）（減少、替代、優(yōu)化），被歐洲替代法驗證中心推薦為新的模式動物，也已被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）和歐洲藥物評審組織（The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，EMEA）接受用于進行藥理學評價申報臨床試驗，因此斑馬魚作為藥物篩選模式動物已得到國際公認。斑馬魚為體外發(fā)育、胚胎透明，同時通過轉基因綠色熒光標記血管使得能夠在活體胚胎中直觀而快捷地觀察樣品對其血管系統(tǒng)的影響。目前，作為藥物篩選模型，斑馬魚已越來越多的被研究團隊用于血管功能分子的篩選與評價。本研究利用斑馬魚模型，評價各磷脂樣品對Vatalanib（PTK787）誘導損傷的斑馬魚體節(jié)間血管（intersegmental vessel，ISV）和腸下靜脈血管（subintestinal vein vessel，SIV）生長情況的影響，綜合評估和比較不同磷脂的促血管生成活性。

磷脂廣泛存在于生物體內，是各種生物膜的重要組成部分，在調控機體代謝等方面起著至關重要的作用。磷脂具有豐富的生物活性和保健功能，如在預防心腦血管疾病方面，可以降血脂、促進血液循環(huán)。現(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn)磷脂具有保護或促進血管生成的作用，例如增加不飽和脂肪酸的攝入可以改善臨床病理性血管生成減弱的現(xiàn)象，溶血磷脂酰膽堿對血管平滑肌細胞具有增殖作用。本課題組前期研究也初步發(fā)現(xiàn)來源于蝦頭的磷脂對斑馬魚血管生成具有較好的促進作用，但目前鮮有研究以血管生成作為靶點系統(tǒng)評價磷脂的生物活性。因此，本實驗選擇不同來源、不同類型的磷脂，利用斑馬魚血管生成模型，綜合比較磷脂成分的促血管生成活性，以期為以磷脂作為有效成分進行促血管生成類藥品和保健食品、特醫(yī)食品等功能性食品的開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

血管熒光轉基因斑馬魚Tg（∶）由山東省科學院生物研究所提供，斑馬魚飼養(yǎng)于斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，溫度（28.0±0.5）℃，每天重復14 h黑暗和10 h光照交替的循環(huán)，每日喂食顆粒狀餌料和剛孵出的鹵蟲無節(jié)幼體兩次。

南美白對蝦蝦頭、雞蛋和大豆購自當地市場；大豆磷脂軟膠囊、魚油軟膠囊、卵磷脂絡合碘片、多烯磷脂酰胺膽堿膠囊購自當地藥店。

1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea，PTU）、鏈酶蛋白酶Ev、Vatalanib（PTK787）、丹參素鈉（salvianic acid A sodium，SAAS）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）美國Sigma公司；丹紅注射液（10 mL/支） 山東步長制藥股份有限公司；乙醇、丙酮等分析純 山東沃恩生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng) 北京愛生科技公司；體視熒光顯微鏡 德國蔡司公司；TU-1901紫外分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；1260超高效液相色譜儀（ultra performance liquid chromatography，UPLC）美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 磷脂提取物的制備及實驗用磷脂的準備

參考文獻[11]的方法，以大豆、蛋黃、南美白對蝦蝦頭為原料分別進行磷脂提取物的制備：將各原料分別粉碎、勻漿，按料液比1∶10（/）加入體積分數95%乙醇溶液，攪拌提取2 次，每次提取6 h，合并提取液，將提取液減壓抽濾，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮后蒸干，再溶于50 mL的溶液（（質量分數1% CaCl）∶（無水乙醇）＝1∶20）中，加入溶液4 倍體積的正己烷萃取，正己烷層使用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮；加入正己烷，配成質量濃度為0.5 g/mL的溶液，加入溶液10 倍體積的丙酮混勻，4 ℃靜置24 h，離心（10 000 r/min、10 min），沉淀于真空干燥箱45 ℃干燥獲得各磷脂提取物。所得大豆、蛋黃、南美白對蝦磷脂提取率分別為0.15%、4.63%和0.43%（磷脂提取物質量除以原料質量得到）。采用分光光度法（鉬藍比色法）測定磷脂的質量分數，測得大豆、蛋黃、南美白對蝦磷脂提取物中總磷脂質量分數分別為47.32%、83.79%和73.28%。

實驗所用磷脂包括不同來源及不同類型的磷脂。不同來源的磷脂包括商用的大豆磷脂軟膠囊、魚油軟膠囊、卵磷脂絡合碘片、多烯磷脂酰胺膽堿膠囊，其中膠囊破碎后取內容物，藥片碾碎成粉末。本實驗所用磷脂提取物分別提取自大豆、蛋黃、南美白對蝦蝦頭；不同類型磷脂包括PE、PC、PI、PS、PM 5 種磷脂標準品。

1.3.2 斑馬魚胚胎的準備

本實驗選用血管熒光轉基因斑馬魚Tg（∶）作為實驗模型，按雌雄數量1∶2的比例取健康成熟的斑馬魚放入交配缸內，中間放置隔板。次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵1 h后收集受精卵，并用新鮮養(yǎng)魚水沖洗3 次。為避免發(fā)育過程中的色素沉著影響結果，在含胚胎的養(yǎng)魚水中加入終質量分數為3%的PTU，放入28 ℃光照培養(yǎng)箱中控光培養(yǎng)，中間每24 h更換約1/3養(yǎng)魚水，并及時吸出死亡胚胎。

1.3.3 促進斑馬魚ISV生成的活性評價

將1.3.2節(jié)發(fā)育至24 h的斑馬魚胚胎隨機分為6 組，即空白對照組、模型組、陽性對照組和磷脂樣品組（3 個劑量），置于24 孔板中，每組3 個平行孔，每孔10 枚胚胎。空白對照組加2 mL養(yǎng)魚水，模型組加入2 mL含0.25 μg/mL PTK787的養(yǎng)魚水，陽性對照組加2 mL含有PTK787（0.25 μg/mL）和SAAS（100 μg/mL）的養(yǎng)魚水，磷脂3 個劑量組分別加入2 mL含有PTK787（終質量濃度0.25 μg/mL）和磷脂樣品（終質量濃度分別為20、40、80 μg/mL）的養(yǎng)魚水。將以上各組分別放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。利用熒光顯微鏡觀察斑馬魚ISV生成情況并采集其圖像，采用Image Pro Plus 5.0軟件測量ISV長度。

1.3.4 促進斑馬魚SIV生成的活性評價

將1.3.2節(jié)發(fā)育至72 h的斑馬魚將胚胎隨機分為4 組，即空白對照組和磷脂樣品組（3 個劑量），置于24 孔板中，每組3 個平行孔，每孔10 枚胚胎?？瞻讓φ战M加2 mL養(yǎng)魚水，3 個劑量的磷脂樣品組在加入2 mL養(yǎng)魚水中的同時分別加入各磷脂樣品（終質量濃度分別為20、40、80 μg/mL）。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，利用熒光顯微鏡觀察斑馬魚SIV生成情況并采集其圖像，采用Image Pro Plus 5.0軟件測量SIV長度。

1.4 數據處理與分析

使用GraphPad Prism 6.01軟件進行數據統(tǒng)計與分析，結果以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析檢驗進行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同來源磷脂對斑馬魚ISV生成的影響

由圖1可見，與空白對照組相比，模型組的斑馬魚ISV長度顯著降低（＜0.000 1），表明PTK787顯著抑制了斑馬魚的血管生成，模型制備成功。各劑量的大豆、蛋黃、南美白對蝦蝦頭的磷脂提取物對ISV損傷的斑馬魚有明顯的修復作用，南美白對蝦蝦頭磷脂提取物的活性最強且存在濃度依賴性。與模型組相比，各劑量的卵磷脂絡合碘片以及多烯磷脂酰胺膽堿膠囊均可顯著促進斑馬魚ISV的生長，且促進作用隨著質量濃度的增加而增強。但大豆磷脂軟膠囊以及魚油軟膠囊對斑馬魚ISV生成無顯著促進作用，可能是因為這兩種試樣中磷脂的含量較低。

圖1 不同來源磷脂對斑馬魚ISV生成的影響Fig. 1 Effect of phospholipids from different sources on ISV formation of zebrafish

2.2 不同來源磷脂對斑馬魚SIV生成的影響

由圖2可知，與空白對照組相比，大豆、蛋黃、南美白對蝦蝦頭磷脂提取物各劑量組均表現(xiàn)出一定的促進SIV生成作用，且大豆磷脂和南美白對蝦蝦頭磷脂提取物的活性強于其他各磷脂樣品。所選4 種磷脂類市售產品對斑馬魚SIV均有不同程度的促進生長作用。多烯磷脂酰胺膽堿膠囊的促SIV生成作用存在一定的濃度依賴性，隨著質量濃度的增加，促SIV生成作用明顯增強，其余3 種市售產品均在中質量濃度（40 μg/mL）下促進SIV生成作用最強。

圖2 不同來源磷脂對斑馬魚SIV生成的影響Fig. 2 Effect of phospholipids from different sources on SIV formation of zebrafish

2.3 不同類型磷脂對斑馬魚ISV生成的影響

由圖3可知，與空白對照組相比，模型組的斑馬魚ISV長度顯著降低（＜0.000 1），表明PTK787顯著抑制了斑馬魚的血管生成，模型制備成功。同時，PE、PC、PS以及高質量濃度（80 μg/mL）的SM與模型組相比表現(xiàn)出明顯的促ISV生成作用。其中PE、PC的促血管生成活性表現(xiàn)出相反的劑量-效應關系。在實驗質量濃度范圍內，隨著PE質量濃度增加，ISV生成促進作用逐漸減弱，相反，PC在實驗質量濃度范圍內，隨著給藥質量濃度的增加，ISV生成促進作用逐漸增強。PS在各實驗質量濃度下，ISV生成促進作用相差不大。而PI在本研究的給藥質量濃度下對ISV生成沒有促進作用。

圖3 不同類型磷脂對斑馬魚ISV生成的影響Fig. 3 Effects of different types of phospholipids on the formation of ISV in zebrafish

2.4 不同類型磷脂對斑馬魚SIV生成的影響

由圖4可知，與空白對照組相比，5 種磷脂標準品均表現(xiàn)出不同程度的血管生成促進作用。其中PS、SM存在一定濃度依賴性，隨著PS、SM標準品質量濃度增大，對SIV生成的促進作用增強。與其他標準品相比，PI的SIV生成促進作用較為明顯，這與2.3節(jié)中PI對ISV生成活性的影響結果有所不同。而對于PE，僅在高質量濃度（80 μg/mL）時表現(xiàn)出對SIV生成的促進作用。

圖4 不同類型磷脂對斑馬魚SIV生成的影響Fig. 4 Effects of different types of phospholipids on the formation of SIV in zebrafish

3 討 論

近幾年，斑馬魚在癲癇、肝損傷、腎損傷、糖尿病等臨床疾病中成功建立模型并被越來越多的學者應用，成為繼小鼠后的第二優(yōu)勢實驗動物。磷脂在臨床疾病治療、食品加工、化工等方面應用廣泛，但相對于市場上主要的大豆磷脂和蛋黃磷脂產品，海產動物來源磷脂的應用研究還較少。本研究采用斑馬魚為模式動物，對來源于大豆、蛋黃和南美白對蝦蝦頭的磷脂以及市售磷脂產品和標準品進行系統(tǒng)的促血管生成活性評價和比較。

前期本團隊采用UPLC-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜方法對大豆、蛋黃和南美白對蝦蝦頭3 種原料進行了脂質組學研究，并基于斑馬魚模型評估3 種原料脂質的抗炎、抗氧化和抗血栓等活性；研究表明，蝦頭脂質結構種類最多，高達1 764 種，且主要脂質類型是磷脂，大豆和蛋黃中主要脂質是甘油脂。3 種原料來源的脂質均表現(xiàn)出較強的抗氧化和抗炎活性，蝦頭和大豆脂質組有明顯的抗血栓活性。本實驗分別采用有機溶劑提取方法從上述3 種原料中制備磷脂提取物，經鉬藍比色法測定磷脂質量分數，發(fā)現(xiàn)蛋黃和蝦頭提取物中的磷脂質量分數明顯高于大豆；基于斑馬魚模型進行促血管生成活性研究發(fā)現(xiàn)3 種提取物在一定質量濃度條件下對斑馬魚ISV和SIV均具有較明顯的促血管生成活性，相對而言，南美白對蝦蝦頭磷脂促進ISV生成的活性更強，這與前期研究中蝦頭磷脂在抗氧化、抗炎和抗血栓活性方面的表現(xiàn)相似，可能是與海洋磷脂中含有豐富的多不飽和脂肪酸側鏈有關。同時本實驗還探討了不同質量濃度下4 種磷脂類產品對斑馬魚的促血管生成活性，發(fā)現(xiàn)在一定質量濃度條件下4 種磷脂類產品均具有促進SIV血管生成的活性，而在促ISV生成活性方面，僅有卵磷脂絡合碘片和多烯磷脂酰胺膽堿膠囊具有顯著的活性，這可能是另外兩種磷脂類保健產品大豆磷脂軟膠囊和魚油軟膠囊中磷脂含量較低，因此，有必要進一步開發(fā)高純度的磷脂類產品以確保其更好的功效。對于5 種磷脂標準品，均在不同程度上表現(xiàn)出一定的血管生成促進作用。以ISV生成情況作為評價指標，PE、PC、PS以及高質量濃度（80 μg/mL）的SM表現(xiàn)出明顯的促血管生成作用，以SIV血管生成情況作為評價指標，在一定質量濃度條件下所有磷脂標準品均表現(xiàn)出較明顯的血管生成促進作用，表明對海洋來源磷脂進一步分離純化以獲得磷脂亞類，可能是對海洋磷脂資源精細化開發(fā)利用的一個方向。

由前期脂質組學分析以及本次活性實驗結果可知，南美白對蝦蝦頭中的磷脂含量最高，且促進血管生成活性最強。由此可見蝦頭磷脂在開發(fā)新型促血管生成藥物方面具有巨大潛力。大豆、蛋黃等脂肪酸側鏈組成相對簡單，且不飽和程度較低，而海產動物來源的磷脂因側鏈中富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等豐富的-3多不飽和脂肪酸，在生理功能和生物活性方面具有特有的優(yōu)勢，但其產品化還很少，目前國際市場上能見到的主要是南極磷蝦油類的保健產品，因此對于海產動物來源的磷脂開發(fā)利用前景廣闊，也已引起很多研究者的關注。另外，以海產品加工副產物為原料開發(fā)和利用海洋磷脂不僅可以為人類提供更加優(yōu)質的磷脂產品，還可以減少海洋資源浪費以及環(huán)境污染，增加海洋產品的附加值。

4 結 論

本研究結果顯示，不同質量濃度的磷脂提取物、市售產品以及磷脂標準品對斑馬魚均具有一定的促血管生成活性，其中，南美白對蝦蝦頭磷脂的活性強于另外兩種陸地來源（大豆、蛋黃）的磷脂，推測是由于海洋磷脂因分子結構的特殊性使其生物活性具有一定的優(yōu)勢。本研究可為利用不同來源和種類磷脂開發(fā)促血管生成藥物、保健品等提供借鑒，為缺血性疾病藥物研發(fā)提供理論依據。