李永光，張棟棟，張曉菊，葛婷婷，王丹丹，寇新蕾，何 健，李莉莉

(1.甘肅省定西市臨洮農(nóng)業(yè)學(xué)校，甘肅 臨洮 730500；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，甘肅 臨洮 730500；3.臨洮縣洮陽鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 甘肅 臨洮 730500))

1885 年，大腸桿菌首次被德國科學(xué)家Theodor Escherich 在健康人的糞便中發(fā)現(xiàn)和分離。該菌為中等大小的腸桿菌，大小為1～3 μm×0.5～0.7 μm，單個或成雙，無芽孢，大多數(shù)具有周身鞭毛，能運(yùn)動，革蘭氏染色陰性，需氧或兼性厭氧。大腸桿菌對營養(yǎng)的要求不高，適應(yīng)性強(qiáng)，最適生長溫度為37 ℃，最適pH 為7.2～7.4。大腸桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂上生長良好，菌落形態(tài)為光滑、濕潤、半透明、2～3 mm 的灰白色菌落，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成紅色菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上形成黑色帶金屬光澤菌落[1]。

大腸桿菌廣泛存在于動物的飼養(yǎng)舍、活動場所、動物體表等地方，以及飼料、飲水和動物糞便中，如在1 g 動物糞便中約含有106個大腸肝菌。大腸桿菌為條件性致病菌，當(dāng)人和動物機(jī)體在應(yīng)激條件下或抵抗力減弱時，可導(dǎo)致胃腸道等多種器官出現(xiàn)病變，出現(xiàn)腸胃炎、腹痛、發(fā)熱、腹瀉等臨床表現(xiàn)。在畜牧業(yè)的飼養(yǎng)生產(chǎn)中，大腸桿菌對動物(尤其是豬和雞)的健康危害較大，每年由大腸桿菌引發(fā)的動物疾病(如禽大腸桿菌病、仔豬黃痢、仔豬白痢、斷奶仔豬腹瀉等)，給畜牧生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過將禽源性大腸桿菌經(jīng)腹腔接種小白鼠，3 d 后觀察小白鼠的臨床癥狀，隨后剖檢觀察組織器官的變化，旨在觀察禽源性大腸桿菌病的病理變化，為家禽大腸桿菌病的剖檢診斷做好準(zhǔn)備。與此同時，設(shè)計(jì)禽源性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)，探究多種抗生素對禽源性大腸桿菌的敏感性，為臨床家禽大腸桿菌病治療藥物的選擇做好理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物和禽源性大腸桿菌

試驗(yàn)用小白鼠購買于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，禽源性大腸桿菌菌種由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 藥物

試驗(yàn)所用的多西環(huán)素(DO30)、多粘菌素(PB300)、磺胺甲噁唑(SX25)、新霉素(N30)、羧芐西林(CB100)、萬古霉素(YA30)均為從市場上正規(guī)商店購買的藥品。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.1.1 LB 液體培養(yǎng)基

用電子天平稱取胰蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、氯化鈉1 g，將它們放入200 mL 的錐形瓶中，再加蒸餾水至100 mL，用pH 計(jì)調(diào)節(jié)將液體的pH 調(diào)至7.2，隨后用高壓蒸汽滅菌器滅菌后備用。

1.1.1.2 LB 固體平板培養(yǎng)基

用電子天平稱取瓊脂粉1.5 g，加入至100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，高壓蒸汽滅菌器高壓滅菌，滅菌后置于超凈工作臺中，待溫度降至50～60 ℃時，倒置溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)固體平板培養(yǎng)基，冷卻后置于4 ℃冰箱備用。

1.1.1.3 伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基

用電子天平稱稱伊紅美蘭瓊脂5 g，隨后放入200 mL 的錐形瓶中，加蒸餾水至100 mL，經(jīng)高壓蒸汽滅菌器高壓滅菌，滅菌后置于超凈工作臺中，待溫度降至50～60 ℃時，倒置伊紅美蘭瓊脂平板，冷卻后置于4 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的培養(yǎng)

1.2.1.1 大腸桿菌接種

在超凈工作臺中將禽源性大腸桿菌菌種接種于LB 培養(yǎng)基。

1.2.1.2 大腸桿菌培養(yǎng)

將接種了禽源性大腸桿菌菌種的LB 培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。檢測菌懸液濃度為7.2×108CFU/mL。

1.2.2 小白鼠的接種與剖解

取10 只小白鼠，每只灌服過夜培養(yǎng)的禽源性大腸桿菌菌液0.5 mL，接種后置于動物房單獨(dú)飼養(yǎng)，并觀察它們的死亡情況和臨床變化。3 d 后，對未死亡小白鼠進(jìn)行頸部脫臼致死，經(jīng)75%酒精浸泡消毒后，然后固定于小動物剖檢臺上，在酒精燈火焰10 cm 范圍內(nèi)剖檢，眼科鑷子輕輕提起小白鼠腹壁，眼科剪剪開腹壁，觀察腹壁下是否出血。然后打開腹腔，逐個觀察腹腔內(nèi)肝臟、胃、腸、脾臟等器官的病理變化。打開胸腔，觀察胸腔內(nèi)肺臟和心臟的病理變化。

1.2.3 大腸桿菌鑒定

眼科剪刀經(jīng)灼燒消毒，消毒小白鼠肝臟病變部位表面，剪開病變部位，酒精燈火焰灼燒接種環(huán)，蘸取病變部位劃線接種于伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，鑒定病原是否為大腸桿菌。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

提前30 min 取出LB 固體平板培養(yǎng)基置于超凈工作臺內(nèi)，吸取1 mL 禽源性大腸桿菌菌液，用涂布棒將菌液均勻涂布于LB 固體平板培養(yǎng)基上，將多西環(huán)素(DO30)、多粘菌素(PB300)、磺胺甲噁唑(SX25)、新霉素(N30)、羧芐西林(CB100)、萬古霉素(YA30)等藥敏片均勻貼置于平板內(nèi)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，觀察各種抗菌藥對大腸桿菌的抑殺作用，為大腸桿菌病的治療選藥做參考。

2 研究結(jié)果

2.1 小白鼠感染禽源性大腸桿菌后病變

2.1.1 外觀變化

在10 只接種禽源性大腸桿菌菌液的實(shí)驗(yàn)小白鼠中，死亡6 只，死亡率達(dá)60%；剩余4 只精神萎靡，被毛粗亂，食欲下降，個別眼瞼粘連。

2.1.2 病理剖檢變化

剖檢發(fā)現(xiàn)，大部分小白鼠的肝臟腫大，肝臟表面有點(diǎn)狀或斑塊狀出血；個別小白鼠胃部膨大，充滿內(nèi)容物；十二指腸水腫，腸壁變薄，腸內(nèi)充滿淡黃色的內(nèi)容物。脾臟充血腫大，邊緣呈暗紫色；腎臟略腫大，顏色變深；心臟、肺臟等其他臟器未見明顯異常。小白鼠病變主要在肝臟和小腸，臨床上動物感染大腸桿菌病后主要表現(xiàn)為腹瀉等腸道炎癥(圖1)。

2.2 大腸桿菌感染驗(yàn)證結(jié)果

用接種環(huán)挑取感染小白鼠病變部位，用劃線方式接種于伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h 后，生長出黑色帶金屬光澤的圓形菌落，證明小白鼠病變部位的病原菌為大腸桿菌，根據(jù)科赫法則可以推斷小白鼠的病變是由大腸桿菌導(dǎo)致的(圖2)。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)多西環(huán)素(DO30)、多粘菌素(PB300)、磺胺甲噁唑(SX25)、新霉素(N30)、羧芐西林(CB100)、萬古霉素(YA30)等藥敏片對涂布于LB 固體平板培養(yǎng)基上的禽源性大腸桿菌的抑菌圈直徑大小，判斷出禽源性大腸桿菌對多種抗菌藥的敏感程度，為臨床上家禽大腸桿菌病選取高效的治療藥物(圖3、表1)。

新霉素(N30)對禽源性大腸桿菌的抑菌圈直徑為21 mm，大于20 mm；多粘菌素對禽源性大腸桿菌的抑菌圈直徑為15 mm，大于9 mm，按照藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，判定出禽源性大腸桿菌對此兩種抗菌藥物超級敏感，臨床上可以選用新霉素和多粘菌素治療禽源性大腸桿菌引起的動物疾病，理論上會有較好的治療效果。其他4 種抗菌藥的抑菌圈直徑為均為0，證明這4種抗菌藥對禽源性大腸桿菌無任何抑制和殺滅效果，臨床上不能用來治療禽源性大腸桿菌引起的疾病。

3 結(jié)論與討論

對大腸桿菌的不同分離株采用不同接種途徑，被感染小白鼠會表現(xiàn)出不同的臨床癥狀和死亡率。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射接種途徑，給10只小白鼠接種甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的禽源性大腸桿菌，結(jié)果死亡率高達(dá)60%，存活小白鼠表現(xiàn)為精神萎靡，出現(xiàn)較嚴(yán)重的癥狀；李基棕等[2]研究發(fā)現(xiàn)，豬場環(huán)境中的大腸桿菌對小白鼠的致死率高達(dá)51.3%，其中污水和空氣中的大腸桿菌菌株對小白鼠的致死率最高達(dá)66.7%；陳亢川等[3]對從人體和動物體中分離到的7 株O157 大腸桿菌在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行大量培養(yǎng)，隨后采用腹腔接種的方式感染小白鼠，結(jié)果接種的小白鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀；海巖等[4]用從患有乳房炎的奶牛中分離到的大腸桿菌經(jīng)腹腔接種小白鼠，致死率為81.8%；趙素微等[5]用從乳腺炎患病牛中分離的大腸桿菌菌株經(jīng)腹腔接種小白鼠，致病率高達(dá)90%；但是在文獻(xiàn)報(bào)道中，Isogai 等將腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC) O157:H7-EDL 931 株和7 號株經(jīng)口腔灌服IQI 小鼠，剖檢發(fā)現(xiàn)胃腸道無組織學(xué)病變[6]。

在藥敏試驗(yàn)中，對大腸桿菌具有較好抑殺作用的藥物包括新霉素和多粘菌素。新霉素對大腸埃希菌以及克雷伯菌屬、變形桿菌屬、腸桿菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、布魯菌屬等革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的殺傷效果，殺菌原理是其能夠結(jié)合細(xì)菌核糖體30 S 亞單位，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。但是，革蘭氏陰性菌與新霉素接觸后極易產(chǎn)生耐藥性，從而使后者失去殺菌作用，臨床上可采用交替用藥和聯(lián)合用藥的方式使用新霉素與慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素等氨基糖苷類抗生素，以減少或延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。多黏菌素為多肽類抗生素，由多黏類芽孢桿菌產(chǎn)生，臨床上對大腸桿菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性菌所致感染有較好治療效果。

本試驗(yàn)初步建立了禽源性大腸桿菌感染小白鼠模型，通過藥敏試驗(yàn)找到了大腸桿菌敏感藥物，為臨床大腸桿菌性疾病的診斷、治療和防制提供理論支持。