羅 渟， 賈 雯， 高 峰， 王 靜

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 內(nèi)窺鏡科，遼寧 沈陽 110013

胃癌是癌癥相關死亡的第三大常見原因，診斷晚，病死率高[1]。Notch1屬于Notch受體家族，是多細胞生物固有的一種進化保守的信號通路，在胚胎發(fā)生和組織穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用[2-3]。有研究表明，Notch1在胃癌的發(fā)展中起重要作用[4]。Wnt蛋白是一種分泌型生長因子，在多細胞動物的胚胎發(fā)育和成年組織穩(wěn)態(tài)期間調(diào)節(jié)干細胞和祖細胞的增殖、分化[5-6]。有研究表明，高水平的非對稱性二甲基精氨酸可正向調(diào)控胃癌中β-catenin的表達，并通過Wnt/β-catenin通路促進胃癌遷移、侵襲[7]。Wnt3的上調(diào)通過誘導癌細胞增殖、遷移、侵襲和抑制凋亡在胃癌發(fā)生中起重要作用，Wnt3可能是胃癌治療的有利突破點[8]。本研究旨在探討胃癌組織中Notch1、Wnt3的表達情況及臨床意義?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2015—2020年北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的36例胃腺癌患者為研究對象。其中，女性10例，男性26例；年齡32～88歲，中位年齡63歲。術中取36例患者的胃癌組織及26例患者的癌旁正常組織，離體后經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋，-80℃冷凍備用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 組織芯片制作 由一名經(jīng)驗豐富的病理專家挑選典型的癌與癌旁組織蠟塊，觀察并根據(jù)切片確定具有代表性的病變部位，加以標記制作空白蠟塊，應用組織微陣列儀在蠟塊中打孔(孔徑1 mm，長4 mm)，然后在選取的蠟塊中穿取標記組織直徑，準確放入空白蠟塊的小孔中按照順序依次操作，直至所有組織標本種植于空白蠟塊中，最后石蠟切片，低溫保存。

1.3 免疫組化

1.3.1 主要試劑 兔抗人Notch1單克隆抗體(北京中杉生物技術有限公司)，兔抗人Wnt3單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，濃度均為1∶100；SP兩步法免疫組織化學檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；蘇木精(北京中杉生物技術有限公司)。

1.3.2 實驗方法 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗液沖洗3次，每次3 min。用濃度為0.3%的過氧化氫溶液在室溫條件下抑制內(nèi)源性過氧化物20 min，再以PBS洗液沖洗3次，每次3 min。分別選取Notch1、Wnt3的對應多克隆抗體，工作濃度為1∶100，在37℃條件下培育1 h，再用PBS洗液沖洗3次，每次3 min。再以實驗配套試劑在37℃條件下培育30 min，清洗3次，使用DAB顯色10 min，然后以蘇木素襯染，熱水藍化。吹干后，以樹脂進行封片處理，最后在鏡下觀察。用已知標準的Notch1和Wnt3表達陽性的正常胃組織標本作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，顯微鏡下觀察。

1.4 結果判定 根據(jù)半定量標準：取染色良好切片，顯微鏡100倍視野下隨機選取10個視野。染色結果取染色強度(0：無染色，1：輕度，2：中度，3：高度)和染色范圍(0為1%～10%；1為10%～25%；2為25%～50%；3為50%～75%；4為>75%)乘積，按0～12分為4個等級，0得0分，1～4得1分，5～8得2分，9～12得3分[9]。兩項評分乘積≥3為陽性表達，乘積<3為陰性表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。相關性分析采用Spearman等級相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與正常組織Notch1、Wnt3表達 胃癌組織中Notch1陽性率為33.3%(12/36)，低于正常組織的76.9%(20/26)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。胃癌組織中Wnt3陽性率為83.3%(30/36)，高于正常組織的46.1%(12/26)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 胃癌組織Notch1、Wnt3表達與臨床病理參數(shù)相關性 Notch1、Wnt3表達與胃癌患者的性別、年齡、TNM分期、有無淋巴結轉(zhuǎn)移均無相關性(P>0.05)。Notch1、Wnt3表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、有無脈管浸潤均有相關性(P<0.05)。見表1。

表1 Notch1、Wnt3表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關系

2.3 Notch1、Wnt3在胃癌組織中表達相關性 Notch1和Wnt3共同陽性者7例，共同陰性者1例，Notch1陽性而Wnt3陰性者5例，Notch1陰性而Wnt3陽性者23例。Spearman相關性分析顯示，在胃癌組織中，Notch1和Wnt3表達呈負相關(r=-0.474，P<0.05)。

3 討論

Notch1是Notch家族成員之一，與乳腺癌[10]、白血病[15]、膠質(zhì)瘤[12]、口腔鱗狀細胞癌[13]等多種癌癥有關。一項薈萃分析中的分層分析顯示，Notch1表達升高與腫瘤部位、大小、類型、淋巴血管侵襲和遠端轉(zhuǎn)移有關[4]。Notch1信號通路是進化保守的細胞相互作用的一種機制，參與胚胎發(fā)育和正常細胞的增殖、分化、生存和凋亡等過程[14]。Notch1在胃癌組織中表達升高，并與胃癌淋巴結轉(zhuǎn)移相關，在胃癌細胞系中敲除Notch1可以減弱腫瘤細胞的增殖、遷移并阻滯細胞周期[15-16]。有研究表明，Notch信號通路是維持胃竇干細胞生長的必要因素，Notch1是調(diào)節(jié)小鼠和人胃上皮細胞穩(wěn)態(tài)的主要Notch受體之一[17]。緩慢激活胃干細胞的Notch通路可誘導細胞增生和組織肥大，提示Notch可能驅(qū)動胃癌的發(fā)生[18]。

本研究采用免疫組織化學染色方法檢測胃癌組織中Notch1的表達情況，發(fā)現(xiàn)Notch1在胃癌組織中的陽性表達率低于癌旁組織。有研究認為，Notch1在胃癌的發(fā)生中可能起抑制作用[19-20]。Ye等[21]研究表明，Notch1在不同的細胞中激活的下游信號轉(zhuǎn)導通路也不同，Notch1可能在胃癌中發(fā)揮抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3在胃癌中的陽性表達率高于癌旁組織，提示W(wǎng)nt3可能參與調(diào)控胃癌的浸潤、遷移。Wnt是作用于細胞增殖、凋亡、分化和遷移等多種過程的一種分泌型脂質(zhì)修飾糖蛋白家族[22]。Wnt3是轉(zhuǎn)化生長因子誘導的間充質(zhì)癌細胞分泌的促進上皮癌細胞侵襲并誘導繼發(fā)性EMT表型的關鍵因子，揭示了腫瘤異質(zhì)性的重要意義，以及腫瘤微環(huán)境中上皮和間質(zhì)轉(zhuǎn)化的癌細胞之間的相互作用，通過Wnt依賴的機制促進疾病轉(zhuǎn)移[23]。

相關性分析發(fā)現(xiàn)，Notch1與Wnt3在胃癌組織中表達呈負相關。從臨床病理角度分析，Notch1與Wnt3在高分化、不伴脈管浸潤、漿膜未侵犯的胃癌組織中分別高表達和低表達，提示Notch1、Wnt3的表達可能與胃癌患者的預后相關。但在不同組織中，Notch對細胞發(fā)生發(fā)展的作用有所不同，即使是在同一組織的腫瘤，因為發(fā)展階段的不同，Notch的作用也會發(fā)生變化[20]。本研究結果顯示，Notch1在胃癌發(fā)展中起抑制作用，而Wnt3則起促進作用，與既往多數(shù)研究結果存在差異，可能是Notch1作為腫瘤抑制基因還是致癌基因取決于癌癥的類型、階段和其他相關基因的突變。

綜上所述，Notch1在胃癌發(fā)展中可能起抑制作用，而Wnt3則起促進作用，Notch1與Wnt3的表達水平呈負相關。本研究存在不足，樣本量較小可能導致結果不準確，需要進一步擴大樣本深入研究。