劉耀川，龔商羽，關(guān) 淼，楊揚，申貫?zāi)?/p>

（1.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.錦州市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000）

大腸桿菌是存在于人和動物腸道內(nèi)的一種固有細(xì)菌，大多分布于大腸內(nèi)。絕大多數(shù)情況下，機體內(nèi)的大腸桿菌不表現(xiàn)出致病力，但當(dāng)機體處于外傷、感染等免疫力低下時，大腸桿菌則轉(zhuǎn)變?yōu)闂l件性致病菌。近年來隨著研究的不斷深入，又發(fā)現(xiàn)多種致病性大腸桿菌。因該菌分布廣泛且極易傳播，是公共安全的潛在威脅因素。豬感染致病性大腸桿菌后會引起仔豬腹瀉、敗血癥、腦膜炎等多種感染性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。目前獸醫(yī)對大腸桿菌感染通常使用抗生素治療，但隨著抗生素的不斷使用，大腸桿菌逐漸產(chǎn)生耐藥性，給臨床疾病治療造成困難。

本研究對遼寧沈陽某生豬養(yǎng)殖場開展大腸桿菌分離、鑒定，并對確定的大腸桿菌分離株進行了抗生素敏感性試驗。為該場由大腸桿菌引起的相關(guān)疾病治療方案提供技術(shù)支持，同時也為該場大腸桿菌防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品來源在沈陽市某生豬養(yǎng)殖場，選取腹瀉病豬100頭（其中仔豬50頭、育肥豬50頭）。采樣豬均與其他健康豬相同條件飼養(yǎng)、免疫，且均未進行藥物治療。

1.2 主要儀器立式蒸汽高壓滅菌器（泰田BT-27LD）、恒溫振蕩生化培養(yǎng)箱（華育HS-D60）、恒溫隔水式培養(yǎng)箱（天松-60KD）、無菌工作臺（SJ-3084S）、50μL、100μL、200μL微 量 移 液 器（ThermoFisher F3）、游標(biāo)卡尺等由遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.3 主要材料普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、普通固體營養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱瓊脂粉購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管購于杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物藥敏紙片（10種）購于杭州微生物試劑有限公司、大腸桿菌質(zhì)控菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25922）購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

2 方法

2.1 樣品采集對采樣豬進行恰當(dāng)保定后，對肛門部位按照碘酊-酒精-碘酊的順序進行消毒。用無菌棉拭子插入肛門對腸內(nèi)容物進行蘸取采樣。采樣結(jié)束后將棉拭子頭保存于的5mL離心管中。將標(biāo)記好的離心管置于4℃樣品冷藏保存盒中盡快送至實驗室。

2.2 培養(yǎng)基制備按產(chǎn)品說明說要求，用滅菌dd H2O配置相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基于高壓蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min。用5mL離心管分裝NB肉湯培養(yǎng)基，用90mm培養(yǎng)皿制作普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。將制作好的培養(yǎng)基放置于隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)12h，觀察培養(yǎng)基，無菌落生長、無渾濁的為檢菌合格。將檢菌合格的培養(yǎng)基置于4℃冰箱中保存待用。

2.3 大腸桿菌初步分離在潔凈工作臺中，用蕩混勻儀對盛放肛門棉拭子頭的離心管進行充分震動、混勻，取其中的生理鹽水混勻液100μL接種于檢菌合格的NB肉湯中。將NB肉湯放置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，180min轉(zhuǎn)培養(yǎng)12h。

取100μL擴增后的NB肉湯，在潔凈工作臺中用三角玻璃棒將其均勻涂布于檢菌合格的普通瓊脂培養(yǎng)基中，正置片刻待菌液完全吸收后倒置于37℃隔水恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。選取大小、形態(tài)、生長特性不同的單獨菌落，于NB肉湯中擴增。

取100μL單獨菌落培養(yǎng)NB肉湯，用同樣的方式涂布于檢菌合格的麥康凱瓊脂平皿中，過夜培養(yǎng)并記錄培養(yǎng)結(jié)果。

2.4 大腸桿菌生化反應(yīng)鑒定觀察培養(yǎng)后的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，選取其中具有金屬紅色光澤、圓形、獨立生長的單獨菌落。在潔凈工作臺中，按照生化反應(yīng)鑒定試劑盒套裝說明書要求，對其進行生化反應(yīng)鑒定。細(xì)菌接種于微量鑒定管后，用注射器加入液體石蠟封閉，并用封口膜封口，放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。

2.5 藥物敏感性測試將鑒定后的大腸桿菌分離株NB肉湯培養(yǎng)液100μL均勻涂布于檢菌合格的固體瓊脂平皿中，待菌液完全吸收后用鑷子將藥敏紙片均勻放置于平皿內(nèi)。藥敏紙片間應(yīng)預(yù)留出足夠距離，以便測量抑菌環(huán)直徑。將平皿放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，用游標(biāo)卡尺對抑菌環(huán)直徑進行測量。取3次測量結(jié)果的平均值為該藥物對病原菌分離株的抑菌直徑，并與參考值進行比較，評估病原分離株對藥物的敏感性。

3 結(jié)果

3.1 大腸桿菌初步分離結(jié)果100份棉拭子樣本，經(jīng)并病原菌NB肉湯擴增、普通瓊脂培養(yǎng)基單獨分離、麥康凱鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)，共得到大腸桿菌疑似分離株82株。其中在50份仔豬肛門棉拭子樣本中得到疑似分離株48株、在50份育肥豬肛門棉拭子樣本中得到疑似分離株34株。

3.2 大腸桿菌生化反應(yīng)鑒定結(jié)果82株疑似大腸桿菌分離株經(jīng)腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管反應(yīng)，并根據(jù)培養(yǎng)后的顏色反應(yīng)對其進行賦碼、比對，最終確定大腸桿菌分離株61株，大腸桿菌的總體分離率為61%（61/100）。其中仔豬病例樣本中得到大腸桿菌39株，育肥豬病例樣本中得到大腸桿菌22株，其分離率分別為78%（39/50）及44%（22/50）。

3.3 大腸桿菌分離株藥物敏感性結(jié)果對61株臨床分離的大腸桿菌分離株及1株質(zhì)控菌標(biāo)準(zhǔn)株進行藥敏紙片法測定其藥物敏感性，當(dāng)質(zhì)控菌抑菌環(huán)直徑在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)時，認(rèn)定實驗數(shù)據(jù)可信，記錄并統(tǒng)計分離株耐藥性情況。結(jié)果表明，61株臨床分離株對10種受試抗生素耐藥性由高至低分別為磺胺甲基異惡唑、阿奇霉素、紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、強力霉素、青霉素、頭孢曲松、氨芐青霉素及頭孢拉定，耐藥率（見表1）。

對不同樣本來源得到的大腸桿菌進行分析，其耐藥情況也不盡相同。在39株仔豬源大腸桿菌中，耐藥性由高到低分別為磺胺甲基異惡唑、阿奇霉素、頭孢曲松、紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、強力霉素、青霉素、氨芐青霉素及頭孢拉定，耐藥率（見表1）在22株育肥豬源大腸桿菌中，耐藥性由高到低分別為磺胺甲基異惡唑、紅霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、青霉素、復(fù)方新諾明、強力霉素、氨芐青霉素、頭孢拉定及頭孢曲松，耐藥率分離株對10種受試藥物敏感性測試結(jié)果（見表1）及（圖1）。

圖1 大腸桿菌藥物敏感性試驗結(jié)果

表1 大腸桿菌藥物敏感性試驗結(jié)果

4 討論

近年來發(fā)現(xiàn)多種致病性大腸桿菌如腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAggEC）及腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）等，不僅對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，也威脅人類健康。該病病原廣泛、發(fā)病率高、癥狀復(fù)雜且極易造成病豬死亡，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。目前抗生素仍是最主要的治療手段，但長期使用產(chǎn)生的耐藥性，給疾病治療造成很大困難。如王旭等報道，在四川地區(qū)仔豬黃痢病例中分離到的大腸桿菌，其對頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、卡那霉素、慶大霉素、哌拉西林、羧芐西林、丁胺卡那霉素、氯霉素、米諾環(huán)素等19種藥物敏感；對多西環(huán)素、克林霉素、多粘菌素、新霉素中度敏感；對青霉素、氨芐西林、苯唑西林、紅霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、萬古霉素耐藥。李沛麗等報道，貴州地區(qū)11個規(guī)模豬場中，大腸桿菌對慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素敏感；對氨芐西林、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氧氟沙星、多西環(huán)素、金霉素中度敏感；對奧格門丁、頭孢他啶、頭孢噻呋、亞胺培南、粘菌素耐藥。黃顯曄等對黑龍江某豬場仔豬腹瀉病例研究發(fā)現(xiàn)，分離到的大腸桿菌對頭孢噻呋、頭孢曲松敏感；對恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素耐藥。于新友等對山東濱州地區(qū)仔豬腹瀉病例研究發(fā)現(xiàn)，分離到的大腸桿菌對頭孢噻呋、恩諾沙星、復(fù)方新諾明和阿莫西林高度敏感；對青霉素G、氟苯尼考、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、阿米卡星表現(xiàn)出不同程度的耐藥。丁建華等對安徽、江蘇、山東、河北、廣西等地分離到的大腸桿菌進行研究發(fā)現(xiàn)，94.4%的分離株耐受至少3種以上抗菌藥物，對青霉素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、甲氧芐氨嘧啶、阿莫西林、氨芐西林、四環(huán)素、頭孢氨芐、卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、頭孢曲松的耐藥率均在70%以上；對多粘菌素B和多粘菌素E較為敏感。孫起榮的報答，安徽地區(qū)豬源大腸桿菌對青霉素、甲氧芐氨嘧啶、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、氨芐西林、阿莫西林高度耐藥。谷振等報道，豫西地區(qū)豬源大腸桿菌對硫酸粘菌素、阿米卡星、恩諾沙星高度敏感；對頭孢噻呋中度敏感。孫偉等報道，銅仁地區(qū)豬源大腸桿菌對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磺胺嘧啶、慶大霉素耐藥性較高。劉雪松等報道，齊齊哈爾周邊仔豬腹瀉大腸桿菌對頭孢曲松、環(huán)丙沙星及阿奇霉素敏感性較強。

與文獻報道數(shù)據(jù)比較，本次在沈陽地區(qū)豬腹瀉病例中分離到的大腸桿菌對磺胺類藥物耐藥性最高，對頭孢菌素類藥物相對較為敏感?？赡芘c地區(qū)差異、用藥習(xí)慣、藥物選擇差異等因素有關(guān)，建議該飼養(yǎng)場根據(jù)病原鑒定及藥物敏感性試驗結(jié)果制定針對性治療方案。