蔣海生，張曉云

（1.河北征宇制藥有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省獸用免疫增強(qiáng)劑產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 石家莊 051430；3.河北省動(dòng)物專用免疫增強(qiáng)劑技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 051430）

中醫(yī)有云：“正氣內(nèi)存，邪不可干?！彼^正氣就是機(jī)體的免疫力，當(dāng)免疫力低下時(shí)，免疫系統(tǒng)無法及時(shí)消除衰老和受損細(xì)胞以及致病微生物，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。提高免疫力低下者的免疫功能對(duì)維持機(jī)體的健康和對(duì)抗疾病非常重要。

莫力健主要成分包括多種維生素以及可飼用天然植物提取物等，專門用于提高動(dòng)物機(jī)體黏膜免疫力，修復(fù)受損黏膜，維護(hù)黏膜完整性，促進(jìn)黏膜蛋白合分泌，降低機(jī)體發(fā)病率。

高免多糖是一種復(fù)合植物多糖免疫增強(qiáng)劑，臨床上主要用于增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、發(fā)揮免疫佐劑作用、輔助治療病毒病、降低應(yīng)激反應(yīng)。張洪德等研究發(fā)現(xiàn)，高免多糖有提高雛雞法氏囊指數(shù)的作用，并且能在提高抗體水平的基礎(chǔ)上提高整齊度。褚秀玲等研究發(fā)現(xiàn)，高免多糖可以明顯改善番鴨的生長(zhǎng)性能，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育；可以提高特異性免疫抗體水平，促進(jìn)白細(xì)胞介素-2（IL-2）和γ干擾素（IFN-γ）等細(xì)胞因子的分泌。劉學(xué)彬等研究表明，高免多糖能提高母豬的免疫水平，提高豬瘟抗體效價(jià)、血清IFN-γ和IL-2水平；增加母豬所產(chǎn)仔豬的平均斷奶頭數(shù)、提高斷奶成活率和斷奶均重，還能減少仔豬腹瀉的發(fā)生。說明在母豬飲水及日糧中添加高免多糖能提高母豬的生產(chǎn)性能和免疫機(jī)能，間接改善哺乳仔豬的生長(zhǎng)性能和健康狀況。

基于上述理論基礎(chǔ)，本研究通過小鼠免疫功能低下模型，探討莫高組合對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用及作用機(jī)制，旨在為莫高組合的臨床應(yīng)用提供合理的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，6～8周齡，購(gòu)自河北伊維沃生物科技有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2020-002）。

1.2 藥物與試劑莫力健、高免多糖均由河北征宇制藥有限公司提供；環(huán)磷酰胺（756240-1G，購(gòu)自北京華邁生物科技有限責(zé)任公司）；小鼠溶菌酶（LZM）試劑盒（購(gòu)自南京建成生物工程研究所）。

1.3 主要儀器AUW120D電子分析天平，上海島津儀器有限公司；DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；Centrifuge 5810 R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；101-2EBS電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；SP-756P紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；Infinite F50酶標(biāo)儀，奧地利Tecan有限公司；微量移液器，北京大龍。

2 方法

2.1 試驗(yàn)分組、造模和給藥將80只小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、模型組、莫高0.5g/kg、1g/kg、1.5g/kg、2g/kg、2.5g/kg、3g/kg六 個(gè)不同劑量組。適應(yīng)性飼養(yǎng)10d后，除正常對(duì)照組外其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺（80mg/kg）制造免疫力低下模型，1次/d，連續(xù)3d，第6天同劑量加強(qiáng)一次；正常對(duì)照組動(dòng)物注射等體積生理鹽水。造模成功后各組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥10d。

2.2 一般狀態(tài)觀察每日觀察小鼠精神狀態(tài)，活動(dòng)、采食、飲水情況，毛發(fā)光滑度等。

2.3 體質(zhì)量變化率的測(cè)定

2.4 溶菌酶活性測(cè)定末次給藥后正常飲水，禁食12h后將所有組小鼠稱重，眼眶靜脈采血。采集的血液置于37℃恒溫箱中保溫30min，然后置于4℃冰箱中過夜，5000rpm離心10min，用微量移液器分離血清，-20℃保存，備用。采用溶菌酶試劑盒測(cè)定溶菌酶含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.5 免疫器官指數(shù)測(cè)定采完血之后，小鼠斷頸處死，取其脾臟、胸腺，用濾紙吸去多余的血液，在電子天平上稱其重量，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算免疫器官指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS 26.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Duncan法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 莫高組合對(duì)免疫功能低下小鼠一般狀態(tài)的影響連用環(huán)磷酰胺3d后，除正常對(duì)照組（見圖1）外，其余各組小鼠均表現(xiàn)出毛色無光，精神不振，雙目無神，閉眼昏睡（見圖2），喜歡蜷縮在一旁，活動(dòng)減少，對(duì)外界環(huán)境的動(dòng)靜反應(yīng)比較遲鈍，小鼠采食量、飲水逐漸減少，體質(zhì)量明顯下降，表明免疫力低下模型造模成功。經(jīng)莫高組給藥治療后，各給藥組小鼠（見圖3）精神狀態(tài)逐漸改善、活動(dòng)量增加，采食量、飲水、體質(zhì)量均有不同程度的提高。

圖1 正常對(duì)照組

圖2 免疫低下模型組

圖3 給藥治療組

3.2 莫高組合對(duì)免疫功能低下小鼠采食量、體質(zhì)量變化率的影響結(jié)果如表1所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠采食量減少（P＞0.05），體質(zhì)量變化率顯著下降（P＜0.05）。與模型組相比，各個(gè)劑量莫高給藥組采食量、體質(zhì)量變化率均有所增加（P＞0.05），并且在0.5g/kg劑量時(shí)均顯著升高（P＜0.05）。

表1 莫高組合對(duì)免疫低下小鼠采食量、體質(zhì)量的影響（n=10）

3.3 莫高組合對(duì)免疫功能低下小鼠溶菌酶活性的影響結(jié)果（見表2），與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清溶菌酶活性顯著下降（P＜0.05）。與模型組比較，各個(gè)劑量莫高組小鼠血清溶菌酶活性均顯著提高（P＜0.05），其中0.5g/kg莫高組作用效果最好。

表2 莫高組合對(duì)免疫低下小鼠溶菌酶活性的影響（n=10）

3.4 莫高組合對(duì)免疫功能低下小鼠免疫器官指數(shù)的影響結(jié)果（見表3），與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，各劑量莫高組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均有不同程度的提高，其中0.5g/kg莫高組作用效果最好（P＜0.05）。

表3 莫高組合對(duì)免疫低下小鼠免疫器官指數(shù)的影響（n=10）

4 討論

4.1 莫高組合對(duì)免疫功能低下小鼠一般狀態(tài)、采食量、體質(zhì)量變化率的影響環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）在藥理學(xué)等研究領(lǐng)域中常用于制造免疫功能低下或免疫功能抑制狀態(tài)的動(dòng)物模型，在臨床應(yīng)用中已經(jīng)非常成熟?？祷哿盏妊芯拷Y(jié)果表明，高劑量（80mg/kg）CTX通過抑制DNA的復(fù)制、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低T、B細(xì)胞增殖指數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬功能，從而降低免疫細(xì)胞功能，使機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺（80mg/kg）腹腔注射造模，制備小鼠免疫功能力低下模型。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠均表現(xiàn)出毛色無光，精神不振，雙目無神，閉眼昏睡，喜歡蜷縮在一旁，活動(dòng)減少，對(duì)外界環(huán)境的動(dòng)靜反應(yīng)比較遲鈍，采食量、飲水逐漸減少，體質(zhì)量明顯下降，這與高敏、魏琳等人用環(huán)磷酰胺制備小鼠免疫力低下模型相一致。經(jīng)莫高組給藥治療后，各給藥組小鼠精神狀態(tài)逐漸改善、活動(dòng)量增加，以及采食量、飲水、體質(zhì)量均有不同程的提高。由此說明莫高組合對(duì)由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致免疫功能低下的小鼠具有很好的免疫保護(hù)作用，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4.2 莫高組合對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶菌酶活性的影響巨噬細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體自然抵抗力和非特異性免疫的一個(gè)重要組成部分，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和體液免疫中都發(fā)揮著重要作用，血清溶菌酶水平是評(píng)估機(jī)體非特異性免疫功能強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)。溶菌酶是單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物，主要由單核細(xì)胞-吞噬細(xì)胞釋放到血清中。作為一種存在于動(dòng)物正常體液和組織中的非特異性免疫物質(zhì)，溶菌酶具有多種藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、激活補(bǔ)體和促進(jìn)吞噬作用。

本試驗(yàn)研究表明，與模型組相比，0.5～3g/kg劑量莫高組均可顯著提高免疫功能低下小鼠血清溶菌酶含量，增強(qiáng)非特異性免疫功能，其中0.5g/kg劑量莫高組作用效果最明顯。同時(shí)，小鼠血清溶菌酶活性的提高表明莫高組合可能激活血液中吞噬細(xì)胞的活性。激活的吞噬細(xì)胞可以分泌一些酶類（溶酶體水解酶、溶細(xì)胞酶）、TNF、NO等活性分子，這些活性物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞和致病細(xì)胞有強(qiáng)大的殺傷力，提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)機(jī)體的免疫保護(hù)機(jī)制，進(jìn)而從機(jī)體免疫系統(tǒng)的多個(gè)層次調(diào)節(jié)免疫功能。關(guān)于莫高組合提高小鼠血清溶菌酶活性，增強(qiáng)非特異性免疫功能的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4.3 莫高組合對(duì)免疫功能低下小鼠免疫器官指數(shù)的影響免疫器官的重量和功能與其中所含免疫細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)，從器官指數(shù)可以看出淋巴細(xì)胞的增殖，也可以粗略估計(jì)免疫功能的強(qiáng)弱。與模型組相比，各個(gè)劑量水平莫高組合（0.5g/kg、1g/kg、1.5 g/kg、2g/kg、2.5g/kg、3g/kg）均可提高小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，其中0.5g/kg莫高組的作用明顯優(yōu)于其他組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明莫高組合能夠有效對(duì)抗由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫器官損傷或萎縮，改善由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫功能低下小鼠的免疫機(jī)能。

5 結(jié)論

莫高組合（0.5～3g/kg）可以提高小鼠體質(zhì)量變化率、血清溶菌酶的活性、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，改善由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫功能低下小鼠的免疫機(jī)能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力，其中0.5g/kg莫高組的作用效果最好。