周桂仙，黃 云，劉洪艷，湯德元，曾智勇，王 彬，林 泠，黃 濤

（貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，牛呼吸道疾病的流行，引起人們的關(guān)注。牛傳染性呼吸道疾病通常是由單一或多種病原引起，常有不同病原混合感染，包括原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染，該原發(fā)性疾病通常由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛皰疹病毒1型(Bovine herpes virus-1，BHV1)、牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、牛副流感病毒3型（Bovine parinfluenza-3 virus，BPIV3)、牛冠狀病毒(Bovine corona viru-ses，BCoV）等病毒和支原體（Mycoplasma bovis，MB）、胸膜肺炎放線桿菌及支氣管敗血性波氏桿菌等細(xì)菌引起，繼發(fā)性疾病主要由肉牛鏈球菌2型、副牛嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、牛附紅細(xì)胞體等病原引起。在同一個(gè)牛場中，上述原發(fā)性病原發(fā)生流行感染，又同時(shí)繼發(fā)其它病原感染，可使病牛的臨床癥狀加重，引起較高的感染率和死亡率，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究運(yùn)用RT-PCR/PCR技術(shù)與細(xì)菌分離方法對該牛場病死牛肺臟進(jìn)行病原析，并對分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以期了解該牛場呼吸道疾病發(fā)病情況、牛支原體流行菌株對抗生素敏感程度情況，為牛支原體、病毒性腹瀉混合感染的治療防控提供理論依據(jù)。

1 發(fā)病情況及臨床癥狀

2020年12月貴陽某牛場西門塔爾雜交牛群相繼出現(xiàn)精神沉郁不振、食欲減退、部分出現(xiàn)食欲廢絕、消瘦、腹瀉、流涕流涎，口腔出現(xiàn)潰瘍，并有白色泡沫流出，咳喘等臨床癥狀。發(fā)病后該養(yǎng)殖場曾使用青霉素、硫酸鏈霉素、磺胺嘧啶鈉等藥物治療，無明顯好轉(zhuǎn)，隨后病重牛很快死亡。出現(xiàn)相關(guān)癥狀發(fā)病牛14（14/48）頭，死亡2頭。

2 實(shí)驗(yàn)室檢查

2.1 樣本采集及處理無菌采集病死牛肺臟病料組織及有呼吸道癥狀牛的鼻黏液14份，冷藏箱冷凍保存待用。

2.2 分子生物學(xué)鑒定檢測

2.2.1 PCR檢測引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI中發(fā)表的BVDV 5-UTR(MK059454)、MB uvrC（AF003959)基因序列，運(yùn)用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增目的基因片斷。其他引物設(shè)計(jì)參考石柯等發(fā)表文獻(xiàn)詳（見表1），引物由武漢擎科創(chuàng)新生物公司合成。

表1 引物序列和片段長度（引自石柯等參考文獻(xiàn)）

2.2.2 PCR和RT-PCR擴(kuò)增 病料磨碎處理，用總DNA/RNA抽提試劑盒（購自TAKARA公司）提取病料核酸反轉(zhuǎn)錄后。進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系及條件，PCR反應(yīng)體系為25μL，金牌Mix(green)21μL(購自北京擎科生物科技有限公司)，上下游引物各1μL，DNA或cDNA模板各2μL，PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min（預(yù)變性）；94℃45s（變性），退火54℃45s，72℃30s（延伸），共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃10min（延伸）。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

2.2.3 病料樣品的細(xì)菌支原體分離鑒定 將無菌采集的肺臟組織研磨粉碎，無菌接種于綿羊血瓊脂營養(yǎng)平板，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察生長情況鏡檢。將采集的肺臟組織研磨粉碎，支原體專用液體培養(yǎng)基稀釋后無菌接種支原體固體培養(yǎng)基，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2～3d，顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。牛支原體分離培養(yǎng)參考賈偉強(qiáng)等的研究進(jìn)行。

2.3 藥敏試驗(yàn)選取青霉素、硫酸鏈霉素、頭孢噻吩、泰妙菌素、慶大霉素、紅霉素泰樂菌素、強(qiáng)力菌素、左氧氟沙星、氨芐西林等多種藥物對分離得到的病原體進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測量抑菌圈直徑，并與相應(yīng)產(chǎn)品說明書中標(biāo)準(zhǔn)參照比對判斷藥物的敏感性。

3 結(jié)果與分析

3.1 分子生物學(xué)鑒定采用RT-PCR/PCR方法對各個(gè)病牛的樣品進(jìn)行檢測，部分樣品檢出牛支原體和病毒性腹瀉特異性目的基因，而未檢測到其他目的基因，結(jié)果如圖1所示，2、4、5、11號樣擴(kuò)增產(chǎn)物在527bp處出現(xiàn)清晰條帶，與預(yù)期相符合，表明感染牛支原體。8、13號樣擴(kuò)增產(chǎn)物在139bp出現(xiàn)清晰條帶，與預(yù)期相符合，表明感染牛病毒性腹瀉病毒。

圖1 牛病毒性腹瀉病毒、牛支原體基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

3.2 細(xì)菌和支原體分離鑒定結(jié)果經(jīng)過培養(yǎng)48h的麥康凱和血瓊脂培養(yǎng)基上未見菌落生長。經(jīng)過

2～3 d培養(yǎng)，支原體固體培養(yǎng)基上長出肉眼可見針尖大小的菌落，在顯微鏡下觀察可見典型的煎蛋樣菌落。

3.3 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見表2），支原體分離株對左氧氟沙星、泰妙菌素、泰樂菌素、土霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、多西環(huán)素、強(qiáng)力菌素等敏感；氨芐西林、頭孢噻吩等中度敏感，對青霉素類、硫酸鏈霉素、紅霉素、慶大霉素不敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 單位：mm

3.4 診斷和防治根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查，結(jié)果顯示，該牛場呼吸道疾病是由于牛支原體、病毒性腹瀉病毒混合感染引起。建議對整個(gè)牛場進(jìn)行全面消毒，對場內(nèi)動(dòng)物墊草、糞便等污染物進(jìn)行無害化處理。臨床治療可以結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇左氧氟沙星，土霉素，環(huán)丙沙星，泰妙菌素等治療，同群牛使用BVDV滅活疫苗緊急免疫注射。

4 小結(jié)與討論

4.1牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)能引起牛的呼吸道癥狀，各年齡段的牛都是易感群體、其中以犢牛最易感，BVDV為呼吸道疾病的原發(fā)性病原，也常和其他病原混合感染，石柯等人對貴州省部分牛場BVDV、BHV-1、BCoV、MB的感染情況調(diào)查，結(jié)果顯示BVDV陽 性 率16.07%（36/224）、MB陽 性 率12.90%（9/224）。感染病牛的急性型臨床癥狀表現(xiàn)為高熱，持續(xù)2～3d，有的呈雙相熱型，隨后出現(xiàn)腹瀉，糞質(zhì)稀薄呈水樣，并帶有粘液和血絲，大量流涎、流淚，口腔黏膜、唇內(nèi)、齒齦和硬腭和鼻黏膜糜爛或出現(xiàn)潰瘍，嚴(yán)重者整個(gè)口腔覆有灰白色的壞死上皮。在繼發(fā)感染牛支原體后，能引起肺臟炎癥，還能引起關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、乳房炎等，嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

4.2牛呼吸道感染是一類危害嚴(yán)重的疾病，通常是由單一病原感染或混合感染引起的，牛病毒性腹瀉病毒和牛支原體常有混合感染，嚴(yán)重危及養(yǎng)牛業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。臨床癥狀包括呼吸道炎癥、厭食和呼吸困難。該病主要危害犢牛和育肥牛，發(fā)病率高，給養(yǎng)殖場帶來很大損失。某些病原體可破壞牛的固有層細(xì)胞，導(dǎo)致支氣管炎和病原微生物的感染使病情加重，對牛的健康危害極大，牛病毒性腹瀉病毒是引起呼吸道疾病的主要原因之一，容易和其他病原混合感染。隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的迅速發(fā)展，國外品種不斷引進(jìn)，該病在我國發(fā)生、流行呈上升趨勢。早在20世紀(jì)60年代，我國的云南、山東、四川等地就有類似該病發(fā)生。目前，該病在貴州也普遍存在。因此在養(yǎng)殖過程中，要更加注重防治，有效地控制其蔓延，做好防制工作，減少BVDV對貴州省養(yǎng)牛業(yè)造成的損失。

4.3牛支原體是引起呼吸道疾病的病原之一，常和牛病毒性腹瀉病毒等病原形成混合感染。因此，通常需要抗菌藥物和抗病毒藥物一起使用，避免使用對病原體無效或治療效果不佳的抗菌藥物。用藥前了解病原菌的藥敏性，確保用藥準(zhǔn)確，避免藥物濫用造成機(jī)體形成抗性。根據(jù)本次藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的抗生素進(jìn)行控制。該牛場支原體分離株對左氧氟沙星、泰妙菌素、泰樂菌素、土霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素等敏感，對青霉素類、硫酸鏈霉素不敏感，因此臨床治療可以結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇左氧氟沙星、泰妙菌素、土霉素等治療及防止繼發(fā)感染，同群牛注射BVDV滅活疫苗免疫注射。

4.4預(yù)防和控制呼吸系統(tǒng)混合感染疾病對貴州養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的整體發(fā)展特別重要。對于動(dòng)物疫病的防控應(yīng)堅(jiān)持防大于治的原則，平時(shí)應(yīng)注意加強(qiáng)飼養(yǎng)，引入新品種時(shí)應(yīng)對其來源地進(jìn)行調(diào)查，在引進(jìn)其他牛種時(shí)應(yīng)及時(shí)進(jìn)行檢疫隔離，不能在疫區(qū)引進(jìn)牛種，如果出現(xiàn)病死牛要及時(shí)進(jìn)行科學(xué)的無害化處理，避免出現(xiàn)病毒傳播或者蔓延。在本病的常發(fā)區(qū)，應(yīng)該做好圈舍周圍環(huán)境的滅蠅工作。加強(qiáng)群體免疫，疫苗的接種可從根源上避免牛病毒性腹瀉的感染。呼吸道病原較多，由于缺乏特定的疫苗和藥物，這使得牛呼吸道疾病預(yù)防和控制受到影響，因此在防治牛呼吸道疾病方面更應(yīng)該加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，從源頭解決問題，根除病因。