伍玉鵬， 劉恒恒， 胡榮桂， 徐志宇， 王 硯*

（1.華中農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，湖北武漢 430070；2.中華人民共和國農業(yè)農村部農業(yè)生態(tài)與資源保護總站，北京 100125）

油菜是我國最主要的油料作物之一，其種植面積達700萬hm2以上，2019年油菜籽總產量達1322萬t（殷艷等，2021）。若按照谷草比2.7：1計算，我國油菜秸稈產量約為3569萬t。然而，只有油菜籽得到了充分的利用，大量剩余的油菜秸稈均被作為農業(yè)廢棄物丟棄，造成了資源的極大浪費（Liu等，2020）。

飼料化是實現(xiàn)秸稈資源利用的重要方式之一，也是解決我國畜牧業(yè)粗飼料來源的主要途徑（楚天舒等，2016）。油菜秸稈粗蛋白質和粗脂肪含量相比小麥、玉米和大豆等作物秸稈更高，且含有多種微量元素，是一種潛力巨大的優(yōu)質粗飼料來源（王亦聞等，2020）。但油菜秸稈自身的物理、化學特性卻極大限制了其飼料化應用。一方面，油菜秸稈木質纖維素含量要明顯高于水稻秸稈和小麥秸稈（趙蒙蒙等，2011）。另一方面，油菜秸稈表皮、皮層中的纖維素、半纖維素、木質素以多種化學鍵連接形成穩(wěn)定和復雜的結構，形成了酶解抗性屏障（Shevchenko等，1996）。這些特性對油菜秸稈的飼料化處理提出了更高的要求。

以微生物厭氧發(fā)酵為主的青貯、黃貯復合技術是目前秸稈飼料化的主要方法，并在水稻、玉米、小麥等秸稈的飼料化中得到了廣泛的應用（王亞芳等，2020；張相倫等，2018；賈晶霞等，2013）。乳酸菌是主要的接種菌劑，其在厭氧環(huán)境中大量繁殖從而將飼料中的淀粉和可溶性糖變成乳酸，降低pH，抑制有害細菌生長，提高發(fā)酵飼料質量（謝華德等，2019）。但對于油菜秸稈來說，淀粉等營養(yǎng)物質大多存在于由表皮、皮層包裹的中心莖髓中，乳酸菌很難直接發(fā)揮作用（孟春花等，2020）。因此，破壞油菜表皮中木質素、半纖維素和纖維素之間的緊密結構，降低聚合度，使半纖維素結構松散，成為微貯調制優(yōu)質油菜秸稈飼料的關鍵。

已有研究在微貯中增加好氧發(fā)酵預處理環(huán)節(jié)，通過預先破壞油菜秸稈表皮的纖維結構進而促進后續(xù)厭氧發(fā)酵（王硯等，2021），雖在一定程度上提高了油菜秸稈飼料品質，卻存在pH升高、雜菌增多等問題。因此，本研究擬在前人已有基礎上，利用好氧發(fā)酵破壞油菜秸稈表皮、皮層結構，利用高溫蒸煮控制優(yōu)勢菌群，通過比較高溫蒸煮、好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵的不同組合，篩選較優(yōu)的油菜秸稈微貯飼料化前處理方法，以提高油菜秸稈微貯效率和發(fā)酵品質，促進油菜秸稈飼料化應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 油菜采集自湖北省沙洋縣高陽鎮(zhèn)種植的雙低油菜，油菜秸稈自然風干后粉碎至1～2 cm備用。所獲取油菜秸稈粗蛋白質（CP）含量4.45%，粗脂肪含量1.77%，粗纖維含量35.66%，中性洗滌纖維（NDF）含量69.53%，酸性洗滌纖維（ADF）含量50.25%，水分含量9.14%，可溶性糖（WSC）含量1.43%，總磷（TP）含量0.09%，總鉀（TK）含量1.15%，總鈣（TCa）含量1.44%。

乳酸菌由華中農業(yè)大學微生物工程學院研究中心提供，為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），活菌數約為10億cfu/g。秸稈腐熟劑由華中農業(yè)大學微生物工程中心提供，其包含枯草芽孢桿菌200億cfu/g、短小芽孢桿菌20億cfu/g、地衣芽孢桿菌10億cfu/g、酵母菌2億cfu/g和黑曲霉2億cfu/g。

1.2 試驗設計 本研究通過高溫蒸煮、好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵的不同組合，共設置7個處理（圖1）。對照（CK）：接種乳酸菌進行40 d的厭氧發(fā)酵；聯(lián)合厭氧發(fā)酵（CK+S）：同時接種乳酸菌和秸稈腐熟劑進行40 d的厭氧發(fā)酵；蒸煮+聯(lián)合厭氧發(fā)酵（TCK+S）：先對油菜秸稈進行高溫蒸煮，之后接種乳酸菌和秸稈腐熟劑進行40 d的厭氧發(fā)酵；好氧預處理+厭氧發(fā)酵（S-CK）：先利用秸稈腐熟劑進行7 d的好氧發(fā)酵，之后利用乳酸菌進行33 d的厭氧發(fā)酵；蒸煮+好氧預處理+厭氧發(fā)酵（T-S-CK）：高溫蒸煮后利用秸稈腐熟劑進行7 d的好氧發(fā)酵，之后利用乳酸菌進行33 d的厭氧發(fā)酵；好氧預處理+蒸煮+厭氧發(fā)酵（S-T-CK）：利用秸稈腐熟劑進行7 d的好氧發(fā)酵，高溫蒸煮之后利用乳酸菌進行33 d的厭氧發(fā)酵；蒸煮+好氧預處理+蒸煮+厭氧發(fā)酵（T-S-T-CK）：利用秸稈腐熟劑進行7 d的好氧發(fā)酵，在好氧發(fā)酵前、后分別進行高溫蒸煮，之后利用乳酸菌進行33 d的厭氧發(fā)酵。

各處理均稱取500 g秸稈按照設置開展試驗。參考菌劑說明書，好氧發(fā)酵中秸稈腐熟劑添加量為物料干重的0.2%，混勻，調節(jié)含水率為65%，蓋上保溫棉進行7 d的好氧發(fā)酵，期間適當進行翻堆；厭氧發(fā)酵中乳酸菌添加量為物料干重的2%，混勻，調節(jié)水分為65%，將秸稈放在發(fā)酵袋內，利用熱封機密封，抽真空后放置在恒溫培養(yǎng)箱38℃下厭氧發(fā)酵33 d或40 d。高溫蒸煮在滅菌鍋中進行，121℃維持30 min。每個處理設置3個重復。

1.3 取樣及測定 在40 d發(fā)酵結束后，利用五點法采樣，根據我國現(xiàn)行的《青貯飼料質量評定標準》（1996）進行感官鑒定，對樣品pH、總氮（TN）、氨氮（AN）、干物質（DM）、可溶性碳水化合物（WSC）、粗蛋白質（CP）、乳酸、中性洗滌纖維（NDF）及酸性洗滌纖維（ADF）含量等表征發(fā)酵飼料品質的指標進行測定。其中DM含量通過烘干法測定；pH由新鮮樣品與去離子水混合（1：10）振蕩獲得上清液后用pH計測定；AN含量用納氏試劑法測定；樣品NDF和ADF含量采用英國ringbio濾袋技術全自動纖維分析儀測定；采用H2SO4-H2O2消化，凱氏定氮儀測定TN并計算CP含量；乳酸采用離子色譜法檢測；WSC含量采用蒽酮-硫酸比色法測定。對各處理樣品結構進行表征，利用超高分辨率場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行電鏡掃描（SEM）。

1.4 統(tǒng)計分析 所有試驗數據均以均值表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對不同處理進行相關的統(tǒng)計分析、顯著性檢驗等。

秸稈飼料品質的綜合評價采用隸屬函數值法進行（林真等，2014），用隸屬函數法轉化數據統(tǒng)一量綱，其中正相關指標（Uin）、負相關指標（U′in）依據以下公式進行轉化：

式中：Uin和U’in分別指第n個樣品第i個指標的原始數據經轉化后的隸屬函數值；Xin指第n個樣品第i個指標的原始測定結果；Ximax和Ximin分別指樣品組中第i個指標的最大值和最小值。

將各個待評價材料的各個指標的具體特性隸屬值進行累加，并求平均數以獲取各個處理的平均隸屬度。

2 結果與討論

2.1 不同處理油菜秸稈飼料感官評價 各處理獲得的油菜秸稈飼料均無腐敗氣味，顏色為褐黃或亮黃色，在含水率上并無顯著差異（表1）。pH是影響微貯質量的重要因素之一，pH快速下降，有助于限制植物酶活性，減少蛋白質降解損失，抑制產生高水平乙酸、丁酸的有害微生物以及其他有害微生物的數量（Hwang等，2004）。在本研究中，秸稈腐熟劑與高溫蒸煮的不同組合對秸稈飼料pH產生的影響并不相同，其中S-T-CK及TS-T-CK處理獲得的飼料pH分別為3.90和3.92，要顯著低于其他處理，說明利用秸稈腐熟劑對油菜秸稈進行好氧發(fā)酵預處理并在厭氧微貯前進行高溫蒸煮能夠有效促進乳酸菌的大量繁殖，進而將飼料中的淀粉和可溶性糖變成乳酸，這有利于提高發(fā)酵飼料的質量。但S-T-CK與T-S-TCK之間的飼料pH無顯著差異，說明好氧發(fā)酵前增加高溫蒸煮并未有效促進產酸。從最終的油菜秸稈飼料感官評價結果來看，S-T-CK及T-S-TCK評定總分在80以上，較常規(guī)微貯提高了78%，均達到了優(yōu)等，T-S-CK、S-CK及T-CK+S評定總分在60～80，為良好，而CK和CK+S總分低于60，為一般。

2.2 不同處理油菜秸稈飼料營養(yǎng)品質 飼料中的CP及WSC含量是評價飼料營養(yǎng)品質的重要指標，其中CP指飼料中含氮有機物的總稱，包含一些必需的氨基酸，而WSC則是反芻動物瘤胃微生物合成菌體蛋白重要的能源（劉海燕等，2019）。本研究顯示，好氧發(fā)酵預處理結合高溫蒸煮能夠有效提高飼料中的CP含量，其中T-S-TCK、S-T-CK及T-S-CK處理CP含量均達到了5%以上，顯著高于CK+S及CK處理（表2）。但各處理之間在WSC上均無顯著差異，其中T-S-TCK、S-T-CK及T-S-CK處理相比CK甚至小幅降低了WSC含量，可能是乳酸菌大量繁殖生長加快了對WSC的利用（曾輝等，2017）。這一觀點可由對應處理中顯著降低的pH得到印證（表1）。雖然好氧發(fā)酵預處理結合高溫蒸煮促進了乳酸菌大量繁殖，但乳酸菌沒有蛋白質分解酶，不分解破壞原料中的蛋白質（Elferink等，1999）。這是本研究中CP與WSC在不同處理中呈現(xiàn)不同趨勢的原因。

NDF和ADF是評價纖維品質優(yōu)良的重要指標，其含量分別與動物采食量和消化率呈負相關。飼料中NDF與ADF含量越低，表明其飼用價值越大，經濟價值越高（陰法庭等，2018）。在本研究中，好氧發(fā)酵預處理結合高溫蒸煮相比CK顯著降低了NDF與ADF含量，較常規(guī)微貯可降低3.44%～7.29%，提高了油菜秸稈的飼用價值（表2）。除CK外，各處理之間的DM含量均無顯著差異，而導致CK處理DM含量較低可能與其較高的含水量有關（表1）。

表2 不同處理的油菜秸稈發(fā)酵飼料營養(yǎng)品質

微貯過程中，各類微生物活動消耗降解蛋白質并產生AN，飼料中的AN/TN值越高，說明蛋白質降解越多（朱玉環(huán)等，2013）。蛋白質是動物獲取植物能量的重要來源，蛋白質若大量降解會顯著降低飼草利用率。因此，一般品質優(yōu)等飼料的AN占TN的比例應低于10%（陰法庭等，2018）。本研究中，各處理的AN/TN均在10%以下，各處理之間并無顯著差異（表2）。本研究顯示T-S-T-CK、S-T-CK、T-S-CK及S-CK處理的飼料乳酸含量均顯著高于CK、CK+S及TCK+S處理的飼料，說明好氧發(fā)酵預處理結合高溫蒸煮促進了發(fā)酵過程中乳酸菌等有益菌的繁殖，使之成為貯料中的優(yōu)勢菌群，進而產生大量乳酸（曾輝等，2019）。

2.3 不同處理油菜秸稈飼料電鏡結構表征 由圖1可看出，油菜秸稈的原樣表皮緊密有序，結構清晰，無孔洞存在。分別對油菜秸稈原樣進行好氧發(fā)酵和高溫蒸煮，發(fā)現(xiàn)好氧預處理之后的油菜秸稈表面出現(xiàn)塌陷，并且細胞壁有褶皺和破損，出現(xiàn)孔洞，比表面積增加；高溫蒸煮僅僅讓秸稈表皮變得褶皺，卻并未明顯破壞油菜秸稈結構。這說明高溫蒸煮僅能起到軟化秸稈的作用，卻并不能直接影響其后的微貯質量。對各個處理微貯獲得的油菜秸稈飼料進行電鏡掃描，發(fā)現(xiàn)T-S-T-CK、S-T-CK、T-S-CK及S-CK處理油菜秸稈破碎化程度更高，結構變得松散，表層斷裂現(xiàn)象較多，而CK、CK+S及T-CK+S處理表層斷裂現(xiàn)象較少。

圖1 不同處理油菜秸稈飼料電鏡結構表征

2.4 不同處理油菜秸稈發(fā)酵飼料品質綜合評估對比各處理油菜秸稈發(fā)酵飼料營養(yǎng)指標，發(fā)現(xiàn)不同指標在不同處理中各有優(yōu)勢，因此很難通過單一的指標對各微貯方法進行評判。模糊數學中的隸屬函數分析方法提供了一條在多指標測定基礎上對飼料營養(yǎng)品質進行綜合評價的途徑，其考慮到了各個指標的作用，避免了只考慮粗蛋白質和pH等幾個因子而忽視其他幾個因子的弊端，可以更全面、均衡的評價飼料的營養(yǎng)品質，使試驗結果更加客觀、準確（劉晶等，2018）。本研究顯示，不同處理獲得的油菜秸稈飼料平均隸屬度排序為ST-CK≈T-S-T-CK＞T-S-CK≈S-CK＞CK+S≈T-CK+S＞CK（表3）?？傮w來看，在傳統(tǒng)厭氧發(fā)酵過程中加入秸稈腐熟劑，能夠在一定程度上提高飼料品質，但效果并不明顯，這可能是由于厭氧環(huán)境無法提供秸稈腐熟劑中好氧微生物所需的最優(yōu)環(huán)境，限制了秸稈腐熟劑中好氧微生物的作用，此外，秸稈原本附著土著微生物的競爭也可能削弱接種微生物的作用。在S-CK處理中，秸稈腐熟劑進行的好氧發(fā)酵可通過破壞油菜秸稈纖維的內部結構促進后續(xù)厭氧發(fā)酵，進而提高油菜秸稈微貯品質，這與王硯等（2021）的研究結果一致。但T-S-CK與S-CK在秸稈飼料綜合評價上并無顯著區(qū)別，說明好氧發(fā)酵前增加的高溫蒸煮環(huán)節(jié)并未能發(fā)揮作用，可歸結于高溫蒸煮并不能實際破壞秸稈物理結構。這一現(xiàn)象在S-T-CK與T-S-TCK處理之間亦得到了證實。然而，S-T-CK與SCK處理相比平均隸屬度由0.58提高到了0.81，說明好氧發(fā)酵與厭氧發(fā)酵之間插入的高溫蒸煮環(huán)節(jié)顯著改善了秸稈飼料品質。這可歸結為高溫蒸煮殺死了原料中的微生物，為接種的乳酸菌提供了一個資源充足且無競爭的環(huán)境，極大的促進了乳酸菌的生長，強化了厭氧發(fā)酵中乳酸菌的作用。S-T-CK與T-S-T-CK處理相比其平均隸屬度并無明顯差距，但T-S-T-CK處理增加了工藝復雜度，增加了能耗，因此本研究更加推薦S-T-CK工藝用于油菜秸稈的飼料化微貯。

表3 不同處理油菜秸稈飼料綜合評估隸屬函數

3 結論

利用秸稈腐熟劑進行7 d的好氧發(fā)酵，高溫蒸煮，之后利用乳酸菌進行33 d的厭氧發(fā)酵是對油菜秸稈進行飼料化微貯的最佳方法。該方法獲得的秸稈飼料感官較好，且擁有更低的NDF和ADF含量以及更高的CP和乳酸含量。