王 慶, 張巧娥*, 張轉(zhuǎn)弟, 李 月, 李云鶴, 封 元
(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021;2.寧夏回族自治區(qū)畜牧工作站,寧夏銀川 750001)
抗生素作為一種非營養(yǎng)性飼料添加劑,有著促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高動(dòng)物繁殖性能和存活率、降低疾病發(fā)生率、提高飼料轉(zhuǎn)化效率、降低飼料成本的作用(Dong等,2021)。但其會(huì)提高細(xì)菌對(duì)藥物耐藥性,從而使畜禽免疫力降低,導(dǎo)致內(nèi)源性感染;并且還會(huì)引起過敏反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)、以及“致癌、致畸和致突變”等;同時(shí),大多數(shù)抗生素與畜禽糞尿一起排放到環(huán)境中后仍保持活性,對(duì)土壤微生物、水生生物和昆蟲均有不利影響(縱瑞等,2021;張利珍,2019;王亞書等,2019;Allen等,2013;Frizzoa等,2011)。自2020年我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194號(hào)公告開始全面禁止抗生素的使用以來,研究學(xué)者開始探索可以完美替代抗生素的產(chǎn)品,其中益生菌是目前公認(rèn)的最有前景的抗生素替代品(楊柳青,2020)。益生菌主要通過競(jìng)爭(zhēng)排斥、直接抗菌抑制、宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、增強(qiáng)腸道固有免疫力、提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率、減少腹瀉和抗毒素作用以及刺激或抑制獲得性免疫等方法來提高動(dòng)物生產(chǎn)性能(Beulah等,2020)。常用菌群有:酵母菌群、芽孢桿菌、乳酸菌群、革蘭氏陽性放線菌群等(李洵,2021;Vicini等,2019;Red等,2018)。
研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌對(duì)犢牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)存在一定的影響。Zhang等(2017)研究發(fā)現(xiàn),通過添加復(fù)合菌飼喂?fàn)倥#鑫赴l(fā)酵特性無顯著差異。16S rRNA V3區(qū)擴(kuò)增片段的凝膠電泳分析結(jié)果表明,56日齡斷奶前,微生態(tài)制劑對(duì)瘤胃細(xì)菌群落沒有影響。但于萍等(2009)的研究表明,飼糧中添加納豆芽孢桿菌,可以促進(jìn)犢牛消化系統(tǒng)中的琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌和脂解厭氧弧桿菌的定植與生長(zhǎng)。劉程等(2020)的研究表明,每頭牛日糧中添加由地衣芽孢桿菌(活菌數(shù)≥1.0×109cfu/g)、枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)≥2.0×109cfu/g)和米曲霉(活菌數(shù)≥2.0×104cfu/g)組成的復(fù)合益生菌20 g后,在門水平上,試驗(yàn)組和對(duì)照組相對(duì)豐度前10的菌門均無顯著差異;在屬水平上,試驗(yàn)組琥珀酸菌屬相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組,瘤胃球菌屬相對(duì)豐度提高42.1%,琥珀酸弧菌屬相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組。但是,目前關(guān)于酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌對(duì)犢牛瘤胃方面的研究較少,所以,本試驗(yàn)將立足于前人的研究基礎(chǔ)之上,探究復(fù)合菌顆粒料對(duì)犢牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)和菌群結(jié)構(gòu)的影響,為指導(dǎo)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2020年7月6日至10月16日在寧夏壹泰牧業(yè)有限公司進(jìn)行。選擇20頭出生年齡相近(7日齡)且健康的安格斯?fàn)倥?,隨機(jī)分為2組,其中對(duì)照組10頭,試驗(yàn)組10頭,經(jīng)t檢驗(yàn)分析,兩組體重差異不顯著(P>0.05)[(27.7±2.85)kg]。犢牛出生后稱重,出生后0.5~1.0 h進(jìn)行人工誘食,隨后初乳后自然哺乳,7 d后誘食顆粒料。試驗(yàn)使用犢牛顆粒料,其原料組成為:玉米、豆粕、棉籽粕、膨化大豆、磷酸氫鈣、維生素預(yù)混合飼料、微量元素預(yù)混合飼料等,各種原料營養(yǎng)水平見表1。對(duì)照組飼喂該顆粒料;試驗(yàn)組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上添加商品型1%復(fù)合菌(酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌)顆粒料,活菌數(shù)為3×108cfu/g,試驗(yàn)期間兩組自由采食,記錄每天顆粒料采食量,自由飲水。每日少量多次添加,試驗(yàn)期共100 d,其中預(yù)飼期10 d,正試期90 d。
表1 顆粒料營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))
1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法 在試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天早晨犢??崭箷r(shí),每組隨機(jī)選取6頭犢牛用瘤胃液采集器從口腔采集瘤胃液50 mL(棄去前20 mL),未經(jīng)紗布過濾直接裝于凍存管以保證瘤胃液中菌群的完整性。之后液氮保存并及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室備測(cè)。
1.2.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測(cè)定 參照王敬堯(2019)方法采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定氨氮濃度(NH3-N),采用pH劑測(cè)定瘤胃液pH,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定菌體蛋白(MCP),采用氣相色譜儀測(cè)定瘤胃液的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸以及總揮發(fā)性脂肪酸含量。
1.2.2 瘤胃微生物多樣性測(cè)定 將在液氮中凍存的瘤胃液送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。具體流程為:將瘤胃液4℃解凍后,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提DNA,合成帶有barcode的特異引物,其序列為:上游引物338F:5"-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3";下游引物806R:5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3"。切膠回收PCR產(chǎn)物后用QuantiFlourTM-ST熒光定量,最后在MiSeq PE-300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。
1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)先通過Excel 2007進(jìn)行初步整理,然后使用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。最終結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
2.1 復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表2可知,復(fù)合菌顆粒料飼喂?fàn)倥:罅鑫竷?nèi)MCP含量可以顯著提高0.37 mg/mL(P<0.05),而氨態(tài)氮、pH、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、乙酸/丙酸以及總揮發(fā)性脂肪酸含量均表現(xiàn)為對(duì)照組與試驗(yàn)組差異不顯著(P>0.05)。
表2 復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響
2.2瘤胃菌群結(jié)果
2.2.1 OTUs比較 由圖1可知,Illumina M iSeq測(cè)序后對(duì)12個(gè)犢牛瘤胃液樣本按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類,在聚類過程中去除嵌合體,得到OTU的代表序列。結(jié)果顯示:對(duì)照組共含有1230個(gè)OTUs,試驗(yàn)組共含有1354個(gè)OTUs,其中,試驗(yàn)組(B1)和對(duì)照組(A1)共同含有的OTUs數(shù)是1096個(gè),對(duì)照組特有的OTUs數(shù)是134個(gè),試驗(yàn)組特有OTUs顯著高于對(duì)照組,有258個(gè)。說明試驗(yàn)組和對(duì)照組瘤胃液菌群組成有差異。
圖1 Venn圖
2.2.2 細(xì)菌稀釋曲線 試驗(yàn)組(B1)與對(duì)照組(A1)樣本的OTUs稀釋曲線結(jié)果如圖2所示,結(jié)果表明:隨著測(cè)序深度逐漸遞進(jìn),試驗(yàn)組和對(duì)照組的OTUs數(shù)量和物種豐富度表現(xiàn)一致,在剛開始時(shí)OTUs數(shù)量陡然上升,之后達(dá)到平緩期。表明測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中的細(xì)菌物種,測(cè)序數(shù)量足夠,結(jié)果可以反映菌群的大部分真實(shí)信息。
圖2 OTUs稀釋曲線
2.2.3 α多樣性分析 由表3可知,復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃α多樣性指數(shù)均有影響,試驗(yàn)組的Sobs指數(shù)和Ace指數(shù)分別顯著高于對(duì)照組217.73和242.93(P<0.05);試驗(yàn)組的Shannon指數(shù)極顯著高于對(duì)照組0.81(P<0.01);試驗(yàn)組的Chao指數(shù)極顯著高于對(duì)照組263.39(P<0.01);對(duì)照組Simpson指數(shù)顯著高于試驗(yàn)組0.04(P<0.05);而試驗(yàn)組和對(duì)照組的覆蓋率差異不顯著(P>0.05)。
表3 復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃微生物菌群多樣性的影響
2.2.4 細(xì)菌樣本PCoA分析 主坐標(biāo)分析(PCoA)用來表示每個(gè)瘤胃液樣品間的差異,當(dāng)瘤胃液中物種組成差異越大時(shí)圖中樣品的間距就會(huì)越遠(yuǎn)。從圖3可以看出,在PC1和PC2的分別為53.05%、37.06%時(shí),對(duì)照組(A1)和試驗(yàn)組(B1)的間距較遠(yuǎn),說明2組菌群差異性較明顯。除對(duì)照組的A5樣品和試驗(yàn)組的B5樣品與本組的距離較遠(yuǎn)外,組內(nèi)其他樣品距離都較近,說明組內(nèi)菌群差異性較小。
圖3 PCoA圖
2.2.5 細(xì)菌物種門水平相對(duì)豐度 從表4可知,對(duì)照組和試驗(yàn)組均由擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetota)以及其他相對(duì)豐度<1%的共18種菌門組成。表中所列菌門中兩組間的差異均不顯著(P>0.05)。其中擬桿菌門都是兩組的優(yōu)勢(shì)菌門,但試驗(yàn)組較對(duì)照組提高了8.68個(gè)百分點(diǎn)。
表4 復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃門水平上菌群結(jié)構(gòu)的影響(相對(duì)豐度>1%)%
2.2.6 細(xì)菌物種屬水平相對(duì)豐度 由表5可知,在屬水平上對(duì)照組和試驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌屬都是普雷沃菌屬(Prevotella),但對(duì)照組的第二優(yōu)勢(shì)菌屬是理 研 菌 科_RC9腸 道 群 (Rikenellaceae_RC9_gut_group),試驗(yàn)組的第二優(yōu)勢(shì)菌屬是未 分 類_f_Muribaculaceae(norank_f_Muribaculaceae),其相對(duì)豐度均在5%以上。表中所列菌屬中除試驗(yàn)組的普雷沃氏菌科_UCG-003群(Prevotellaceae_UCG-003)和普雷沃氏菌科_UCG-001群(Prevotellaceae_UCG-001)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)外,其他各項(xiàng)兩組間差異均不顯著(P>0.05)。
表5 復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃屬水平上菌群結(jié)構(gòu)的影響(相對(duì)豐度>1%)%
2.2.7 瘤胃細(xì)菌群落與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的關(guān)系 利用相關(guān)性分析得相關(guān)性Heatmap圖,評(píng)估了瘤胃細(xì)菌屬與瘤胃發(fā)酵參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系。如圖4所示,乙酸與norank_f_Muribaculaceae呈正相關(guān)(P<0.05),與Rikenellaceae_RC9_gut_group呈弱負(fù)相關(guān)(P<0.05);丙酸與Ruminococcus呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與Rikenellaceae_RC9_gut_group呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)(P<0.05);丁酸與norank_f_Murib-aculaceae呈正相關(guān)(P<0.05);戊酸與Olsenella呈弱正相關(guān)(P<0.05),與Succiniclasticum呈強(qiáng)正相關(guān)(P<0.05);總揮發(fā)性脂肪酸與norank_f_Muribaculaceae呈 正 相 關(guān) (P<0.05), 與Rikenellaceae_RC9_gut_group呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。
圖4 瘤胃細(xì)菌屬(相對(duì)豐度最高的10個(gè)菌屬)相對(duì)豐度與瘤胃發(fā)酵參數(shù)相關(guān)性分析
3.1 復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 顆粒料中的含氮物質(zhì)是瘤胃液中NH3-N的主要來源。而NH3-N濃度主要取決于瘤胃對(duì)含氮物質(zhì)的降解率和吸收率 (李嵐捷等,2017;Ruselljb等1992)。本試驗(yàn)中對(duì)照組和試驗(yàn)組NH3-N濃度分別為13.70 mg/L和11.54 mg/L,差異不顯著,說明兩組犢牛對(duì)顆粒料中含氮物質(zhì)的降解率和吸收率無差異。MCP是反芻動(dòng)物小腸中部分氨基酸的重要前體物,適量的MCP可平衡氨基酸的利用以降低蛋白質(zhì)飼料的使用,并能促進(jìn)犢牛生長(zhǎng)發(fā)育。本試驗(yàn)中兩組MCP含量存在顯著差異,表現(xiàn)為試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組,與謝建林等(2021)研究結(jié)果相同,并且MCP含量均比聶練等(2019)研究復(fù)合菌組60 d測(cè)得0.42 mg/mL高出1.92 mg/mL。可能是復(fù)合菌顆粒料中的益生菌提高了犢牛瘤胃中微生物多樣性,進(jìn)而使試驗(yàn)組MCP含量較對(duì)照組的高(郭凱等,2019)。顆粒料中的碳水化合物會(huì)在瘤胃微生物的發(fā)酵作用下分解產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸物質(zhì),然后為犢牛提供葡萄糖前體物和脂肪等,從而為犢牛機(jī)體提供70%~80%的能量(凌浩等,2021)。在本試驗(yàn)中雖然兩組的揮發(fā)性脂肪酸間均無顯著差異,但整體表現(xiàn)為試驗(yàn)組略高于對(duì)照組,表明給犢牛飼喂復(fù)合菌顆粒料有助于機(jī)體分解葡萄糖和淀粉等物質(zhì)以提高能量的利用。
3.2 復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響 雖然犢牛瘤胃內(nèi)微生物體系還沒有完全成型,但還是可以通過高通量測(cè)序來確定犢牛瘤胃內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)和種類(李常瑞,2017),進(jìn)而探究復(fù)合菌顆粒料對(duì)犢牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響。Venn圖可以直觀得觀察在97%水平下獨(dú)有和共同的OUT數(shù),即觀察兩組樣品是否存在差異。本試驗(yàn)就是基于兩組樣品的Venn圖存在差異的情況下繼續(xù)探究復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響。
就α多樣性指數(shù)而言:Sobs指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)可反映菌群豐富度,且和菌群豐富度呈正相關(guān);Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)可綜合反映菌群的多樣性和均勻度,而Simpson指數(shù)與菌群多樣性呈負(fù)相關(guān),Shannon指數(shù)與菌群多樣性呈正相關(guān),即當(dāng)Simpson指數(shù)越小、Shannon指數(shù)越大時(shí)瘤胃液菌群多樣性越大(Jami等,2013)。本試驗(yàn)中試 驗(yàn) 組 的Sobs指 數(shù)、ACE指 數(shù)、Chao指 數(shù) 和Shannon指數(shù)均顯著高于對(duì)照組,對(duì)照組Simpson指數(shù)顯著高于試驗(yàn)組,與Hu等(2020)研究結(jié)果一致。并且與β多樣性分析相結(jié)合表明給犢牛飼喂復(fù)合菌顆粒料可以顯著增加瘤胃內(nèi)菌群的豐富度以及多樣性,為降解吸收營養(yǎng)物質(zhì)提供基礎(chǔ)。
3.3 復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃菌群門水平的影響對(duì)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的研究表明擬桿菌門和厚壁菌門是瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群 (吳瓊等,2020;Wu等,2020;Hein等,2020),本試驗(yàn)共測(cè)得的18個(gè)門中優(yōu)勢(shì)菌群與這些研究結(jié)果相同。本試驗(yàn)擬桿菌門占比達(dá)到60%以上,為第一優(yōu)勢(shì)菌群,但是這些菌群也是機(jī)會(huì)性致病菌群,當(dāng)犢牛體內(nèi)正常的微生態(tài)平衡被外界環(huán)境打破時(shí)這些菌群有可能會(huì)引起犢牛機(jī)體內(nèi)源性的發(fā)病(Li等,2017)。同時(shí),擬桿菌基因編碼的外周蛋白SusC和SusD可以調(diào)節(jié)淀粉與細(xì)菌表面的接觸,從而起到分解多糖的作用(Fredrik等2004),本研究中雖然兩組間擬桿菌門豐度差異不顯著,但表現(xiàn)為試驗(yàn)組比對(duì)照組略高,這也是瘤胃中試驗(yàn)組丙酸含量比對(duì)照組高的原因。說明飼喂復(fù)合菌顆粒料有助于犢牛對(duì)多糖物質(zhì)的分解。同時(shí)Evans等(2011)研究發(fā)現(xiàn),厚壁菌門具有參與分解纖維物質(zhì)的作用,從而促進(jìn)瘤胃內(nèi)乙酸和丁酸的產(chǎn)生,本試驗(yàn)中試驗(yàn)組和對(duì)照組的厚壁菌門豐度以及乙酸和丁酸的含量之間差異均不顯著,表明復(fù)合菌顆粒料對(duì)厚壁菌門無顯著影響,但從乙酸和丁酸含量的結(jié)果來看,試驗(yàn)組的乙酸和丁酸含量均略高于對(duì)照組,這可能是瘤胃內(nèi)其他菌群的作用導(dǎo)致,具體還有待研究。
3.4 復(fù)合菌顆粒料對(duì)瘤胃菌群屬水平的影響 在屬水平上,本試驗(yàn)共測(cè)得241個(gè)屬,而相對(duì)豐度大于1%的只有20種。其中普雷沃氏菌屬為第一優(yōu)勢(shì)菌屬,這與陳林(2020)研究結(jié)果一致。而Purushe等(2010)和Matsui等(2000)研究發(fā)現(xiàn),普雷沃氏菌屬具有多重功能和多個(gè)基因型,具有裂解寡糖、蛋白質(zhì)和淀粉以及降解半纖維素的功能,另外有研究表明,普雷沃氏菌屬可以在瘤胃中消耗氫,可以通過丙烯酸和琥珀酸途徑發(fā)酵糖類物質(zhì)而產(chǎn)生丙酸(Flinth,2008)。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組的普雷沃氏菌科_UCG-003群和普雷沃氏菌科_UCG-001群均顯著高于對(duì)照組,說明復(fù)合菌顆粒料可以提高普雷沃氏菌的相對(duì)豐度,從而促進(jìn)犢牛對(duì)寡糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的利用以及產(chǎn)生更多的丙酸為機(jī)體提供能量,進(jìn)而促進(jìn)犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育。
3.5瘤胃細(xì)菌群落與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的關(guān)系 本試驗(yàn)分析了瘤胃菌屬中前10相對(duì)豐度的菌屬與瘤胃發(fā)酵參數(shù)之間的相關(guān)性關(guān)系。其中有9個(gè)菌屬相對(duì)豐度與瘤胃發(fā)酵參數(shù)呈顯著關(guān)系。與其他瘤胃發(fā)酵參數(shù)相比,本試驗(yàn)中更多菌屬與乙酸、丙酸、丁酸、戊酸以及總揮發(fā)性脂肪酸顯著相關(guān),本結(jié)果與陳林(2020)研究結(jié)果相似,但與曾鈺等(2020)研究結(jié)果存在差異,這可能是因?yàn)槠贩N以及飼料類型等因素的影響。但主要都是表現(xiàn)為乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸與瘤胃菌屬之間有相關(guān)關(guān)系。所以揮發(fā)性脂肪酸的水平可能是影響瘤胃菌群的關(guān)鍵因素,瘤胃菌群可通過發(fā)酵作用產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,進(jìn)而刺激犢牛瘤胃的發(fā)育(Rey等,2014)。本試驗(yàn)結(jié)果說明乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的含量對(duì)norank_f_Muribaculaceae有促進(jìn)作用,對(duì)Rikenellaceae_RC9_gut_group有抑制作用,說明揮發(fā)性脂肪酸的濃度與瘤胃菌群的組成密切相關(guān)。
復(fù)合菌顆粒料可以顯著提高犢牛瘤胃中MCP的含量,對(duì)乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸以及總揮發(fā)性脂肪酸有增長(zhǎng)的趨勢(shì);并且可以增加犢牛瘤胃菌群豐富度,其中擬桿菌門相對(duì)豐度較對(duì)照組提高8.68個(gè)百分點(diǎn),普雷沃菌屬、普雷沃氏菌科_UCG-003群以及普雷沃氏菌科_UCG-001群等相對(duì)豐度也有所提高。