陳穎慶，鄧阿黎,，陳林娜，周忠明，王燕萍，金 晶，向 英，吳 雙，徐 靜，余 念，盧雯婷，李 婷，詹 妮

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430060)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是指與同一配偶連續(xù)發(fā)生2次或2次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失[1]。病因?qū)W研究顯示子宮結(jié)構(gòu)、染色體、內(nèi)分泌、免疫、血栓前狀態(tài)、感染等因素均與RSA發(fā)生有關(guān)，但仍有50%病因不明確。胎兒作為半同種異體移植體，能夠在母體內(nèi)成功妊娠至分娩，關(guān)鍵在于母體與胎兒之間的相互免疫耐受。目前，關(guān)于RSA的研究方向主要聚焦于免疫和炎癥介質(zhì)等方面，當(dāng)母胎界面的免疫平衡打破后，母體可能對(duì)胚胎產(chǎn)生排斥反應(yīng)導(dǎo)致流產(chǎn)。Sereshki等[2]研究報(bào)道，在月經(jīng)周期增殖期和分泌期，RSA患者的輔助性T細(xì)胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)比值顯著高于正常妊娠孕婦。錢金鳳等[3]發(fā)現(xiàn)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)患者蛻膜組織中Th17/Treg比值明顯高于正常妊娠早期選擇流產(chǎn)的婦女，表明Th17/Treg細(xì)胞免疫之間的平衡可能與妊娠結(jié)局密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為RSA不僅耗損腎氣，且易惡血留內(nèi)。根據(jù)古今醫(yī)家治療RSA的臨證經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)病機(jī)多以腎虛為本，血瘀為標(biāo)，臨床上以壽胎丸加減化裁而成補(bǔ)腎活血方治療屢見效驗(yàn)[4-5]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方可有效改善RSA患者免疫微環(huán)境[6]。本實(shí)驗(yàn)通過建立RSA孕鼠模型，觀察補(bǔ)腎活血方干預(yù)后Th17/Treg平衡及相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化和妊娠結(jié)局，進(jìn)一步探究了補(bǔ)腎活血方的免疫效應(yīng)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)CBA/J雌鼠60只，BALB/C雄鼠5只，DBA/2雄鼠25只，周齡7～8周，體重(19±2)g，22 ℃環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。CBA/J雌鼠、BALB/C雄鼠購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2020-0004；DBA/2雄鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。本研究已通過湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院湖北省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查[鄂中醫(yī)院動(dòng)(福)第2020006號(hào)]。

1.2藥物 補(bǔ)腎活血方組成：菟絲子20 g、桑寄生15 g、續(xù)斷15 g、阿膠10 g、丹參10 g、川芎6 g，中藥均購(gòu)于湖北省中醫(yī)院。制備：中藥(阿膠除外)用8倍水浸泡30 min，大火先煮沸30 min，倒出藥液，再加入4倍水，煮沸30 min；合并藥液并加入已經(jīng)烊化的阿膠，水浴濃縮，最后配制成補(bǔ)腎活血方(含生藥3.8 g/mL)，置于-20 ℃冰箱備用。地屈孕酮溶液：將地屈孕酮片(荷蘭 Abbott Healthcare Products B.V.公司，批準(zhǔn)文號(hào)H20170221，規(guī)格：10 mg/片)3片溶于200 mL蒸餾水，稀釋至1.5×10-4mg/mL，放置于-20 ℃冰箱備用。

1.3主要試劑及儀器 白細(xì)胞介素-17(IL-17)(貨號(hào)：MU30074)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)(貨號(hào)：MU30574)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒，Bioswamp；DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30022.01B)，Hyclone公司；磷酸鹽緩沖鹽溶液(貨號(hào)：P1010)、0.25%胰蛋白酶(貨號(hào)：T1350)、 胎牛血清(貨號(hào)：P1400)、鈣離子霉素(貨號(hào)：18800)、莫能菌素鈉(貨號(hào)：M8670)，solarbio；Ⅱ型膠原酶(貨號(hào)：17101015)，Gibco 公司；流式抗體FITC-CD4(貨號(hào)：11-0041-82)、PE-IL-17A(貨號(hào)：12-7177-81)、 PE-Cy5-CD25(貨號(hào)：15-0251-82)、PE-FoxP3(貨號(hào)：12-5773-82)，eBioscience；固定破核劑(貨號(hào)：562574)，BD bioscien；佛波酯 PMA(貨號(hào)：P1585)，Sigma；超凈工作臺(tái)(型號(hào)：SW-CJ-2D)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：311)，美國(guó)Thermo 公司；移液器(型號(hào)：F3)，美國(guó) Thermo 公司；倒置熒光顯微鏡(型號(hào)：DMIL LED)，Leica 公司；流式細(xì)胞儀(貨號(hào)：NovoCyte)，艾森。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將CBA/J雌鼠與BALB/C雄鼠2∶1合籠建立正常妊娠模型，將CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠2∶1合籠建立RAS模型。合籠次日7：00和19：00觀察陰栓，檢出陰栓計(jì)為妊娠第1天，妊娠后雌鼠與雄鼠分開隔離飼養(yǎng)。取10只正常妊娠孕鼠作為正常妊娠組，給予生理鹽水灌胃；取50只RAS孕鼠按隨機(jī)區(qū)組法分為5組各10只：自妊娠第1天開始，模型組給予生理鹽水灌胃，地屈孕酮組給予6.18 mg/kg地屈孕酮溶液灌胃，補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組按1∶2∶4比例分別給予7.83 g/kg、15.67 g/kg、31.34 g/kg補(bǔ)腎活血方灌胃，灌胃劑量根據(jù)動(dòng)物體表面積直接換算法[7]計(jì)算，每組灌胃量均稀釋至0.4 mL，每天1次，連續(xù)灌胃14 d。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1血清IL-17、TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值 干預(yù)結(jié)束后4 h，孕鼠眼眶取血，室溫靜置10 min后，3 000 r/min離心10 min，分離血清，參照試劑盒說明采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中IL-17、TGF-β水平，計(jì)算IL-17/TGF-β比值。

1.5.2胚胎吸收率 干預(yù)結(jié)束后4 h，對(duì)各組孕鼠稱重，然后麻醉斷頸處死,無菌狀態(tài)下迅速解剖，暴露子宮，記錄存活胚胎數(shù)(存活胚胎呈粉紅色，飽滿)以及吸收胚胎數(shù)(胚胎體積比存活胚胎明顯縮小，且色暗，或胚胎完全吸收至孕前狀態(tài))，計(jì)算胚胎吸收率[丟失胚胎數(shù)/(丟失胚胎數(shù)+存活胚胎數(shù))×100%]。

1.5.3脾臟細(xì)胞中Th17、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比值 觀察胚胎情況后，無菌狀態(tài)下快速分離各組孕鼠脾臟，充分剪碎，制成勻漿液，用200目孔徑不銹鋼網(wǎng)過濾，分離獲得脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107/mL。取脾臟淋巴細(xì)胞懸液100 μL，加入刺激阻斷合劑佛波酯(終濃度50 ng/mL)、離子酶素(終濃度2 μg/mL)、高爾基體阻斷劑莫能菌素鈉(終濃度3 μg/mL)混合液2 μL， 在37 ℃、5%CO2條件下孵育6 h，PBS漂洗， 1 500 r/min離心，棄上清，加入0.5 μL CD4-FITC，4 ℃避光孵育0.5 h，加入1 mL固定劑，孵育20 min，加入1 mL破膜劑,孵育10 min，再加入0.625 μL 的IL-17抗體，4 ℃避光孵育45 min，PBS緩沖液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+IL-17A+細(xì)胞占 CD4+T 淋巴細(xì)胞的比例即為Th17細(xì)胞比例。同上取各組孕鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液100 μL，加入0.5 μL CD4-FITC 和 0.625 μL PE-Cy5-CD25抗體，4 ℃避光孵育0.5 h，PBS漂洗，固定、破膜，加入5 μL的 Foxp3-PE抗體，4 ℃避光孵育45 min，PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞占CD4+T 淋巴細(xì)胞的比例即為Treg細(xì)胞比例。根據(jù)Th17細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例計(jì)算Th17/Treg比值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均行正態(tài)性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布，則組間兩兩比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)性分布，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。胚胎吸收率采用2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組孕鼠血清IL-17、TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值比較 與正常妊娠組比較，模型組血清IL-17水平及IL-17/TGF-β比值均明顯升高(P均<0.05)，血清TGF-β水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，地屈孕酮組及補(bǔ)腎活血方各組血清IL-17水平及IL-17/TGF-β比值均明顯降低(P均<0.05)，血清TGF-β水平均明顯升高(P均<0.05)；地屈孕酮組和補(bǔ)腎活血方中劑量組血清IL-17水平及IL-17/TGF-β比值均明顯低于補(bǔ)腎活血方低、高劑量組(P均<0.05)，血清TGF-β水平均明顯高于補(bǔ)腎活血方低、高劑量組(P均<0.05)，地屈孕酮組各指標(biāo)與補(bǔ)腎活血方中劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常妊娠組和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)各組孕鼠外周血IL-17、TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值比較

2.2各組孕鼠胚胎吸收率比較 正常妊娠組和模型組孕鼠胚胎吸收率分別為8.57%(6/70)和47.14%(33/70)，模型組明顯高于正常妊娠組(P<0.05)。地屈孕酮組及補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組孕鼠胚胎吸收率分別為12.12%(8/66)、30.00%(18/60)、11.76%(8/68)、26.79%(15/56),均明顯低于模型組(P均<0.05)；補(bǔ)腎活血方低、高劑量組胚胎吸收率均明顯高于地屈孕酮組和補(bǔ)腎活血方中劑量組(P均<0.05)，補(bǔ)腎活血方中劑量組與地屈孕酮組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P>0.05)。

2.3各組孕鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比值比較 與正常妊娠組比較，模型組脾臟淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg比值均明顯升高(P均<0.05)，Treg細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，地屈孕酮組及補(bǔ)腎活血方各組脾臟淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg比值均明顯降低(P均<0.05)，Treg細(xì)胞比例均明顯升高(P均<0.05)；地屈孕酮組和補(bǔ)腎活血方中劑量組脾臟淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg比值均明顯低于補(bǔ)腎活血方低、高劑量組(P均<0.05)，Treg細(xì)胞比例均明顯高于補(bǔ)腎活血方低、高劑量組(P均<0.05)，地屈孕酮組各指標(biāo)與補(bǔ)腎活血方中劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常妊娠組及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)各組孕鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比值比較

3 討 論

目前研究證實(shí)，有50%～60%的RAS是由免疫因素引起的，其分為自身免疫型和同種免疫型，與母胎免疫耐受機(jī)制異常有關(guān)，主要包括人類白細(xì)胞抗原表達(dá)異常，自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能及凋亡異常，補(bǔ)體系統(tǒng)與趨化因子等表達(dá)異常，免疫平衡打破后可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)母胎界面微循環(huán)血栓形成，導(dǎo)致流產(chǎn)[8]。

T淋巴細(xì)胞約占蛻膜免疫細(xì)胞的15%， Th1/Th2平衡是母胎界面免疫耐受機(jī)制中的關(guān)鍵點(diǎn)，成功妊娠者以Th2型優(yōu)勢(shì)免疫為主，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)RAS孕婦也存在Th2免疫優(yōu)勢(shì)[9]，提示這一體系不足以解釋母體與胎兒之間的耐受機(jī)制。張建平教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠者相比，URSA孕婦外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量增加，Treg細(xì)胞數(shù)量減少，Th17/Treg在妊娠中的作用逐漸成為研究焦點(diǎn)[10]。Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞均由CD4+T細(xì)胞分化而來。Treg細(xì)胞在正常妊娠早期的蛻膜組織中已開始增殖，主要通過抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞增殖與細(xì)胞因子產(chǎn)生，抑制B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，抑制樹突狀細(xì)胞成熟等途徑發(fā)揮免疫抑制作用。Th17細(xì)胞具有促炎性作用，在妊娠感染時(shí)，可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，但在Th17免疫優(yōu)勢(shì)下可導(dǎo)致母胎界面中性粒細(xì)胞過度浸潤(rùn)，兩者在功能上相互拮抗，在一定條件下Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞可相互轉(zhuǎn)化。IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌，其是一種對(duì)妊娠免疫極為重要的炎癥介質(zhì)，可通過誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子如IL-6及趨化因子如單核細(xì)胞趨化蛋白1等的表達(dá)，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞在子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)，引起局部炎癥損傷進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)[11]。TGF-β是一類可控制細(xì)胞增殖、識(shí)別、分化和凋亡等過程的細(xì)胞因子，高劑量TGF-β可單獨(dú)刺激初始CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，抑制Th17細(xì)胞的分化，促進(jìn)母胎免疫耐受；低劑量TGF-β與IL-6激活樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23與前列腺素E2協(xié)同刺激初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞過度分化，導(dǎo)致妊娠早期螺旋動(dòng)脈重構(gòu)不完全和胎盤植入淺[12]。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)外源性IL-17可導(dǎo)致CBA/J×BALB/C小鼠模型的流產(chǎn)率提高，抑制TGF-β的表達(dá)，但在小鼠交配前，通過輸注外源性正常孕鼠Treg細(xì)胞可以降低流產(chǎn)率和促進(jìn)TGF-β的表達(dá)，提示IL-17、TGF-β及Th17/Treg細(xì)胞在RAS的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

目前西醫(yī)治療RAS的措施包括黃體支持治療(如黃體酮注射液、地屈孕酮、微?；S體酮膠囊)、增強(qiáng)妊娠免疫應(yīng)答治療(如白細(xì)胞主動(dòng)免疫、免疫球蛋白被動(dòng)免疫)、糖皮質(zhì)激素(如低劑量潑尼松)或免疫抑制劑(如羥氯喹)抑制自身抗體和低分子肝素或阿司匹林抗凝等，治療機(jī)制明確，但存在療程長(zhǎng)、有潛在不良反應(yīng)(如胎兒畸形、產(chǎn)前或產(chǎn)后出血等)、治療效果有限等問題[14]。

中醫(yī)認(rèn)為RAS屬于“數(shù)墮胎”“滑胎”“屢孕屢墮”范疇，最早記載于《諸病源候論》?！夺t(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》記載“若懷胎三、五、七月，無故而胎自墮，至下次受孕亦復(fù)如是，數(shù)數(shù)墮胎，則謂之滑胎”，描述滑胎在臨床為反復(fù)發(fā)生，往往發(fā)生在相近孕期的特點(diǎn)。母體方面病因主要有腎虛、脾虛、氣血虛弱、血熱、血瘀，胎兒方面病因主要有稟賦不足、孕后所傷。腎為先天之本，元?dú)馑冢I主生殖，為胎孕之根本，若母體腎虛，胎失所系，則屢孕屢墮；腎虛則精血乏源、脈道枯竭而致血瘀，脾虛脾氣不足可致血行不暢、脈絡(luò)瘀阻，氣血虛弱則血行不暢、脈道枯竭致瘀，血熱互結(jié)可使血液黏滯而運(yùn)行不暢，或熱灼脈絡(luò)、血溢脈外導(dǎo)致血瘀，最終導(dǎo)致沖任損傷、胎元不固，引起滑胎。羅輝等[15]對(duì)25篇采用活血化瘀法治療RAS的文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)顯示，有13篇文獻(xiàn)報(bào)道患者的中醫(yī)證型有血瘀證。武穎等[16]對(duì)150例RAS患者進(jìn)行中醫(yī)辨證研究，其中腎虛證48例占32.0%，血瘀證52例占34.7%。可見滑胎總病機(jī)以腎虛為本，血瘀為標(biāo)，故治宜補(bǔ)腎、活血。衛(wèi)愛武等[4]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方聯(lián)合主動(dòng)免疫療法能改善URSA 患者的免疫耐受性，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，顯著提高胎兒的存活率。張揚(yáng)等[17]研究證實(shí)，補(bǔ)腎活血方治療URSA的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)蛻膜細(xì)胞中TNFR1、P110、Bcl-xl表達(dá)有關(guān)。金志春等[18]研究表明補(bǔ)腎活血中藥能通過降低生殖免疫抗體滴度或者使其轉(zhuǎn)陰而提高妊娠率及妊娠成功率。本實(shí)驗(yàn)所用補(bǔ)腎活血方以壽胎丸合丹參、川芎補(bǔ)腎活血兼顧，壽胎丸中菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠配伍補(bǔ)腎填精、滋陰養(yǎng)血，共奏補(bǔ)腎安胎之效；相關(guān)研究證實(shí)，壽胎丸可以增加體內(nèi)雌孕激素水平，促進(jìn)人絨毛膜促性腺激素的分泌，調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖，可增強(qiáng)母體保護(hù)性免疫功能[19-21]。丹參活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛，廣泛用于血瘀證，為調(diào)經(jīng)要藥，中醫(yī)有“一味丹參散，功同四物之說”；川芎行氣活血止痛，善通達(dá)氣血，為“血中氣藥”。丹參、川芎可降低血液黏度與血流阻力，調(diào)節(jié)免疫紊亂，抑制炎癥因子產(chǎn)生、抗原抗體反應(yīng)及抗心磷脂抗體的形成，促進(jìn)抗原抗體復(fù)合物吸收[6，22-23]。相比西醫(yī)療法，中醫(yī)補(bǔ)腎活血方中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑作用優(yōu)勢(shì)。

CBA/J和DBA/2小鼠屬于近交品系，CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠交配作為研究URAS動(dòng)物模型已被運(yùn)用多年[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地屈孕酮及低、中、高劑量均可明顯降低孕鼠血清IL-17水平及IL-17/TGF-β比值、胚胎吸收率、脾臟淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例和Th17/Treg比值，提高血清TGF-β水平及脾臟淋巴細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例，使Th17/Treg平衡趨向正常妊娠孕鼠；補(bǔ)腎活血方中劑量療效與地屈孕酮療效相似，中劑量補(bǔ)腎活血方恰等同于臨床成人用藥劑量；低劑量可能因?yàn)樗幬餄舛炔粔?，高劑量可能因藥物濃度過高，方中丹參太過寒涼，且高濃度藥物在灌胃過程中阻力較大，可能傷及小鼠消化道而影響胃消化吸收功能，故均未達(dá)到理想的治療效果。

綜上所述，妊娠早期補(bǔ)腎活血方可能通過促進(jìn)免疫抑制因子Treg細(xì)胞、TGF-β生成，抑制促炎相關(guān)免疫因子IL-17及Th17細(xì)胞生成，維持免疫微環(huán)境平衡，誘導(dǎo)母胎免疫耐受，進(jìn)而改善RSA孕鼠妊娠結(jié)局。該實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究補(bǔ)腎活血方具體的作用靶點(diǎn)提供了一定基礎(chǔ)，但是RSA涉及的免疫因素復(fù)雜，還需更深入地探索其機(jī)制，且其應(yīng)用劑量仍有待進(jìn)一步明確。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。