李 霞，周立群，徐 林，王興建，田向東，王 立,4，耿少輝，蔣海旭，許 恒，趙吉平

(1. 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2. 北京中醫(yī)藥大學武當醫(yī)學研究院，北京 100029；3. 北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029；4. 安元全律(北京)醫(yī)學研究院，北京 100055；5. 北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 102446)

骨折是指骨的連續(xù)性與完整性中斷，無論是保守治療還是手術治療，促進骨折愈合均是骨折治療的核心內(nèi)容[1]。電針輔助治療骨折的臨床研究早在60年代就已開展[2]，隨后大量的臨床研究證明電針能夠促進骨折愈合，并從形態(tài)學、血液流變學、微量元素及骨折局部分子生物學的角度對電針促進骨折愈合的機制展開了探討[3-5]，但其具體的作用機制尚未完全揭示?，F(xiàn)代研究顯示，腎臟眾多信號通路在骨折愈合過程中激活，表明腎臟與骨折的發(fā)生和愈合密切相關[6-7]?；诖?，本實驗基于轉錄組測序技術研究了電針治療能否通過激活腎臟相關信號通路來促進骨折愈合，以期從新的角度揭示電針促進骨折愈合的分子機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性新西蘭兔42只，清潔級，體重2.5～3 kg，購自北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，合格證號：110323210100040242。動物室內(nèi)溫度20～25 ℃，相對濕度40%～50%。實驗兔由專一實驗人員進行飼喂，每天定量飲食飲水。本實驗通過北京中醫(yī)藥大學學術委員會實驗動物倫理委員會審查(BUCM-4-2021022701-1092)。

1.2主要實驗儀器及試劑 PVC兔子固定盒(河南智科弘潤環(huán)?？萍加邢薰?，韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-200A，南京濟生科技有限公司)，無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，咬骨鉗(滄州市佳誼五金工具制造有限公司)，外科手術剪(邦標醫(yī)療科技(廣州)有限公司)，手術鑷(邦標醫(yī)療科技(廣州)有限公司)；注射用頭孢西丁鈉(齊魯制藥有限公司)，安爾碘皮膚消毒液(上海利康消毒高科技有限公司)，氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司)，兔生長繁殖飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)，多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3實驗方法 將實驗兔隨機分為正常組6只、骨缺損組18只、電針組18只。骨缺損組和電針組建立骨缺損模型：按30 mg/kg 體重耳緣靜脈注射3 %戊巴比妥鈉溶液麻醉兔，手術區(qū)域脫毛后，將兔仰臥位固定在臺上，碘伏消毒3遍，鋪無菌洞巾，暴露出右前肢中段橈骨背側，做2 cm縱向切口，依次切開皮膚、皮下，充分顯露橈骨中段，于旋前圓肌止點下手術刀切開骨膜，剝離1 cm，用咬骨鉗造成寬約3 mm深入髓腔骨質(zhì)缺損區(qū)，注意避開重要血管和神經(jīng)。生理鹽水沖洗，逐層縫合皮下組織、皮膚，紗布包扎，膠帶固定。術后肌肉注射頭孢西丁鈉(1 g頭孢西丁鈉加100 mL生理鹽水)1次，4 mL/只。電針組于術后當天開始進行電針干預：參照《實驗針灸學》[8]與《動物針灸學》[9]定位合谷穴(前肢背側，第2掌骨橈側中點處)、曲池穴(前肢背側，肱骨外上髁內(nèi)側凹陷處)，毫針向骨缺損部位斜刺進針0.5～1.0 cm，然后接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，采用疏密波，設定頻率2/100 Hz、電流2.1 mA，以局部皮膚肌肉微顫為度，留針30 min，1次/d，持續(xù)干預4周。

1.4觀察指標及方法

1.4.1骨愈合情況 分別在實驗1，2，4周末對骨缺損組與電針組兔前肢進行X射線平掃，由北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院的2位影像科醫(yī)生雙盲法閱片，并采用Lane-Sandhu X射線評分標準對骨形成、骨連接、骨塑形3個方面(11項)進行評分，取平均值。①骨形成：0分，無骨形成；1分，骨形成占缺損25%；2分，骨形成占缺損50%；3分，骨形成占缺損75%；4分，骨形成滿缺損。②骨連接：0分，骨折線清楚；2分，骨折線部分存在；4分，骨折線消失。③骨塑形：0分，未見骨塑形；2分，骨髓腔形成；4分，皮質(zhì)骨塑形。

1.4.2腎臟組織轉錄組測序(RNA-seq)及功能富集分析 于實驗2周末，從3組中各隨機選取3只兔，耳緣靜脈注射3 %戊巴比妥鈉溶液麻醉后，開腹取雙側腎臟，切小塊放入凍存管，保存在-80 ℃冰箱，樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行基因測序。① RNA-seq方法：從組織樣本中提取總RNA，用Nanodrop2000檢測提取的RNA的濃度和純度。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，使用Agilent 2100測定RNA完整性數(shù)值(RIN)。單文庫構建需要總RNA ≥ 1 μg，濃度≥ 35 ng/μL，OD260/280 ≥ 1.8，OD260/230 ≥ 1.0。根據(jù)制造商提供的方案，使用Ion total RNA-Seq Kit v2(Life Technologies，美國)制備每個RNA樣品的測序文庫。根據(jù)標準測序方案，使用Illumina NovaSeq 6000對cDNA文庫進行測序。②差異基因表達分析：采用Fast-QC軟件評估數(shù)據(jù)質(zhì)量，包括堿基質(zhì)量值的分布、GC含量、PCR重復的比例、K-mer的頻率，使用Mapsplicing作為RNA-seq讀取映射分析工具來識別外顯子-外顯子剪接，最后應用 DESeq2過濾差異表達的基因。統(tǒng)計分析后，按照差異倍數(shù)≥2或≤0.5和P<0.05的標準篩選差異表達基因(DEGs)。③功能富集分析：根據(jù)基因注釋和功能數(shù)據(jù)庫，用基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析DEGs的生物學功能。使用基因百科全書KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫對DEGs進行通路分析，識別DEGs的顯著通路。采用Fisher精確概率檢驗和2檢驗對GO術語進行分類，選擇P<0.05的GO和通路類別進一步分析。

2 結 果

2.1X射線骨形成、骨連接、骨塑形評分比較 實驗1，2，4周末，電針組骨形成評分、骨連接評分、骨塑形評分均較同期骨缺損組高，但僅2周末時骨塑形評分與骨缺損組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 骨缺損組和電針組兔X射線骨形成、骨連接、骨塑形評分比較分)

2.2腎臟中RNA-seq基因表達情況 與正常組相比，骨缺損組共鑒定出454個DEGs，其中上調(diào)基因255個，下調(diào)基因199個，見圖1。與骨缺損組相比，電針組共鑒定出444個DEGs，其中上調(diào)基因179個，下調(diào)基因265個，見圖2。正常組與骨缺損組間有98個DEGs顯著差異表達，骨缺損組與電針組間這98個DEGs也顯著差異表達，Venn圖顯示見圖3。骨缺損組與電針組間的50個DEGs聚類熱圖見圖4。電針組和正常組鈣感應受體 (Calcium Sensing Receptor，CASR) 基因相對表達量均明顯低于骨缺損組(P均<0.05)，見圖5。

綠點表示與正常組相比，骨缺損組上調(diào)的基因(255個)；紅點表示與正常組相比，骨缺損組下調(diào)的基因(199個)

綠點表示與骨缺損組相比，電針組下調(diào)的基因(265個)；紅點表示與M組相比，EL組上調(diào)的基因(179個)

圖3 不同組間兔腎臟中差異基因的Venn圖

圖4 骨缺損組與電針組間兔腎臟中50個差異表達基因的聚類熱圖

圖5 不同組間兔腎臟中鈣感應受體(CASR)基因相對表達量

2.3腎臟中DEGs的GO分析

2.3.1正常組和骨缺損組間腎臟中的DEGs 生物過程主要富集在代謝與刺激反應的過程，如蛋白水解的負調(diào)控(negative regulation of proteolysis)、極低密度脂蛋白顆粒重塑的調(diào)控(regulation of very-low-density lipoprotein particle remodeling)和對外部刺激的反應(response to external stimulus)等；細胞組分主要富集在細胞外空間(extracellular space)、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix)和酶原顆粒膜(zymogen granule membrane)等；分子功能(molecular function)主要富集在鈣激活鉀通道活性(calcium-activated potassium channel activity)、肝素結合(heparin binding)和鈣激活的陽離子通道活性(calcium activated cation channel activity)等生物功能中。見圖6。

橫條表示GO富集條目的顯著性水平(上橫坐標);方塊表示GO富集條目中的基因數(shù)量

2.3.2電針組和骨缺損組間腎臟中的DEGs DEGs主要參與的生物過程和分子功能為磷酸鹽代謝過程的調(diào)節(jié)(regulation of phosphate metabolic process)、磷代謝過程的調(diào)節(jié)(regulation of phosphorus metabolic process)、參與骨成熟的骨礦化調(diào)節(jié)(regulation of bone mineralization involved in bone maturation)、細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)(cellular calcium ion homeostasis)、鈣離子穩(wěn)態(tài)(calcium ion homeostasis)、鈣離子結合(calcium ion binding)、細胞溶質(zhì)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)(regulation of cytosolic calcium ion concentration)。見圖7。

橫條表示GO富集條目的顯著性水平(上橫坐標);方塊表示GO富集條目中的基因數(shù)量

2.4腎臟中DEGs的KEGG通路分析 正常組和骨缺損組間的DEGs富集在過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路(PPAR signaling pathway)、甘氨酸(Glycine)、絲氨酸(serine)和蘇氨酸代謝(threonine metabolism)、抗原加工和呈遞(antigen processing and presentation)、補體和凝血級聯(lián)(complement and coagulation cascades)、細胞色素P450對異生素的代謝(metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)等通路中，見圖8。電針組和骨缺損組間的DEGs富集在PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、膽固醇代謝(cholesterol metabolism)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、補體和凝血級聯(lián)(complement and coagulation cascades)、乳腺癌(breast cancer)、JAK-STAT信號通路(JAK-STAT signaling pathway)等，見圖9。

氣泡形狀越大表示KEGG通路中富集的基因數(shù)量越多,氣泡顏色越紅表示通路富集程度越顯著

氣泡形狀越大表示KEGG通路中富集的基因數(shù)量越多,氣泡顏色越紅表示通路富集程度越顯著

3 討 論

電針促進骨折愈合的療法已得到臨床證實，本研究根據(jù)臨床經(jīng)驗，在新西蘭兔橈骨中段建立骨缺損模型，選擇合谷與曲池穴進行電刺激，基于轉錄組測序技術檢測腎臟中相關基因表達情況，探討電針促進新西蘭兔骨缺損愈合的作用機制。選穴中合谷為陽明大腸經(jīng)腧穴、原穴，可調(diào)氣活血，振奮整體功能[8]。曲池為手陽明大腸經(jīng)腧穴、合穴，按“合治內(nèi)腑”之理，具有通調(diào)臟腑、調(diào)氣和血消腫之功。曲池走而不守，合合谷生而能散，共奏調(diào)氣活血、消腫鎮(zhèn)痛之功。針刺時參考文獻[9]設定特定頻率和電流強度，以刺激增強穴位效應。結果顯示，電針組2周末時骨塑形評分明顯高于骨缺損組，證實電針可促進新西蘭兔橈骨骨缺損的愈合。

中醫(yī)學認為骨折的愈合過程與五臟生理功能密切相關，其中腎主骨生髓，髓充于骨，骨骼得養(yǎng)，腎氣盛則髓骨堅硬凝而輕利[10]。中醫(yī)學概念中的腎是一個以解剖腎為中心，與膀胱、骨、髓、腦、頭發(fā)、耳、前后二陰等密切相關的功能系統(tǒng)，本實驗中選取了解剖上的腎臟研究腎主骨的功能。

腎臟是一個鈣敏感器官，能夠感知尿和血清鈣水平的變化。CASR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，可調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素釋放和尿鈣排泄，在鈣離子穩(wěn)態(tài)和細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)通路中發(fā)揮調(diào)控鈣離子穩(wěn)態(tài)的作用，是腎臟中調(diào)控和維持鈣穩(wěn)態(tài)的重要基因[11-12]。CASR在腎細胞的表面高度表達[13]，其通過感受血清鈣的變化而調(diào)節(jié)鈣的重吸收，在腎臟鈣處理中起著重要作用[14]。CASR不僅可通過腎臟髓襻升支粗段介導的細胞外鈣轉運調(diào)控直接參與細胞外鈣水平的調(diào)控，還可以通過緊密連接蛋白的密蛋白家族(CLDN)的幾個成員(CLDN14、CLDN16和CLDN19)直接調(diào)節(jié)Ca2+和Mg2+滲透性[15-17]。相關實驗研究證明，小鼠腎小管中CASR特異性表達的缺失會導致尿中鈣含量減少，且CASR的主要作用是以非甲狀旁腺素的方式抑制鈣的重吸收，其部分通過CLDN14的下調(diào)和SLC12A1的激活來發(fā)揮對鈣重吸收的抑制作用[18]。

本研究腎臟組織轉錄組測序結果顯示，正常組與骨缺損組共有454個DEGs，骨缺損組與電針組共有444個DEGs，骨缺損組與電針組間有98個DEGs顯著差異表達；電針組和正常組CASR基因相對表達量均明顯低于骨缺損組；GO富集分析發(fā)現(xiàn)電針組和骨缺損組間的DEGs主要參與的生物過程和分子功能為細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、鈣離子穩(wěn)態(tài)、鈣離子結合和細胞溶質(zhì)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。提示電針促進骨折愈合的機制可能與調(diào)控腎臟CASR基因的表達和鈣離子穩(wěn)態(tài)通路密切相關。

綜上所述，電針可能通過下調(diào)腎臟中CASR基因的表達，調(diào)控鈣離子穩(wěn)態(tài)通路，促進腎臟中鈣離子的重吸收，進而促進骨折的愈合。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。