陳高峰，麥靜愔，陳 澍，柯碧蓮，王浩藝，譚英姿，陳天陽，成 揚

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2. 上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200052；3. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040；4. 上海市第一人民醫(yī)院，上海 200080)

肝硬化患者主要表現(xiàn)為肝細胞功能障礙與門靜脈高壓癥，門靜脈高壓癥最主要后果是食管和胃底靜脈曲張破裂導(dǎo)致的上消化道出血[1]。肝硬化門靜脈高壓癥的防治一直是臨床難題，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在血流動力學(xué)水平上嘗試建立了一些治療方法，如使用β受體阻滯劑和5-單硝酸異山梨醇酯、經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門腔靜脈分流術(shù)等，雖然這些方法能在一定程度上緩解門脈高壓，但是上述治療措施對引起門脈高壓的根本原因即肝纖維化沒有治療作用，相反因肝臟血流量不增加甚或減少，實際對肝損傷的修復(fù)反而有害[2-3]?；诟斡不疤摀p生積”理論的指導(dǎo)[3-4]，課題組發(fā)現(xiàn)重用補益虛損方藥黃芪湯促進機體精氣來復(fù)、形質(zhì)虧損的修復(fù)，可明顯縮短乙型肝炎后肝硬化伴輕中度食管胃靜脈曲張患者的門靜脈直徑，降低食管靜脈曲張Palmer評分[5]。本實驗通過復(fù)制膽管結(jié)扎大鼠肝硬化模型，觀察該方對肝組織膠原沉積和肝竇毛細血管化標志物表達的影響，旨在進一步研究該方的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性SPF級Wistar大鼠50只，體重(240±30)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCX(滬)2017-0005。自由進食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進行實驗。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(PZSHUTCM2019041835)。

1.2藥物、試劑和主要儀器 黃芪湯由炙黃芪30 g、炙甘草5 g組成，委托江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司制作顆粒劑。蘇木素復(fù)染液：生工生物工程(上海)股份有限公司；OCT 包埋劑：美國Sacura公司；Trizol提取試劑盒：美國Invitrogen公司；Real-time PCR試劑盒：上海索萊寶公司；戊巴比妥鈉：美國Sigma公司；SYBR Green PCR Master Mix：Thermo Fisher Scientific公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連寶生物公司；Ⅰ型膠原(Col-I)抗體、血管內(nèi)皮標志物分化抗原簇31(CD31)抗體和Ⅱ抗：武漢博士德公司；血清肝功能試劑盒：南京建成生物工程研究所；分析天平：德國Satorius公司；RM2035輪轉(zhuǎn)切片機、EMUC7冰凍切片機、ASP300自動脫水機、EG1160石蠟包埋機：德國Leica公司；Real-time PCR系統(tǒng)：美國Applied Biosystems公司。

1.3實驗方法 選取10只雄性Wistar大鼠作為假手術(shù)組，選取40只雄性Wistar大鼠進行肝硬化造模。造模方法參考文獻[6]：大鼠稱重麻醉后固定，皮膚消毒，開腹暴露肝臟，在門靜脈附近找到膽總管，使用手術(shù)縫線雙重結(jié)扎，然后切斷膽管，關(guān)腹消毒切口。假手術(shù)組大鼠開腹后僅牽引膽管，不進行離斷結(jié)扎等處理，其余處理同造模大鼠。造模1周后將大鼠隨機分為4組各10只，黃芪湯低、中、高劑量組分別按照人體用量的3.5倍、7倍、14倍給予黃芪湯0.35，0.70，1.40 g/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃4周。

1.4檢測指標及方法

1.4.1血清肝功能指標 實驗結(jié)束，大鼠麻醉后下腔靜脈取血，采用賴氏法檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，采用嗅甲酚綠法檢測白蛋白(ALB)水平，采用苯甲酸鈉-咖啡因比色法檢測總膽紅素(TBil)水平。

1.4.2肝組織病理學(xué)觀察 取血后處死大鼠，摘取肝組織，經(jīng)10%福爾馬林固定后石蠟包埋并切片，65 ℃烤箱烤片，二甲苯及無水乙醇逐級脫蠟后進行HE染色，鏡下觀察。

1.4.3肝組織中Col-I和CD31表達情況 參考文獻[7]，采用免疫組織化學(xué)染色法觀察：烤切片，65 ℃ 60 min；石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)，微波爐抗原修復(fù)；3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加相應(yīng)一抗，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，4 ℃冰箱孵育過夜，次日37 ℃水浴箱復(fù)溫45 min；滴加相應(yīng)二抗，37 ℃孵育20 min；新鮮配制的DAB避光顯色3 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.4肝組織中Col-I、CD31、vWF mRNA表達情況 采用Real-time PCR檢測：參考文獻[8]，Trizol法提取肝組織總RNA，采用試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成反應(yīng)體系：4 μL 5 x RT Buffer、1 μL RT Enzyme Mix、1 μL Primer Mix、4 μL抽提的 RNA模板、7 μL DEPC水，混勻后放置于PCR儀之中，反應(yīng)條件為37 ℃ 30 min和85 ℃ 5 s。Real-time PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL(1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、10 μL SYBR Green、1 μL DNA溶液和7 μL滅菌水)。引物序列：Col-I上游引物5’-TGTCTGGTTTGGAGAGAGCA -3’,下游引物5’- AGTGATAGGTGATGTTCTGGGA -3’，引物長度140 bp；CD31上游引物5’-ACCAACAGCCATTACGACTC -3’,下游引物5’-GTTCCATCAAGGGAGCCTTC-3’，引物長度105 bp；vWF上游引物5’-GGTTGACTTATGCACGACCT-3’,下游引物5’-CAGCATTCGCTCTGACTCTT-3’， 引物長度135 bp； GAPDH上游引物5’-CCGCATCTTCTTGTGCAGTG-3’,下游引物5’-GTTGATGGCAACAATGTCCAC-3’， 引物長度138 bp。擴增循環(huán)反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 min，然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參照，目的基因的表達使用2-△△Ct法進行計算分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝功能指標比較 實驗期間，模型組死亡2只，黃芪湯低劑量組死亡1只，其余各組大鼠無死亡。模型組大鼠血清ALT、AST、TBil水平均顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)，血清ALB水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)；黃芪湯各組大鼠血清ALT、AST、TBil水平均顯著低于模型組(P均<0.05)，血清ALB水平均顯著高于模型組(P均<0.05)，且黃芪湯高劑量組各指標改善情況均顯著優(yōu)于黃芪湯低、中劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 假手術(shù)組及肝硬化各組大鼠血清肝功能指標水平比較

2.2各組大鼠肝組織HE染色表現(xiàn) 假手術(shù)組大鼠的肝臟小葉結(jié)構(gòu)正常清晰，肝細胞索圍繞中央靜脈四周呈放射狀排列，所有匯管區(qū)、中央靜脈和膽管結(jié)構(gòu)正常，未見肝細胞變性壞死；模型組大鼠肝內(nèi)發(fā)現(xiàn)數(shù)量較多的小膽管增生，尤其是門脈區(qū)觀察到大量纖維結(jié)締組織增生，纖維間隔向肝小葉內(nèi)伸展，在膽管上皮細胞周圍發(fā)現(xiàn)聚集的成纖維細胞和大量沉積的細胞外基質(zhì)，假小葉形成；與模型組比較，黃芪湯各組大鼠肝內(nèi)小膽管、成纖維細胞和膠原纖維明顯減少，其中黃芪湯高劑量組病變最輕。見圖1。

圖1 假手術(shù)組及肝硬化各組大鼠肝組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組大鼠肝組織Col-I免疫組化染色情況 假手術(shù)組大鼠僅在中央靜脈及匯管區(qū)周圍見極微量Col-I沉積；模型組大鼠肝組織中有大量Col-I沉積，尤其在增生膽管周圍、纖維間隔周圍更明顯；黃芪湯各組大鼠Col-I沉積較模型組明顯減少，其中黃芪湯高劑量組沉積最少。見圖2。

圖2 假手術(shù)組及肝硬化各組大鼠肝組織Col-I免疫組化染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組大鼠肝組織CD31免疫組化染色情況 假手術(shù)組肝組織未見陽性染色；模型組在增生膽管周圍、小葉中央靜脈周圍、匯管區(qū)見細胞質(zhì)黃色或者棕黃色顆粒(CD31陽性表達)；與模型組比較，黃芪湯各組CD31陽性表達有不同程度減少，其中黃芪湯高劑量組表達最少。見圖3。

圖3 假手術(shù)組及肝硬化各組大鼠肝組織CD31免疫組化染色表現(xiàn)(×200)

2.5各組大鼠肝組織中Col-I、CD31和vWF mRNA表達情況 模型組大鼠肝組織中Col-I、CD31和vWF mRNA相對表達量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；黃芪湯各組大鼠肝組織中Col-I、CD31和vWF mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且黃芪湯高劑量組均明顯低于黃芪湯低、中劑量組(P均<0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組及肝硬化各組大鼠肝組織中Col-I、CD31和vWF mRNA相對表達量比較

3 討 論

上消化道出血是肝硬化門靜脈高壓癥患者的主要死亡原因，患者靜脈曲張的前2年出血的風(fēng)險為25%～35%，首次出血病死率高達30%～50%，大部分患者由于無法控制的出血而死亡[1]。目前的西醫(yī)用藥存在禁忌證和耐藥性等問題，只推薦用于預(yù)防中重度食管靜脈曲張患者的首次出血或再出血；經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門腔靜脈分流術(shù)存在一些并發(fā)癥，僅在反復(fù)急性上消化道出血或急性出血內(nèi)科保守治療無效時應(yīng)用[2]。針對臨床實踐中肝硬化門靜脈高壓癥治療和預(yù)防存在的困境，從傳統(tǒng)中醫(yī)寶庫中發(fā)掘治療方法和措施，無疑是一項十分有益的舉措。

肝硬化屬于中醫(yī)“積證”的范圍，近20年來，中醫(yī)藥抗肝纖維化取得了顯著成效[9]。上海中醫(yī)藥大學(xué)2010年10月結(jié)題的國家重點基礎(chǔ)研究973計劃“肝硬化虛損生積的中醫(yī)病因?qū)W研究”課題結(jié)果顯示，黃芪湯治療48周，纖維化S4期慢性乙型肝炎肝硬化代償期患者肝纖維化改善率為53.6%，肝組織匯管區(qū)炎癥和碎屑狀壞死改善率分別為71.4%和57.1%，與扶正化瘀方療效無顯著差異；黃芪湯的作用主要表現(xiàn)在抑制肝細胞壞死和改善肝硬化肝功能方面，而扶正化瘀方的作用主要表現(xiàn)在影響纖維組織代謝上。說明益氣補虛的黃芪湯在肝硬化的治療中有較好的療效和明顯特點[3-4]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，黃芪湯可有效改善乙肝肝硬化患者肝功能，縮短門靜脈直徑，改善食管胃靜脈曲張程度[5，10]。

肝纖維化是肝損傷后的修復(fù)性應(yīng)答。各種損肝因素導(dǎo)致肝損傷時，相關(guān)細胞分泌多種細胞因子，經(jīng)旁分泌和自分泌的形式激活肝星形細胞，致使其分泌大量細胞外基質(zhì)(ECM)，導(dǎo)致ECM的生成大于降解，ECM過度沉積，從而引起肝竇毛細血管化，使肝纖維化形成并進一步發(fā)展。肝竇毛細血管化是肝纖維化及肝硬化過程中的一個特征性病變，主要包括肝竇內(nèi)皮細胞的去窗孔化、表型的改變和內(nèi)皮下基底膜的形成，使肝臟微循環(huán)的功能發(fā)生改變并促進肝纖維化的形成，并且與門靜脈高壓的形成密切相關(guān)，因此肝竇內(nèi)皮細胞在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要地位[11-12]。在肝竇毛細血管化病變中，肝竇內(nèi)皮細胞會表達vWF和血管內(nèi)皮標志物CD31[13-14],二者是反映肝竇毛細血管化的重要客觀分子指標。

本實驗結(jié)果顯示，膽管結(jié)扎模型組大鼠出現(xiàn)肝臟功能異常，血清ALB水平顯著下降；肝臟組織中假小葉形成，出現(xiàn)大量增生的肝內(nèi)小膽管，在膽管上皮細胞周圍聚集了大量成纖維細胞和堆積的細胞外基質(zhì)，特別是Col-I大量沉積；肝臟組織中Col-I、CD31和vWF mRNA 相對表達量均明顯增高。而黃芪湯各組肝功能指標、肝臟組織病理改變均明顯改善，肝臟組織中Col-I和CD31沉積均明顯減少， Col-I、CD31和vWF mRNA 相對表達量均明顯降低，尤其是黃芪湯高劑量組各指標改善最明顯。提示黃芪湯能夠下調(diào)CD31和vWF的表達，減輕肝竇內(nèi)皮細胞毛細血管化的程度，從而起到較好的抗肝纖維化作用。

總之，由于肝纖維化、肝硬化病理機制復(fù)雜，研究多途徑、多靶點的治療方法將成為發(fā)展趨勢。綜合本實驗結(jié)果及課題組前期開展的中醫(yī)藥抗肝纖維化、逆轉(zhuǎn)部分早期肝硬化以及改善失代償期肝硬化肝功能的治療實踐[3，5，10]，說明黃芪湯具有良好的應(yīng)用和研究前景。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。