勞慧敏，陳夢琦，劉宣妤，李麗博，尹訓君

(1. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011；2. 山東大學臨床醫(yī)學院，山東 濟南 250011；3. 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014；4. 山東博奧克生物科技有限公司，山東 聊城 252000)

支氣管哮喘簡稱哮喘，是一種兒童時期常見的呼吸道疾病，其特征是不可逆的氣流阻塞、氣道炎癥和氣道高反應性[1]。近年來，兒童哮喘的發(fā)病率逐年攀升，從2010年的3.02%上升至4%左右，嚴重危害兒童身心健康[2-3]。氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的兩個主要病理特征[4]，其中氣道重塑是哮喘難以根治的重要原因[5]。研究表明，氣道重塑與上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有密切聯(lián)系[6]，EMT是氣道重塑的重要標志[7-8]。目前，皮質類固醇是控制哮喘發(fā)作的最有效藥物[9]，但是部分患者存在耐藥[10]，且治療時間長、依從性差，導致哮喘反復發(fā)作，遷延難愈。近年來，中醫(yī)藥治療哮喘凸顯優(yōu)勢。本課題組通過多年工作積累，根據(jù)兒童哮喘慢性持續(xù)期病理特點，提出“脾虛-痰瘀互結”為哮喘的主要病機，凝練出具有益氣健脾、化痰通絡功效的健脾防哮方，前期研究已證實該方可有效減輕哮喘緩解期患兒氣道阻塞，恢復小氣道功能，改善哮喘小鼠氣道重塑。本實驗從上皮間質轉化標志蛋白表達入手，探討了健脾防哮方減輕哮喘EMT的效應機制，以為哮喘防治提供新思路和有效的實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 8周齡SPF級雄性Balb/c小鼠，體重20～25 g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號：SCXK(魯)2019-0003，由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)。環(huán)境溫度為(22±2)℃，濕度為40%～60%，實驗動物自由飲水攝食，12 h明暗交替。本實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動物實驗中心實驗倫理委員會審查批準(AWE-2019-050)，符合動物倫理學要求。

1.2藥物及試劑 健脾防哮方由黃芪15 g、清半夏15 g、陳皮15 g、茯苓9 g、當歸9 g、烏梅6 g組成，中藥飲片均購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室代煎濃縮成1.05 g/mL，置4 ℃冰箱中冷藏備用。卵清蛋白(美國Sigma公司，批號：A5378)；地塞米松(美國Sigma公司，批號：D4902)；蘇木素染液套裝(武漢谷歌生物科技有限公司，貨號：G1005)；Masson三色染色液(武漢谷歌生物科技有限公司，貨號：G1006)；E-鈣黏素(E-cadherin)抗體(PTG，貨號：20874-1-AP)；alpha smooth muscle Actin Rabbit mAb(博奧森，貨號：bsm-33187M)；N-鈣黏素(N-cadherin) Rabbit pAb(ABclonal，貨號：A19083)；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(Vazyme，貨號：R401-01)；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，貨號：R223-01)；ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，貨號：R311-02)；BCA Protein Assay Kit(Cwbio，貨號：CW00145)；E-cadherin(24E10)Rabbit mAb(CST，貨號：#3199)；N-cadherin(D4R1H)XP?Rabbit mAb(CST，貨號：#13116)；a-Smooth Muscle Actin (D4K9N)XP?(CST，貨號：#19245)。

1.3儀器 壓縮機霧化器(歐姆龍，型號：NE-C900)；正置光學顯微鏡(日本尼康，型號：A19083)；醫(yī)用離心機(湘儀，型號：TGL-16M)；多功能酶標儀(synergy)；0.45um PVDF膜(Milipore，貨號：IPVH00010)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016)；脫水機、包埋機(武漢俊杰電子有限公司，型號分別為JJ-12J，JB-P5)；組化筆(Gene tech，型號：GT1001)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad，型號：CFX96 Touch)；電泳儀(BIO-RAD，型號：PowerPac Basic)；凝膠成像系統(tǒng)(CE，型號：AI600BGB)。

1.4實驗方法 小鼠于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗中心動物室內適應性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字法分為正常組、模型組、健脾防哮方低劑量組、健脾防哮方中劑量組、健脾防哮方高劑量組和地塞米松組，每組10只，以耳標進行數(shù)字標記。除正常組外，其余組小鼠參照Flanagan等[11]造模方法并加以改進制備哮喘模型：第1，7，14天腹腔注射0.1 mL致敏液(生理鹽水0.1 mL+卵蛋白0.05 mg+氫氧化鋁1 mg)；從第22天開始，將致敏小鼠放置于自制動物霧化箱內，使用1%的卵蛋白霧化液(卵蛋白0.1 g+生理鹽水10 mL)加壓霧化激發(fā)30 min，隔日1次，共4周。各藥物組于第22天開始加壓霧化激發(fā)前灌胃給藥，藥物劑量根據(jù)小鼠與人給藥劑量比值9.1∶1，按照成人60 kg體重等倍劑量換算。正常組及模型組給予25 mL/(kg·d)蒸餾水灌胃, 健脾防哮方低、中、高劑量組分別給予5.233 g/(kg·d)、10.465 g/(kg·d)、20.93 g/(kg·d)健脾防哮方灌胃，地塞米松組給予地塞米松0.5 mg/(kg·d)灌胃，均持續(xù)4周。

1.5檢測指標和方法 末次干預結束后，各組小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，仰臥固定小鼠，取出肺臟，右肺PBS緩沖液迅速沖洗后，立即置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、組織切片后，進行HE、Masson染色和免疫組化檢測；左肺迅速置于液氮罐，后轉移至-80 ℃冰箱存放，進行Real-time PCR檢測和Western blot檢測。

1.5.1肺組織病理形態(tài)學觀察 將4%多聚甲醛固定的肺臟組織進行梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制片，在病理切片機上5 μm連續(xù)切片，進行HE和Masson染色，110倍觀察全視野，并置于200倍、400倍光學顯微鏡下觀察肺組織及氣管病理變化。

1.5.2肺組織中E-cadherin、N-cadherin和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達免疫組化檢測 石蠟切片經(jīng)脫蠟復水，組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。切片放入3%過氧化氫溶液孵育25 min，阻斷內源性過氧化物酶；血清封閉加一抗(E-cadherin，1∶500；N-cadherin，1∶1 000；α-SMA，1∶1 000)，孵育過夜，PBS洗滌后，加HRP-Goat&Rab IgG(1∶200)，室溫孵育50 min。經(jīng)3次5 min洗滌，滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。經(jīng)Harris蘇木素復染細胞核，酒精、二甲苯Ⅰ脫水，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。

1.5.3肺組織中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表達Western blot檢測 取-80 ℃凍存的肺組織30 mg，加入RIPA緩沖液和PMSF快速勻漿，冰上裂解20 min， 4 ℃下12 000 r/min離心15 min，吸取總蛋白，定量后根據(jù)BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書測定蛋白濃度。在10%丙烯酰胺凝膠上用SDS-PAGE電泳分離，電轉至0.45 μm PVDF 膜上；用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，分別加入E-cadherin一抗(1∶3 000)、N-cadherin一抗(1∶2 000)、α-SMA一抗(1∶200)、β-actin內參(1∶5 000)，于 4 ℃孵育過夜。TBST洗滌5次，每次5 min，在室溫下分別加入山羊抗兔IgG二抗與山羊抗小鼠IgG二抗(均1∶5 000)孵育1 h后，ECL顯影法曝光顯色并進行灰度值測定，結果以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示。

1.5.4肺組織中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA mRNA表達Real-time PCR檢測 用RNA分離總RNA提取試劑，采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix進行cDNA反轉錄，后進行Real-time PCR反應，將GAPDH作為內參。反應體系包括2×Master Mix 10 μL，10 μmol/L的PCR特異引物F 0.50 μL，10 μmol/L的PCR特異引物R 0.50 μL，加水至總體積為18 μL，將18 μL混合液加到PCR板對應的每個孔中，再加入對應的2 μL的cDNA。反應條件：95 ℃，30 s；40個PCR循環(huán) (95 ℃，5 s；60 ℃，40 s)。建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線分析，每個樣品重復3次。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析。引物設計見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

2 結 果

2.1各組小鼠肺組織形態(tài) 正常組小鼠支氣管結構清晰完整，黏膜上皮細胞完整且排列整齊，無炎性細胞浸潤和聚集；與正常組相比，模型組小鼠支氣管上皮細胞不完整，存在壞死，且炎性細胞浸潤明顯；各藥物組小鼠支氣管結構出現(xiàn)不同程度的修復，上皮細胞損傷程度及炎癥細胞浸潤程度有所減輕，其中健脾防哮方高、中劑量組和地塞米松組改善更為明顯。見圖1。

圖1 正常組和哮喘各組小鼠肺組織HE染色病理形態(tài)

2.2各組小鼠支氣管上皮下膠原沉積與肌纖維增生情況 正常組小鼠氣道上皮下及氣道周圍未見明顯膠原纖維沉積；模型組小鼠氣道周圍存在明顯膠原纖維沉積；各藥物組小鼠膠原蛋白沉積明顯減少，其中健脾防哮方高、中劑量組和地塞米松組膠原沉積減少更明顯。見圖2。

圖2 正常組和哮喘各組小鼠支氣管上皮下膠原沉積與肌纖維增生情況(Masson染色)

2.3各組小鼠肺組織免疫組化檢測E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表達情況 與正常組比較，模型組小鼠N-cadherin、α-SMA表達增加(P均<0.05)， E-cadherin表達減少(P<0.05)。與模型組比較，各藥物組N-cadherin、α-SMA表達明顯減少(P均<0.05)，E-cadherin表達明顯增加(P均<0.05)，且健脾防哮方高、中劑量組和地塞米松組各指標表達變化較健脾防哮方低劑量組更明顯(P均<0.05)。見圖3～5及表2。

表2 正常組和哮喘各組小鼠肺組織免疫組化檢測E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表達情況比較

圖3 正常組和哮喘各組小鼠肺組織E-cadherin表達情況(免疫組化，×200)

2.4各組小鼠肺組織Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表達情況 與正常組比較，模型組小鼠肺組織中N-cadherin和α-SMA相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，E-cadherin相對表達量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，各藥物組小鼠肺組織中N-cadherin和α-SMA相對表達量均明顯降低(P均<0.05)，地塞米松組和健脾防哮方高、中劑量組小鼠肺組織中E-cadherin相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，且健脾防哮方高、中劑量組和地塞米松組各指標表達變化較健脾防哮方低劑量組更明顯(P均<0.05)。見圖6及表3。

表3 正常組和哮喘各組小鼠肺組織Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表達情況

圖4 正常組和哮喘各組小鼠肺組織N-cadherin表達情況(免疫組化，×200)

圖5 正常組和哮喘各組小鼠肺組織α-SMA表達情況(免疫組化，×200)

A為正常組；B為模型組；C為健脾防哮方低劑量組；D為健脾防哮方中劑量組；E為健脾防哮方高劑量組；F為地塞米松組

2.5各組小鼠肺組織中α-SMA、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達情況 與正常組比較，模型組小鼠肺組織中N-cadherin和α-SMA mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，E-cadherin mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，各藥物組小鼠肺組織中N-cadherin和α-SMA mRNA相對表達量均明顯降低(P均<0.05)，地塞米松組和健脾防哮方高、中劑量組小鼠肺組織中E-cadherin mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，且健脾防哮方高、中劑量組和地塞米松組各指標表達變化較健脾防哮方低劑量組更明顯(P均<0.05)。見表4。

表4 正常組和哮喘各組小鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、α-SMA mRNA表達情況

3 討 論

目前研究表明， EMT是上皮細胞喪失表型特征，并獲得間質細胞樣表型的復雜生物學過程，其特點為N-cadherin、α-SMA增多， E-cadherin減少[12-14]。有研究表明，EMT能導致哮喘氣道上皮的纖維化并促進平滑肌增生，破壞上皮屏障，加重氣道炎癥，是目前支氣管哮喘發(fā)病機制的研究熱點和難點[15-16]。因此，延緩EMT的發(fā)展可能成為哮喘治療的潛在靶點。

本課題組一直致力于中醫(yī)藥防治哮喘的研究，傳承中醫(yī)藥治療哮喘特色經(jīng)驗，結合兒童哮喘病機特點，首次提出“脾虛為本，痰瘀為標”是哮喘的基本病機，治療以益氣健脾、化痰通絡為治則。健脾防哮方由黃芪當歸藥對與二陳湯化裁而來，方中炙黃芪健運脾氣，助運化，益氣固表，為君藥。清半夏味辛平，可入上焦肺，又可入中焦脾胃；在脾，燥濕之力顯著，祛脾濕，助脾運；在肺，降肺氣，化痰涎；與黃芪配伍，辛散化中焦而補肺氣。陳皮理氣健脾、燥濕化痰，防止黃芪滋膩礙脾，澀滯氣機，補中寓運，以健運脾氣，使肺氣恢復。茯苓既為健脾良藥，又可滲濕，與半夏、陳皮相合，有燥濕化痰、理氣和中之效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載當歸主咳逆上氣，本方用當歸治咳喘，兼顧活血化瘀通絡。烏梅一藥多用，一則烏梅酸澀，可斂肺定喘；二可防止半夏辛溫燥烈傷及肺氣，為使藥。全方配伍，切中病機。

本實驗HE和Masson染色發(fā)現(xiàn)，健脾防哮方可以減少卵蛋白誘導的小鼠上皮細胞脫落壞死，緩解支氣管周圍炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積，表明健脾防哮方可抑制哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑。肺組織E-cadherin、N-cadherin、α-SMA檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠肺組織中N-cadherin、α-SMA表達增加，E-cadherin表達減少，表明哮喘發(fā)病過程中有EMT參與，與既往報道一致；健脾防哮方高、中劑量組 N-cadherin、α-SMA表達減少，E-cadherin表達增加，表明健脾防哮方可調控EMT。

綜上所述，哮喘病理過程中有EMT參與，健脾防哮方可能是通過調控EMT而起到減輕哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑作用的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。