曾羽霄，莊少偉

多種心肌疾病中均存在心肌細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。心肌細(xì)胞凋亡、炎癥可造成急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)進(jìn)一步加重并引發(fā)心肌功能障礙、心力衰竭等，導(dǎo)致病人死亡風(fēng)險(xiǎn)升高[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNAs)和短非編碼RNA(miRNAs)在生物過程中發(fā)揮重要的作用。lncRNA是一類長度大于200多個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄RNA分子，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。NEAT1是一種長度約為3 700 nt的lncRNA，定位于11q13.1，與mRNA前體剪接區(qū)域 SC-35有密切聯(lián)系，研究顯示NEAT1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等多種癌癥相關(guān)的細(xì)胞活動[2]。最近研究顯示，NEAT1可通過產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)促進(jìn)炎癥反應(yīng)[3]。miRNA為18～25個(gè)核苷酸之間的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA分子，主要結(jié)合 mRNA 的非翻譯區(qū)，下調(diào)或者抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，參與各種疾病的病理過程[4]。miR-193a-3p來源于miR-193家族，其抗腫瘤活性已在肺癌和腎細(xì)胞癌等各種癌癥研究中廣泛報(bào)道[5]。競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)假說的提出讓人們對lncRNAs和miRNAs之間的作用機(jī)制有了新的認(rèn)識。當(dāng)前研究表明，lncRNA可作為ceRNA并競爭性結(jié)合到miRNA，從而調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平并調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。已有研究顯示，NEAT1作為ceRNA并結(jié)合miR-193a-3p以加速肺腺癌惡化[7]。但是NEAT1和miR-193a-3p在心肌細(xì)胞損傷是否存在某種調(diào)控關(guān)系及其作用機(jī)制尚不明確。本研究用脂多糖(LPS)處理心肌H9c2細(xì)胞建立心肌細(xì)胞損傷模型，探討NEAT1/miR-193a-3p在心肌細(xì)胞損傷中的作用，并且分析其影響炎性損傷的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 胚胎大鼠心肌H9c2細(xì)胞，購自上海匹拓生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 脂多糖購自上海廣銳生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶購自美國Gibico公司；Trizol試劑和Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒和RIPA 蛋白裂解液購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自中國南京碧云天生物技術(shù)有限公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自Promega；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司；SYBR Green qPCR試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自美國R&D Systems公司；pcDNA-NEAT1、NEAT1 control、miR-193a-3p mimic和miR-193a-3p control購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII購自日本TaKaRa公司；Super SignalTM化學(xué)發(fā)光底物購自美國Thermo Scientific公司；Toll樣受體-4(Toll-like receptor-4，TLR-4)抗體、骨髓分化主要反應(yīng)蛋白88(myeloid differentiation primary response 88，MYD88)抗體、核因子-κB p65(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B，NF-κB p65)抗體、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)抗體、β-actin兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶-羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗均購自美國CST公司；TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和白細(xì)胞介素-8(IL-8)試劑盒均購自江蘇科晶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 -80 ℃冰箱購自日本SANYO公司；二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱購自美國Precision公司；PT-3502A 酶標(biāo)儀購自北京普天新橋技術(shù)有限公司；FACSAria flow流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences公司；Step One PlusTMreal-time PCR System購自美國 Applied Biosystems公司；凝膠掃描分析系統(tǒng)購自英國 Syngene 公司；蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、ChemiDoc 成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) 通過LncBase(www.microrna.gr/LncBase)預(yù)測NEAT1的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p和NEAT1的3′非編碼區(qū)域(3′- untranslated region，3′ UTR)存在互補(bǔ)的核苷酸序列。分別將含有野生型NEAT1(NEAT1-WT)和突變型NEAT1(NEAT1-MUT)質(zhì)粒和miR-193a-3p mimic或者 NC mimic共轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48 h后采用Bright- GloTM熒光素酶試劑盒確認(rèn)熒光素酶活性，使用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.2 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試驗(yàn) 按照生產(chǎn)商RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀配套所用EZ-Magna rip Kit說明書進(jìn)行操作。在DMEM培養(yǎng)液中加入EZ-Magna rip Kit的蛋白酶抑制劑和RNA裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解。根據(jù)說明書進(jìn)行RNA免疫沉淀。然后將抗Argonaute2(Ago2)抗體和正常小鼠IgG結(jié)合的磁珠孵育在RNA免疫沉淀緩沖液中進(jìn)行孵育。然后加入細(xì)胞裂解液，用蛋白酶K緩沖液處理各標(biāo)本，同時(shí)分離被沉淀的RNA。后續(xù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法檢測NEAT1和miR-193a-3p水平。

1.2.3 心肌細(xì)胞炎性損傷模型的建立 H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，分別用不同濃度(0.0 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL和2.0 μg/mL)的脂多糖刺激細(xì)胞24 h，然后通過CCK-8試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)測定各組細(xì)胞的活力，并且采用RT-PCR法測定細(xì)胞中NEAT1和miR-193a-3p mRNA的表達(dá)水平。選擇合適的脂多糖進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將胚胎大鼠心肌H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞分為miR-193a-3p mimic組、miR-193a-3p control組、NEAT1組、NEAT1 control組、miR-193a-3p mimic + NEAT1組、正常對照組以及模型對照組，參照Lipofectamine 2000 說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，分別利用轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000將miR-193a-3p mimic、miR-193a-3p control、pcDNA-NEAT1、NEAT1 control以及miR-193a-3p mimic+pcDNA-NEAT1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，正常對照組和模型對照組細(xì)胞未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染。

1.2.5 CCK-8試驗(yàn) 各組細(xì)胞經(jīng)脂多糖處理24 h后，加入CCK-8試劑，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處光密度OD值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后常規(guī)培養(yǎng)6 h，除正常對照組外，其余各組用含脂多糖(1 μg/mL)的新鮮DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸細(xì)胞，離心棄去上清液，重復(fù)兩次。使用100 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5 μL的 Annexin V-FITC和5 μL的熒光染料碘化甲啶，避光孵育15 min后，用Binding Buffer重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.7 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后常規(guī)培養(yǎng)6 h，除正常對照組外，其余各組用含脂多糖(1 μg/mL)的新鮮DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞。加入Trizol 液提取總RNA，異丙醇法濃縮 RNA，采用全自動酶標(biāo)儀測定總RNA純度，控制A260/A280在1.9～2.1，RNA 電泳檢測其完整性。檢測濃度及純度后取2 μg總RNA應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件如下：37 ℃ 反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。將逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA純化后應(yīng)用Step One PlusTMreal-time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為20 μL∶1.5 μL cDNA 模板，1 μL 引物，10 μL SYBR?Premix Ex TaqTMII，7.5 μL H2O。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，擴(kuò)增循環(huán) 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s，共40 個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對定量表達(dá)量。

1.2.8 Western Blot實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后常規(guī)培養(yǎng)6 h，除正常對照組外，其余各組用含脂多糖(1 μg/mL)的新鮮DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞。用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞，離心，使用 BCA 法測定蛋白濃度。蛋白變性后按每孔20 μg進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠電泳(90 V 30 min，120 V 1 h)。電泳后濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF，400 mA，2h)，用5%BSA封閉1 h，TBST緩沖液洗膜，分別加入一抗后4 ℃過夜，TBST緩沖液充分洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗后室溫下孵育1 h，TBST緩沖液充分洗膜30 min，用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，顯影。測定各組細(xì)胞目標(biāo)蛋白表達(dá)量，以與β-actin條帶相對表達(dá)量表示。

1.2.9 ELISA試驗(yàn) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后常規(guī)培養(yǎng)6 h，除正常對照組外，其余各組用含脂多糖(1 μg/mL)的新鮮DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書要求操作，測定各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8含量。

2 結(jié) 果

2.1 miR-193a-3p和NEAT1靶向的關(guān)系 在轉(zhuǎn)染miR-193a-3p mimic的H9c2細(xì)胞中野生型NEAT1報(bào)告基因的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而突變報(bào)告基因的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)NEAT1 可以作為 ceRNA 靶向結(jié)合miR-193a-3p。詳見圖1。

與突變型序列(3′URT-MUT)比較，＊P<0.01。圖1 H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-193a-3p mimic后野生型和突變型NEAT1報(bào)告基因熒光素酶活性比較

2.2 免疫沉淀試驗(yàn)結(jié)果 與IgG免疫沉淀物對照相比，H9c2細(xì)胞中miR-193a-3p和NEAT1在Ago2免疫沉淀物中富集。結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果，進(jìn)一步證明miR-193a-3p是H9c2細(xì)胞中NEAT1的結(jié)合靶點(diǎn)。詳見圖2。

與IgG免疫沉淀物對照比較，＊ P<0.01。圖2 免疫沉淀試驗(yàn)結(jié)果

2.3 脂多糖對H9c2細(xì)胞活力、NEAT1和miR-193a-3p mRNA表達(dá)的影響 當(dāng)脂多糖濃度達(dá)到1 μg/mL和2.0 μg/mL時(shí)H9c2細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05或P<0.01)，特別當(dāng)脂多糖濃度達(dá)到2.0 μg/mL時(shí)H9c2細(xì)胞活力降低超過50%。隨著脂多糖濃度的增加，H9c2細(xì)胞中miR-193a-3p mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，而NEAT1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，因此，NEAT1和miR-193a-3p可能參與脂多糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷。詳見圖3～圖5。

與0.0 μg/mL比較，＊P<0.05，#P<0.01。圖3 脂多糖對H9c2細(xì)胞活力的影響(n=6)

與0.0 μg/mL比較，＊P<0.01。圖4 脂多糖對H9c2細(xì)胞miR-193a-3p mRNA表達(dá)的影響(n=6)

與0.0 μg/mL比較，＊P<0.01。圖5 脂多糖對H9c2細(xì)胞NEAT1 mRNA表達(dá)的影響(n=6)

2.4 各組H9c2細(xì)胞中NEAT1和miR-193a-3p mRNA表達(dá)比較 將miR-193a-3p mimic轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中可使miR-193a-3p mRNA表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)，同時(shí)可使NEAT1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；而將pcDNA-NEAT1轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中可使NEAT1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，同時(shí)可使miR-193a-3p mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。詳見圖6。

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01。圖6 各組H9c2細(xì)胞中NEAT1和miR-193a-3p mRNA表達(dá)比較(n=6)

2.5 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響 將miR-193a-3p mimic 轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后可改善H9c2細(xì)胞因脂多糖刺激導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低和細(xì)胞凋亡增加(P<0.01)，而將pcDNA-NEAT1轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)miR-193a-3p mimic對細(xì)胞活力和凋亡的調(diào)節(jié)作用(P<0.01)。因此，過表達(dá)miR-193a-3p可改善H9c2細(xì)胞因脂多糖刺激導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低和細(xì)胞凋亡增加，而過表達(dá)NEAT1可逆轉(zhuǎn)miR-193a-3p對細(xì)胞活力和凋亡的調(diào)節(jié)作用。詳見圖7、圖8。

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01；與miR-193a-3p mimic組比較，△ P<0.01。圖7 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細(xì)胞活力的影響(n=6)

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01；與miR-193a-3p mimic組比較，△ P<0.01。圖8 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細(xì)胞凋亡的影響(n=6)

2.6 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細(xì)胞分泌炎性因子的影響 將miR-193a-3p mimic 轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后可使升高的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平明顯降低(P<0.01)，而將pcDNA-NEAT1轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)miR-193a-3p mimic對TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的調(diào)節(jié)作用(P<0.01)。因此，過表達(dá)miR-193a-3p可降低H9c2細(xì)胞因脂多糖刺激導(dǎo)致的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平升高，而過表達(dá)NEAT1可逆轉(zhuǎn)miR-193a-3p對TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平的調(diào)節(jié)作用。詳見圖9。

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01；與miR-193a-3p mimic組比較，△ P<0.01。圖9 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細(xì)胞炎性因子分泌的影響(n=6)

2.7 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細(xì)胞中TLR-4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 將miR-193a-3p mimic 轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后可使升高的TLR-4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，而將pcDNA-NEAT1轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)miR-193a-3p mimic對TLR-4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(P<0.01)，但是miR-193a-3p mimic 和pcDNA-NEAT1轉(zhuǎn)染對NF-κB p65蛋白表達(dá)水平無明顯影響(P>0.05)。因此，過表達(dá)miR-193a-3p可降低H9c2細(xì)胞因脂多糖刺激導(dǎo)致的TLR-4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高，而過表達(dá)NEAT1可逆轉(zhuǎn)miR-193a-3p對TLR-4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用，但是過表達(dá)miR-193a-3p或過表達(dá)NEAT1對NF-κB蛋白表達(dá)水平無影響。詳見圖10。

模型對照組與正常對照組比較，＊P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.01；與miR-193a-3p mimic組比較，△ P<0.01。圖10 NEAT1/miR-193a-3p對脂多糖所致H9c2細(xì)胞中TLR-4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=6)

3 討 論

多種miRNA可通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞炎癥、纖維化、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡及新生血管形成的表型機(jī)制參與心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展[8-9]。Eguchi等[10]研究顯示，心肌細(xì)胞外泌體中的miRNA-214具有抗細(xì)胞凋亡作用，心肌細(xì)胞通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用捕獲miRNA-214從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。miRNA-488-3p 通過靶向ZNF791 抑制急性心肌梗死后的心肌細(xì)胞凋亡[11]。miR-325-3p 通過受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)/受體相互作用蛋白激酶3(RIPK3)/人磷酸化混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(p-MLKL)途徑抑制壞死性凋亡，抑制RIPK3的表達(dá)和程序性壞死，保護(hù)心肌梗死后的心臟[12]。miR-193a-3p來源于miR-193家族，其抗腫瘤活性已廣泛報(bào)道，但是在心肌細(xì)胞損傷中的作用鮮有報(bào)道。lncRNA 是一種非編碼RNA，在真核細(xì)胞內(nèi)被普遍轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)具有組織特異性，與動脈粥樣硬化、慢性心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。隨著對lncRNA的深入研究，許多研究結(jié)果表明其在炎癥介質(zhì)產(chǎn)生及炎癥細(xì)胞分化、遷移等多種生物過程中起重要作用。Zhang等[13]報(bào)道抑制NEAT1可明顯降低脂多糖誘導(dǎo)的趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)。張飛飛等[14]探索NEAT1在先天免疫反應(yīng)中的作用，結(jié)果表明NEAT1參與Toll樣受體-2(TLR-2)介導(dǎo)的先天免疫調(diào)節(jié)，并且選擇性地調(diào)控TLR-2信號活化緩慢持續(xù)誘導(dǎo)的晚期反應(yīng)炎性因子的表達(dá)。Chen等[15]研究顯示，NEAT1可通過調(diào)節(jié)NF-κB通路影響膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

lncRNA可作為ceRNA并競爭性結(jié)合到miRNA，而NEAT1作為ceRNA并結(jié)合miR-193a-3p[7]。本研究通過熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)NEAT1 可以作為ceRNA 靶向結(jié)合miR-193a-3p，并且免疫沉淀試驗(yàn)進(jìn)一步證明miR-193a-3p是H9c2細(xì)胞中NEAT1的結(jié)合靶點(diǎn)。目前，關(guān)于NEAT1和miR-193a-3p在心肌細(xì)胞損傷的作用鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，脂多糖可致H9c2細(xì)胞活力明顯降低，并且細(xì)胞中miR-193a-3p mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，而NEAT1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，說明NEAT1和miR-193a-3p可能參與脂多糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷。通過轉(zhuǎn)染miR-193a-3p mimic或pcDNA-NEAT1至H9c2細(xì)胞，改變細(xì)胞中miR-193a-3p mRNA和NEAT1 mRNA的表達(dá)水平，過表達(dá)miR-193a-3p可改善H9c2細(xì)胞因脂多糖刺激導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低和細(xì)胞凋亡增加，而過表達(dá)NEAT1可逆轉(zhuǎn)miR-193a-3p對細(xì)胞活力和凋亡的調(diào)節(jié)作用。IL-6、TNF-α等炎性因子水平升高導(dǎo)致心肌功能紊亂及心肌細(xì)胞凋亡、壞死[16]。炎癥反應(yīng)是包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡、壞死的重要病理改變，降低細(xì)胞炎性因子含量有助于減輕細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-193a-3p可降低H9c2細(xì)胞因脂多糖刺激導(dǎo)致的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平升高，而過表達(dá)NEAT1可逆轉(zhuǎn)miR-193a-3p對TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平的調(diào)節(jié)作用。因此，miR-193a-3p和NEAT1在H9c2細(xì)胞損傷中發(fā)揮相反的作用，NEAT1可反向調(diào)節(jié)miR-193a-3p在心肌細(xì)胞損傷中的作用。

越來越多的研究表明，TLR-4/NF-κB信號通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，是涉及免疫和炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，并且是細(xì)胞凋亡引起炎癥性損傷的原因[17]。TLR-4是一種在天然免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用的模式識別受體，革蘭陰性菌可被TLR-4特異性識別，并激活TLR-4招募MYD88，導(dǎo)致NF-κB抑制蛋白IκBα磷酸化，NF-κB從復(fù)合物上解離，最后NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，刺激TNF-α、IL-6 和IL-1β等炎性因子的生成[18]，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[19]，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和組織氧化損傷，進(jìn)一步促使血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老、死亡，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而誘發(fā)動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病[20]。使TLR-4/NF-κB信號通路失活一直是抑制炎癥的有效方法和治療靶點(diǎn)。Zhang等[21]研究顯示，聚乙二醇可通過阻斷TLR-4/NF-κB改善脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。下調(diào)lncRNA MALAT1可通過抑制TLR-4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕飽和脂肪酸誘導(dǎo)的心肌炎癥損傷[22]。Pan等[23]研究顯示，miR-21可抑制TLR-4/NF-κB通路，以減少心肌細(xì)胞凋亡和炎性因子生成。在本研究中，過表達(dá)miR-193a-3p可降低H9c2細(xì)胞因脂多糖刺激導(dǎo)致的TLR-4、MYD88和p-NF-κBp65蛋白表達(dá)水平升高，而過表達(dá)NEAT1可逆轉(zhuǎn)miR-193a-3p對TLR-4、MYD88和p-NF-κBp65蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用，因此，miR-193a-3p可通過調(diào)節(jié)TLR-4/NF-κB信號通路影響脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，而NEAT1可通過調(diào)節(jié)miR-193a-3p發(fā)揮其作用。因此，NEAT1可能通過海綿化miR-193a-3p來調(diào)節(jié)TLR-4/NF-κB信號通路的活化，從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞凋亡，從而影響心肌細(xì)胞損傷。

總之，NEAT1通過miR-193a-3p可影響脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，提示NEAT1可作為競爭性內(nèi)源RNA海綿miR-193a-3p參與心肌損傷過程，并且與調(diào)控TLR-4/NF-κB信號通路有關(guān)。