李雷雷，徐文漭，王光輝，楊舉倫

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤之首，病死率位居第2位。根據(jù)ER、PR及HER-2表達(dá)水平，乳腺癌主要分為三種不同亞型：ER和(或)PR陽(yáng)性型、HER-2過表達(dá)型及三陰型，其中ER陽(yáng)性乳腺癌占乳腺癌的70%以上，內(nèi)分泌治療是ER陽(yáng)性乳腺癌綜合治療必不可少的部分，無(wú)論早期還是進(jìn)展期ER陽(yáng)性乳腺癌，均能從內(nèi)分泌治療中獲益[1]。他莫昔芬是最常用的選擇性ER調(diào)節(jié)劑，通過與雌激素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ER發(fā)揮抑癌作用，其是絕經(jīng)前ER陽(yáng)性乳腺癌患者的一線治療藥物[2]。他莫昔芬可將ER陽(yáng)性乳腺癌的10年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低約1/2，死亡風(fēng)險(xiǎn)降低1/3[3-4]。雖然近年來不斷有新的、療效確切的內(nèi)分泌藥物出現(xiàn)[5]，但他莫昔芬因其療效顯著且價(jià)格便宜被廣泛運(yùn)用。研究發(fā)現(xiàn)，50%ER陽(yáng)性乳腺癌在內(nèi)分泌治療過程中存在原發(fā)或獲得性耐藥，其中30%病例表現(xiàn)為對(duì)他莫昔芬耐藥[6-7]，接受標(biāo)準(zhǔn)5年他莫昔芬治療的1/3乳腺癌患者在15年內(nèi)復(fù)發(fā)[8]，說明他莫昔芬耐藥現(xiàn)象普遍存在，也是臨床工作亟待解決的一大難題。本文應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)篩選乳腺癌他莫昔芬耐藥相關(guān)基因并分析相關(guān)通路，為預(yù)測(cè)乳腺癌潛在治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 乳腺癌他莫昔芬耐藥微陣列數(shù)據(jù)集采集和處理利用關(guān)鍵詞“breast cancer；tamoxifen-resistant”在GEO基因數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE67916和GSE96670基因表達(dá)譜。GSE67916[9]的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為GPL570(Affymetrix human genome U133 plus 2.0Array)其中包括10份tamoxifen-resistant標(biāo)本(MCF-7R)和8份tamoxifen-sensitive(MCF-7S)標(biāo)本。GSE96670[10]的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)，其中包括6個(gè)tamoxifen-resistant標(biāo)本(MCF-7R)和6個(gè)tamoxifen-sensitive(MCF-7S)標(biāo)本。

1.2 差異基因的獲取與分析使用在線分析軟件GEO2R對(duì)基因進(jìn)行分組，分為tamoxifen-resistant樣本組和tamoxifen-sensitive樣本組。設(shè)置P值和差異倍數(shù)(foldchange,FC)進(jìn)行差異基因的篩選。當(dāng)P<0.05，∣log2FC∣>1時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 差異基因的GO和KEGG分析使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在線工具對(duì)所選差異基因進(jìn)行GO分析；使用KOBAS在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)差異基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，設(shè)置P<0.05。

1.4 差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用STRING(http://string-db.org/)來識(shí)別乳腺癌他莫昔芬耐藥中差異基因所編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用和通路關(guān)系，并利用Cytoscape(MCODE)篩選關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌他莫昔芬耐藥樣本中差異基因的鑒定利用GEO2R在線分析工具對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。該工具借助R和Limma軟件完成分析過程，得到差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEG)(校正后P<0.05，∣log2FC∣>1)。鑒定出DEG(GSE67916中有1 349個(gè)，GSE96670中有279個(gè))。2個(gè)數(shù)據(jù)集之間的重疊包含132個(gè)基因(圖1)，由他莫昔芬耐藥樣本和他莫昔芬敏感樣本之間的103個(gè)上調(diào)基因和29個(gè)下調(diào)基因組成。

圖1 兩個(gè)數(shù)據(jù)集基因交集韋恩圖

2.2 GO和KEGG分析利用DAVID在線分析工具對(duì)兩個(gè)乳腺癌他莫昔芬耐藥數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因的生物過程、細(xì)胞組成和分子功能進(jìn)行GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其功能富集于蛋白質(zhì)同二聚化活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、色氨酸代謝、ATP結(jié)合、胞外外泌體、對(duì)藥物治療的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的正負(fù)調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正調(diào)控。最主要的是細(xì)胞黏附、細(xì)胞質(zhì)外泌體、蛋白結(jié)合功能。KEGG分析顯示：差異基因的代謝主要集中在內(nèi)吞作用、癌蛋白聚糖、色氨酸代謝、雌激素信號(hào)、卵巢類固醇生成通路，最主要在內(nèi)吞通路、癌蛋白聚糖和雌激素信號(hào)通路(表1，圖2、3)。

表1 差異表達(dá)基因的GO及KEGG分析

圖2 差異基因GO分析：A.柱狀圖；B.氣泡圖：差異基因中參與生物過程、細(xì)胞組成、分子功能最多的分別是細(xì)胞黏附、細(xì)胞質(zhì)外泌體、蛋白結(jié)合

圖3 差異基因KEGG分析：A.柱狀圖；B.氣泡圖：差異基因KEGG富集最多的通路是內(nèi)吞作用、癌蛋白聚糖、雌激素信號(hào)通路等

2.3 乳腺癌他莫昔芬耐藥差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建差異基因表達(dá)產(chǎn)物的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)，并用Cytoscape(MCODE)確定以下4個(gè)中心節(jié)點(diǎn)基因：IFI27、IRF9、OAS1、ISG15(圖5)，其對(duì)應(yīng)的蛋白可能是核心蛋白或具有重要生理調(diào)控功能的關(guān)鍵候選分子。選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：MCODE分?jǐn)?shù)>5，度數(shù)截止=2，節(jié)點(diǎn)分?jǐn)?shù)截止=0.2，最大深度=100，K-core=2)。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖：綠色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，線段連接的兩個(gè)基因表示兩者有相關(guān)性

圖5 從具有4個(gè)節(jié)點(diǎn)和12條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)中獲得4個(gè)最關(guān)鍵基因：IRF9、ISG15、OAS1、IFI27

2.4 關(guān)鍵模塊基因在乳腺癌組織中的表達(dá)及與腫瘤預(yù)后的關(guān)系利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)及生存分析，發(fā)現(xiàn)IFI27、IRF9、OAS1、ISG15在乳腺腫瘤組織中均為高表達(dá)(圖6)，且IFI27增高與腎上腺皮質(zhì)癌的預(yù)后較差有關(guān)(圖7A)，OAS1增高導(dǎo)致肺腺癌生存率降低(圖7B)。

圖6 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析4個(gè)關(guān)鍵基因在乳腺癌中的表達(dá)及與腫瘤預(yù)后的關(guān)系：IFI27(A)、IRF9(B)、OAS1(C)、ISG1(D)在乳腺癌組織中的表達(dá)

圖7 A.IFI27表達(dá)與腎上腺皮質(zhì)癌預(yù)后的關(guān)系；B.OAS1表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

3 討論

ER陽(yáng)性乳腺癌由于其基數(shù)較大以及遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移比例較高，ER陽(yáng)性乳腺癌患者死亡人數(shù)明顯多于另外兩型乳腺癌患者[1,4,11]。乳腺癌內(nèi)分泌治療和靶向治療的應(yīng)用增加了治療的可選擇性，并改善乳腺癌患者預(yù)后[12]。ER基因是內(nèi)分泌治療的靶點(diǎn)，包括選擇性ER調(diào)節(jié)劑(selective ER modulators,SERM)和選擇性ER下調(diào)劑(selective ER downregulators,SERD)，或芳香酶抑制劑(aromatase inhibitors,AI)[13]。乳腺癌的內(nèi)分泌治療已有110多年歷史，由于認(rèn)識(shí)較少，曾長(zhǎng)期徘徊于切除內(nèi)分泌器官(如卵巢、腎上腺、垂體)和補(bǔ)充雌激素和雄激素的階段。內(nèi)分泌治療按其治療方式可分為藥物治療和非藥物治療[14-15]。最常用的藥物治療有他莫昔芬和芳香化酶抑制劑，但是近年越來越多的報(bào)道證明乳腺癌患者對(duì)內(nèi)分泌治療耐藥。乳腺癌內(nèi)分泌耐藥分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥，原發(fā)性內(nèi)分泌耐藥是指輔助內(nèi)分泌治療不超過2年或者晚期一線內(nèi)分泌治療不超過6個(gè)月即出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或進(jìn)展；繼發(fā)性內(nèi)分泌耐藥是指輔助內(nèi)分泌治療超過2年或結(jié)束后1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，或者晚期一線內(nèi)分泌治療超過6個(gè)月出現(xiàn)進(jìn)展[16]。他莫昔芬治療乳腺癌的原理是通過與雌激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ER，阻斷雌激素相關(guān)基因的表達(dá)，從而減慢腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖，因而可以肯定他莫昔芬的耐藥機(jī)制與ER信號(hào)傳導(dǎo)的異常調(diào)節(jié)密切相關(guān)。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，高達(dá)1/3患者屬于原發(fā)性他莫昔芬耐藥，而早期對(duì)他莫昔芬敏感的患者中有30%～40%出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥[17-19]，他莫昔芬耐藥可導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移，縮短患者生存期，嚴(yán)重者可造成患者死亡。因此，探討乳腺癌他莫昔芬耐藥機(jī)制具有重要意義。

腫瘤耐藥受基因調(diào)控，基因表達(dá)芯片作為一種高效、大規(guī)模的基因數(shù)據(jù)獲取技術(shù)，已被廣泛用于收集基因微陣列表達(dá)譜數(shù)據(jù)，研究多種人類癌癥的基因表達(dá)。微陣列技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)及其快速發(fā)展，拓展了癌癥研究的手段，加速各種癌癥治療潛在靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)[20-22]。利用生物信息學(xué)技術(shù)整合這些數(shù)據(jù)可以幫助我們更深入地研究疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。王世霞等[23]通過生物信息學(xué)技術(shù)證明HIF-1信號(hào)通路可能會(huì)導(dǎo)致乳腺癌他莫昔芬治療耐藥。柴慈曼等[24]亦通過生物信息學(xué)有效分析他莫昔芬耐藥的基因芯片數(shù)據(jù)，為他莫昔芬耐藥的治療靶點(diǎn)提供重要依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了與他莫昔芬耐藥有關(guān)的132個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因主要參與內(nèi)吞作用、癌蛋白聚糖、雌激素信號(hào)通路等代謝過程。既往研究發(fā)現(xiàn)，自噬是他莫昔芬耐藥的重要機(jī)制，抑制自噬可以實(shí)現(xiàn)獲得性耐藥乳腺癌細(xì)胞的再增敏。內(nèi)吞作用是自噬的重要過程，故作者推測(cè)差異基因通過內(nèi)吞作用參與自噬導(dǎo)致他莫昔芬耐藥。近年越來越多的研究表明，雌激素表觀遺傳學(xué)改變以及雌激素相關(guān)信號(hào)通路的異常和交互作用，是導(dǎo)致乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥的主要原因，本實(shí)驗(yàn)篩選出的差異基因也主要富集雌激素信號(hào)通路代謝過程，作者推測(cè)這些基因也可以通過雌激素信號(hào)通路導(dǎo)致他莫昔芬耐藥。此外，本實(shí)驗(yàn)還探討IFI27、IRF9、OAS1、ISG15與腫瘤預(yù)后的關(guān)系。從UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)IFI27、IRF9、OAS1、ISG15在乳腺癌組織中的表達(dá)均高于正常乳腺組織，且IFI27表達(dá)增高與腎上腺皮質(zhì)癌的預(yù)后較差有關(guān)，OAS1表達(dá)增高導(dǎo)致肺腺癌生存率降低。目前，關(guān)于IFI27、IRF9、OAS1、ISG15基因與腫瘤關(guān)系的研究較多。其中一項(xiàng)研究證明IFI27與ER陽(yáng)性乳腺癌的生長(zhǎng)和侵襲存在內(nèi)在聯(lián)系[25]；也有研究證明IFI27可以促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)卵巢癌的發(fā)生[26];Wang等[27]的研究結(jié)果亦證明抑制IFI27可以抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Huang等[28]基于生物信息學(xué)分析的研究顯示，IFI27是胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Yang等[29]的研究亦顯示IFI27是胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。也有研究表明，VCAN能夠使IRF9轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞具有致癌特性(增殖和遷移)，可能與CDKN1A有關(guān)[30]，也有研究證明IRF9可以通過調(diào)節(jié)Versican促進(jìn)肺癌進(jìn)展[31]。Zhang等[32]的研究證明OAS1、OAS3的mRNA高表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后較差相關(guān)。以上結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明IFI27、OAS1、IRF9可能與乳腺癌不良預(yù)后有關(guān)，進(jìn)而可能在乳腺癌他莫昔芬耐藥過程中發(fā)揮作用。目前，關(guān)于ISG15的作用研究存在爭(zhēng)議。Jeon等[33]的研究結(jié)果證實(shí)ISG15與多柔比星化療敏感性密切相關(guān)；而Zhou等[34]的研究認(rèn)為ISG15抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與本組結(jié)果不一致，需要進(jìn)一步分析。

綜上所述，IFI27、IRF9、OAS1、ISG15可能與乳腺癌他莫昔芬耐藥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，目前，關(guān)于IFI27、IRF9、OAS1、ISG15與他莫昔芬耐藥機(jī)制相關(guān)研究暫無(wú)報(bào)道，值得我們進(jìn)一步分析，這可能對(duì)乳腺癌治療產(chǎn)生積極的影響。本實(shí)驗(yàn)的局限性在于樣本量相對(duì)較小，易造成統(tǒng)計(jì)學(xué)上的偏差，乳腺癌他莫昔芬耐藥相關(guān)基因的功能仍需進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。