王 翠，王 芬，劉家瑞

（遂寧市中心醫(yī)院，四川 遂寧 629000）

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起結(jié)核?。═uberculosis，TB）的病原菌，最適于在人體血供充足、含氧量高的器官/ 組織內(nèi)生長(zhǎng)，因此以肺部TB 最為常見。我國(guó)TB 患者的數(shù)量居全球第二位，僅次于印度[1]。世界衛(wèi)生組織TB 報(bào)告顯示，全球每年約有1040 萬新發(fā)TB 病例，但由于目前TB 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法仍為敏感性差、耗時(shí)長(zhǎng)的抗酸染色法和固體/ 液體培養(yǎng)法，因此被明確診斷的TB 患者不足60%[2]。尋找一種新的、可對(duì)早期感染病例進(jìn)行高效、快速診斷的方法，對(duì)于提高TB 的診斷率、降低誤診率、控制TB 的播散具有重要意義。Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)可在120 min 內(nèi)同時(shí)檢測(cè)MTB 及利福平的耐藥性，具有快速、操作方便、生物安全要求相對(duì)低、交叉污染少等優(yōu)點(diǎn)[3]。本研究將Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)與抗酸染色法、固體培養(yǎng)法、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)對(duì)TB 的診斷價(jià)值，為該技術(shù)在川東地區(qū)基層醫(yī)院的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2020 年3 月至2021 年2 月遂寧市中心醫(yī)院收治的疑似TB 患者送檢的標(biāo)本（肺泡灌洗液標(biāo)本或痰液標(biāo)本）368 份。每一份標(biāo)本均采用抗酸染色法、熒光定量PCR 法、Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)、固體培養(yǎng)法四種方法進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性菌株送遂寧市疾控中心進(jìn)行菌種鑒定和比例法藥敏試驗(yàn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 抗酸染色法 對(duì)痰涂片/ 肺泡灌洗液涂片進(jìn)行抗酸染色，并報(bào)告結(jié)果：1+、2+、3+、4+或陰性[4]。

1.2.2 熒光定量PCR 法 標(biāo)本充分液化后提取核酸，最后置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 固體培養(yǎng)及比例法藥敏試驗(yàn) 取0.1 mL 液化后的標(biāo)本接種至中性羅氏培養(yǎng)基上（每一標(biāo)本均同時(shí)接種2 管），置于37 ℃孵箱中培養(yǎng)，分別于接種第3 天和第7 天觀察菌落的生長(zhǎng)情況，此后每周觀察一次直至第8 周。每次觀察均記錄菌落的生長(zhǎng)及污染情況。將培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性的菌株送至遂寧市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行菌種鑒定并按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)藥物為利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素、氧氟沙星和卡那霉素。

1.2.4 Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè) 取2 mL 液化后的混合液，緩慢加入檢測(cè)匣，加樣過程中避免產(chǎn)生氣泡。將檢測(cè)匣放入檢測(cè)模塊進(jìn)行檢測(cè)，2 h 后讀取結(jié)果。Gene Xpert MTB/RIF 對(duì)MTB 的檢測(cè)結(jié)果可根據(jù)探針的Ct值判斷，5 個(gè)探針中至少有2 個(gè)探針的Ct值≤38 即為檢測(cè)到MTB，Ct值與MTB 載量的對(duì)應(yīng)關(guān) 系如下：Ct值≤16 ：高；16 ＜Ct值＜22 ：中；22 ≤Ct值≤28 ：低；Ct值＞28 ：極低。Gene Xpert

MTB/RIF 對(duì)利福平耐藥性的檢測(cè)結(jié)果可根據(jù)MTB 特異性分子信標(biāo)早期Ct值與晚期Ct值之差，即△Ct值判斷。當(dāng)△Ct值＞3.5 時(shí)，提示對(duì)利福平耐藥，結(jié)果為利福平耐藥檢出；當(dāng)△Ct值≤3.5 時(shí)，提示對(duì)利福平敏感，結(jié)果為利福平耐藥未檢出。

1.3 觀察指標(biāo)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用% 表示，用χ2 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種檢測(cè)方法一致性的比較采用Kappa 檢驗(yàn)，Kappa 值＞0.75為一致性較好。

2 結(jié)果

2.1 四種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率

用抗酸染色法、熒光定量PCR 法、Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)、固體培養(yǎng)法對(duì)368 份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率分別為14.13%、34.24%、49.46%、50.82%。詳見表1。采用固體培養(yǎng)法、Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)和熒光定量PCR 法對(duì)368 份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率均高于抗酸染色法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。采用固體培養(yǎng)法、Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)對(duì)368 份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率均高于熒光定量PCR 法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。采用固體培養(yǎng)法對(duì)368 份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率略高于Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 四種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率

2.2 GeneXpertMTB/RIF 檢測(cè)MTB 的效能分析

對(duì)368 份標(biāo)本進(jìn)行Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)，其中檢出陽(yáng)性標(biāo)本182 份，陽(yáng)性檢出率為49.46%。在Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的標(biāo)本中，MTB 含量為低和極低者占59.34%，MTB 含量中等者占26.92%，MTB 含量為高者僅占13.74%。以固體培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)采用Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)疑似TB 患者送檢標(biāo)本中MTB 的敏 感 度 為96.79%（181/187）、 特 異 度 為99.45%（180/181），陽(yáng) 性預(yù)測(cè)值 為99.45%（181/182），陰性預(yù)測(cè)值為96.77%（180/186），二者的符合率為98.10% 〔（181+180）/368 〕。 進(jìn) 行 固 體 培 養(yǎng) 和Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)均呈陽(yáng)性的標(biāo)本有181 份，經(jīng)Kappa 檢驗(yàn)，Kappa 值為0.961，提示二者的一致性好。Gene Xpert MTB/RIF 與固體培養(yǎng)檢測(cè)MTB 的結(jié)果見表2。

表2 Gene Xpert MTB/RIF 與固體培養(yǎng)檢測(cè)MTB 的比較（份）

2.3 GeneXpertMTB/RIF 檢測(cè)利福平耐藥性的效能分析

以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)采用Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)疑似TB 患者送檢標(biāo)本利福平耐藥性的敏感度為88.89%（24/27），特異度為99.71%（340/341），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.00%（24/25），陰性預(yù)測(cè)值為99.13%（340/343），二者的符合率為98.91% 〔（24+340）/368 〕。Gene Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果為利福平耐藥的25 份標(biāo)本中，21 份標(biāo)本同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥，占84.00%。進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)和Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)均呈陽(yáng)性的標(biāo)本有24 份，經(jīng)Kappa 檢驗(yàn)，Kappa 值為0.884，提示二者的一致性好。Gene Xpert MTB/RIF 與比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥性的結(jié)果見表3。

表3 Gene Xpert MTB/RIF 與比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥性的比較（份）

3 討論

本研究中，在抗酸染色、熒光定量PCR、Gene Xpert MTB/RIF、固體培養(yǎng)四種檢測(cè)方法中，固體培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率最高（50.82%），其次為Gene Xpert MTB/RIF（49.46%）。固體培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率略高于Gene Xpert MTB/RIF，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。原因可能是我院Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)系統(tǒng)只配置了一個(gè)檢測(cè)倉(cāng)，樣本較多時(shí)無法及時(shí)上機(jī)檢測(cè)，影響了Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)的陽(yáng)性率。當(dāng)標(biāo)本中抗酸桿菌數(shù)量達(dá)5000 條/mL 時(shí)，抗酸染色可檢出抗酸桿菌；熒光定量PCR 的檢測(cè)限為1000 cfu/mL， 而Gene Xpert MTB/RIF 的 檢 測(cè) 限 為131 cfu/mL[6]。因此，Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)的陽(yáng)性檢出率高于熒光定量PCR 法和抗酸染色法。本研究的結(jié)果顯示，以固體培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)采用Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)疑似TB 患者送檢標(biāo)本中MTB 的敏感度為96.79%、特異度為99.45%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為99.45%，陰性預(yù)測(cè)值為96.77%，二者的符合率為98.10%，Kappa 值為0.961。說明Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地檢出MTB。研究表明，Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)僅對(duì)MTB 有特異性，與非MTB 無交叉反應(yīng)[7]。本研究中6 份標(biāo)本行固體培養(yǎng)呈陽(yáng)性，但經(jīng)Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)為陰性，送至遂寧市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果均非MTB。說明當(dāng)固體培養(yǎng)提示MTB 陽(yáng)性而Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)提示陰性時(shí)，不排除非MTB 感染的可能。本研究中1 份標(biāo)本經(jīng)固體培養(yǎng)呈陰性而經(jīng)Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)呈陽(yáng)性，原因可能是標(biāo)本前處理過度或標(biāo)本中MTB 載量過低。Gene Xpert MTB/RIF 不僅可檢出標(biāo)本中是否存在MTB 感染，還可判斷MTB 的載量，結(jié)果以高、中、低、極低表示。本研究經(jīng)Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的標(biāo)本中，MTB 含量為低和極低者占59.34%，說明Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)可提高M(jìn)TB 載量低/ 極低標(biāo)本的檢出率。

本研究的結(jié)果顯示，以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)采用Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)疑似TB 患者送檢標(biāo)本利福平耐藥性的敏感度為88.89%，特異度為99.71%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.00%，陰性預(yù)測(cè)值為99.13%，二者的符合率為98.91%，Kappa 值為0.884。說明Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)與比例法藥敏試驗(yàn)的一致性好。本研究中有4 份標(biāo)本的比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果與Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)結(jié)果不一致，其中3 份標(biāo)本經(jīng)比例法藥敏試驗(yàn)提示利福平耐藥，而經(jīng)Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)提示利福平耐藥未檢出，1 份標(biāo)本經(jīng)比例法藥敏試驗(yàn)提示利福平敏感，而經(jīng)Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)提示利福平耐藥檢出。原因可能是比例法藥敏試驗(yàn)使用的是經(jīng)過培養(yǎng)后的MTB，而Gene Xpert MTB/RIF 檢測(cè)使用的是患者的肺泡灌洗液或痰液等標(biāo)本，兩種方法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)菌群不一樣。此外，Gene Xpert MTB/RIF 僅能檢測(cè)發(fā)生在RRDR區(qū)域的突變位點(diǎn)，當(dāng)利福平耐藥基因突變的位點(diǎn)位于RRDR 區(qū)域外或?yàn)槌聊蛔儠r(shí)，Gene Xpert MTB/RIF檢測(cè)可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果；而當(dāng)利福平耐藥為低水平耐藥時(shí)，比例法藥敏試驗(yàn)可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果[8-10]。

綜上所述，Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)與抗酸染色法、熒光定量PCR 法等檢測(cè)方法相比，敏感度高、特異性好，可同時(shí)檢測(cè)MTB 及其對(duì)利福平的耐藥性，最重要的是，該檢測(cè)技術(shù)所用的試劑采用獨(dú)立包裝，交叉污染少，對(duì)生物安全的要求相對(duì)較低，適合在川東生物安全防護(hù)薄弱的基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。