胡國富， 李韋瑤， 肖匯川， 崔國文， 宋 雪， 韋銀珠， 蘇瀅淼， 秦立剛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150030)

山韭(AlliumsenescensL.)為百合科蔥屬多年生草本植物，也有山蔥和巖蔥之稱[1-2]。山韭具有很多的優(yōu)良特性，如:適應(yīng)能力強(qiáng)，即使是在干旱、貧瘠的地區(qū)也能保持良好的生長[3-4]；分布范圍廣，通常分布于歐洲、中亞地區(qū)、西伯利亞和中國北部，生長于海拔2 000 m以下的地區(qū)[5]；可食用，山韭生長在營養(yǎng)期，尤其是在結(jié)實(shí)階段，鱗莖、嫩葉和小花均可食[6]，各類家畜均喜食，特別在結(jié)實(shí)階段，是綿羊、山羊駱駝等的主要抓膘牧草；營養(yǎng)豐富，在各生育期均富含較高的蛋白質(zhì)，是肥育牲畜的良好牧草[7-10]。

植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)植物種子的萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用，但植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、含量水平和濃度比例對(duì)于種子萌發(fā)的促進(jìn)效果不同[11-12]。研究表明，不同濃度的脫落酸(Abscisicacid，ABA)和赤霉素(Gibberellins，GA3)浸種均對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用。ABA是廣泛存在于植物體不同組織中且具有多種功能的激素，在種子休眠、生長發(fā)育等方面起著重要作用[13]。ABA對(duì)光皮樺(BetulaluminiferaWinkl)[14]、燕麥(AvenasativaL.)[15]、水稻(OryzasativaL.)[16]等種子的萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用。GA屬于雙萜類物質(zhì)，它能促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長，加速葉芽生長，影響植物淀粉酶等代謝酶的活性，有效打破種子休眠[17]。GA3能有效打破蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)[18]、滇油杉(KeteleeriaevelynianaMast.)[11]、杜鵑紅山茶(CamelliaazaleaWei)[19]等種子的休眠。在利用山韭種子作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)體系建立過程中發(fā)現(xiàn)，長期保存后的山韭種子在萌發(fā)過程中存在發(fā)芽率較低、發(fā)芽勢較差等問題，而在已有研究中，關(guān)于植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)山韭種子萌發(fā)影響的研究較少，因此本試驗(yàn)通過研究不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)山韭種子萌發(fā)特性、相關(guān)酶活性和內(nèi)源激素含量的影響，揭示植物生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)山韭種子萌發(fā)的生理影響途徑，以期為山韭組培和遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及大面積推廣栽培利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1種子 供試材料為成熟的山韭種子，種子收獲于2019年9月東北農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)試驗(yàn)田(126°73′ N,45°75′ E，海拔134 m)。收獲后風(fēng)干脫粒，清選籽粒飽滿的山韭種子置于4℃冰箱保存。千粒重約為2.03 g，含水量約為6.77%。

1.1.2試驗(yàn)試劑 試驗(yàn)中所用的ABA和GA3均購于博奧拓達(dá)公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度處理Table 1 Treatment concentrations of plant growth regulators

1.3 測定方法

1.3.1萌發(fā)指標(biāo) 種子萌發(fā)試驗(yàn)持續(xù)15天，在第7天計(jì)算山韭種子的發(fā)芽勢，在第15天計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和苗鮮重，并計(jì)算活力指數(shù)，每天上午統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)。有關(guān)計(jì)算公式如下：

發(fā)芽勢(%)=

(7天內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%

發(fā)芽率(%)=

(15天內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)

活力指數(shù)=GI×S

式中：Dt表示在t日的發(fā)芽數(shù)；Gt表示相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)，S為萌發(fā)結(jié)束時(shí)鮮苗的平均芽長(mm)。

1.3.2胚根、胚芽長度及胚根、胚芽鮮重 15天發(fā)芽結(jié)束后，將山韭幼苗用蒸餾水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面水分。每個(gè)處理隨機(jī)取10株測量胚芽長、胚根長和胚根胚芽的鮮重。

1.3.3生理指標(biāo)測定 可溶性蛋白(Soluble protein，SP)和可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量，淀粉酶(Amylase，AL)、脂肪酶(Lipase，LPS)和中性蛋白酶(Neutral protease，NP)活性，均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司測定試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.4內(nèi)源激素的測定 吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、ABA,GA3和乙烯(Ethrel，ETH)含量均采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司試劑盒進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表制作采用Microsoft Office Excel 2010軟件，采用IBM SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性方差分析并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(Duncan)，主成分分析及相關(guān)性分析采用Origin 2021軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA和GA3處理對(duì)山韭種子發(fā)芽的影響

由表2可知，與CK(對(duì)照)處理相比，ABA處理顯著提高了山韭種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(P<0.05)。隨著ABA濃度的升高，山韭種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)呈先上升后下降的趨勢，均在ABA濃度為100 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高，分別為33.33%和32.77。隨著ABA濃度的升高，山韭種子的發(fā)芽率與CK處理相比總體呈現(xiàn)升高趨勢，在濃度為100 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高84%。ABA濃度為50 mg·L-1時(shí)山韭種子的活力指數(shù)達(dá)到最大值，顯著高于其他濃度(P<0.05)，之后隨ABA濃度的升高，山韭種子的活力指數(shù)則有不同程度的降低。

表2 ABA處理對(duì)山韭種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of ABA treatments on seed germination of Allium senescens L.

由表3可知，隨著GA3處理濃度的升高，山韭種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈先升高后降低的趨勢。100 mg·L-1的GA3處理下，山韭種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與CK相比均有顯著提升(P<0.05)，且均在GA3濃度為100 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，分別為20.67%，79.33%，26.37，1 081.30。當(dāng)GA3濃度增加到200 mg·L-1時(shí)，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有顯著下降(P<0.05)，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)均隨GA3濃度的增加而下降，當(dāng)GA3濃度增加到800 mg·L-1時(shí)，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)降到最低，分別為2.67%，54.67%，184.54。

表3 GA3處理對(duì)山韭種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of GA3 treatments on seed germination of Allium senescens L.

2.2 ABA和GA3處理對(duì)山韭胚根和胚芽的影響

不同濃度的ABA處理對(duì)山韭胚芽和胚根影響不同。從圖1A可知，ABA處理對(duì)山韭胚芽和胚根長有顯著影響(P<0.05)，山韭胚芽長和胚根長均在ABA濃度為50 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，分別為42.67 mm，12.67 mm，且胚芽長顯著高于CK。而當(dāng)ABA升高到75 mg·L-1時(shí)，胚芽長和胚根長則降低到最低，分別為22.33 mm，2.33 mm。隨著ABA濃度的升高，胚芽重與CK相比有所增加(圖1B)。其中，當(dāng)ABA濃度增加到50 mg·L-1時(shí)，胚芽重顯著高于CK且達(dá)到最大值為0.162 g(P<0.05)，胚根重也在此時(shí)達(dá)到最大值，為0.003 0 g。而當(dāng)ABA升高到75 mg·L-1時(shí)，胚根重顯著低于CK且下降到最低(P<0.05)，為0.001 1 g。圖1C表明，隨著ABA濃度的增加，山韭胚芽胚根長比和胚芽胚根重比總體呈上升后下降的趨勢。當(dāng)ABA升高到75 mg·L-1時(shí)，胚芽胚根長比和胚芽胚根重比均達(dá)到最高，分別為12.42，17.64。其中，胚芽根長比總是大于胚芽胚根重比。

圖1 ABA和GA3處理對(duì)山韭胚根和胚芽生長的影響Fig.1 Effects of ABA and GA3 treatments on seedling growth of Allium senescens L.注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，CK為對(duì)照組，下同Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05),CK is the control group,the same as below

由圖1可知，不同濃度的GA3處理下的山韭胚芽和胚根生長情況不同，GA3處理對(duì)山韭胚芽和胚根有顯著影響(P<0.05)。圖1D表明，隨著GA3濃度的增加，山韭胚芽和胚根長呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)GA3濃度增加到50 mg·L-1時(shí)，山韭的胚根長與CK相比顯著增加且達(dá)到最高(P<0.05)，其值為41 mm；而當(dāng)GA3濃度增加到100 mg·L-1時(shí)，與CK相比，山韭的胚芽長顯著增加且最高，值為20 mm。由圖1E可見，當(dāng)GA3濃度為100 mg·L-1時(shí)，胚根重升高到最大值，為0.003 3 g。當(dāng)GA3濃度升高到400 mg·L-1時(shí)，胚根重顯著低于CK且最小(P<0.05)，為0.000 3 g。山韭胚芽胚根長比和胚芽胚根重比在隨GA3濃度的增加呈先下降后上升的趨勢。當(dāng)GA3濃度為100 mg·L-1時(shí)，胚芽胚根長和胚芽胚根重的比值最接近，且此時(shí)胚芽胚根重值最低，為2.30。當(dāng)GA3濃度為800 mg·L-1時(shí)，胚芽胚根長比和胚芽胚根重比均達(dá)到最大值，分別為9.06，10.05(圖1F)。

2.3 ABA和GA3處理對(duì)山韭胚芽生理指標(biāo)和酶活性的影響

由圖2可知，與CK相比，100 mg·L-1ABA處理和100 mg·L-1GA3處理下的山韭胚芽可溶性蛋白含量顯著升高(P<0.05)，但二者之間無顯著差異。而山韭胚芽可溶性糖含量在100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理后均與CK相比沒有顯著變化(P<0.05)，但其含量均有增加。在酶活性方面：山韭胚芽的α-淀粉酶、β-淀粉酶、α+β淀粉酶在100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理下，與CK間均沒有顯著差異，但均有上升趨勢；而與CK相比，100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理下脂肪酶和蛋白酶均有顯著升高(P<0.05)，其中100 mg·L-1GA3處理下蛋白酶活性最高，值為9 867.79 μmol·min-1·g-1。

圖2 ABA和GA3處理對(duì)山韭胚芽生理指標(biāo)和酶活性的影響Fig.2 Effects of ABA and GA3 treatments on physiological and enzymatic activity of Allium senescens L.注：ABA為脫落酸，GA3為赤霉素，下同Note:ABA is abscisicacid,GA3 is gibberellins,the same as below

2.4 ABA和GA3處理對(duì)山韭胚芽內(nèi)源激素含量的影響

由圖3可知，100 mg·L-1ABA處理和100 mg·L-1GA3處理對(duì)山韭胚芽內(nèi)源激素含量有顯著影響。與CK相比，ABA處理后的山韭胚芽內(nèi)源ABA含量顯著降低，GA3處理后的內(nèi)源IAA含量顯著降低(P<0.05)。ABA和GA3處理下的山韭胚芽內(nèi)源ETH含量與CK相比均有顯著升高，且GA3處理下的ETH含量顯著高于ABA處理(P<0.05)。ABA處理下的山韭胚芽內(nèi)源GA3含量顯著高于CK和GA3處理，而GA3處理下的內(nèi)源GA3含量則顯著低于CK(P<0.05)。

2.5 ABA和GA3處理下山韭種子萌發(fā)各指標(biāo)的綜合分析

由圖4A可知，各指標(biāo)主要集中在一、二、四象限，也就是分布在100 mg·L-1ABA處理和100 mg·L-1GA3處理之間。其中，胚芽胚根長比、GA3含量、胚芽胚根重比、胚芽重和IAA主要分布在100 mg·L-1ABA處理下，說明其相關(guān)性較強(qiáng)；而在100 mg·L-1GA3處理附近主要分布的是胚根重、胚根長、胚芽長、ABA和ETH，說明這幾個(gè)指標(biāo)之間距離較近，相關(guān)性也較強(qiáng)；在ABA和GA3處理下，β-淀粉酶和α+β淀粉酶之間距離很近，說明二者之間有很強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系；發(fā)芽率、可溶性蛋白和α-淀粉酶之間距離較近，說明三者之間相關(guān)性較強(qiáng)。由圖4B可知，發(fā)芽率與發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、可溶性蛋白、α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶之間有極強(qiáng)相關(guān)性；發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)、可溶性糖、α-淀粉酶之間有較強(qiáng)相關(guān)性；發(fā)芽指數(shù)與可溶性蛋白、可溶性糖、α-淀粉酶之間有很強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系；活力指數(shù)與酶活性和可溶性蛋白之間有強(qiáng)相關(guān)性；胚芽長與胚根長、胚根重、ABA，ETH之間有很強(qiáng)相關(guān)性，而與胚芽胚根長比、胚芽胚根重比、IAA,GA3之間有很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系；胚芽重則與胚芽長相反，它與胚根長、胚根重、ABA，ETH有強(qiáng)負(fù)相關(guān)性而與胚芽胚根長比、胚芽胚根重比、IAA，GA3之間有強(qiáng)相關(guān)關(guān)系；胚根長、胚根重均與胚芽胚根長比、胚芽胚根重比、IAA，GA3之間負(fù)相關(guān)；同時(shí)，ABA與IAA和GA3之間也負(fù)相關(guān)；IAA和ETH之間也有強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性。

圖3 ABA和GA3處理對(duì)山韭胚芽內(nèi)源激素的影響Fig.3 Effects of ABA and GA3 treatments on endogenous hormone of Allium senescens L.注：IAA為吲哚乙酸，ETH為乙烯，下同Note:IAA is indole-3-acetic acid,ETH is ethrel,the same as below

3 討論

除環(huán)境因子對(duì)種子的萌發(fā)有顯著影響外，植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)種子萌發(fā)也有很大影響[22-23]。研究表明，低濃度的外源ABA處理可以降低內(nèi)源ABA含量，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)和生長[24]。黃宇等[25]認(rèn)為，適宜濃度的ABA可以顯著促進(jìn)水稻種子的萌發(fā)和幼苗生長。本研究表明，隨著ABA濃度的增加，山韭種子的發(fā)芽指標(biāo)和幼苗形態(tài)指標(biāo)均呈先增加后降低的趨勢，在ABA濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)山韭種子的萌發(fā)情況達(dá)到最佳。GA3作為一種信號(hào)物質(zhì)，對(duì)種子萌發(fā)有顯著地促進(jìn)作用，主要有加速細(xì)胞分裂、促進(jìn)成熟細(xì)胞伸長的作用[20,26-27]。本研究表明，50～800 mg·L-1GA3浸種處理對(duì)山韭種子的萌發(fā)和幼苗生長表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制的效果。這與李超等[28]對(duì)燈籠樹(EnkianthuschinensisFranch.)種子萌發(fā)的研究結(jié)果相同。

種子成熟的過程中會(huì)積累大量的可溶性糖、可溶性蛋白等貯藏物質(zhì)，當(dāng)種子打破休眠開始萌發(fā)時(shí)，就會(huì)消耗種子內(nèi)部的可溶性糖和貯藏蛋白[29]。而貯存物質(zhì)分解需要酶的參與，因此，與貯存物質(zhì)分解有關(guān)的酶活性增加是促進(jìn)種子萌發(fā)的重要原因[30]。吳玉香等[31]在對(duì)西洋杜鵑的研究中表明，GA3處理后會(huì)使其內(nèi)部的可溶性糖、可溶性蛋白發(fā)生不同的變化。本試驗(yàn)中，100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理后的山韭種子可溶性蛋白和蛋白酶均有顯著增加，這與秦祎婷等[32]用ABA對(duì)東北紅豆杉(TaxuscuspidateSieb. et Zucc.)的研究結(jié)論一致。

圖4 ABA和GA3處理下山韭各指標(biāo)主成分分析和相關(guān)性分析Fig.4 Principal component analysis and correlation analysis of all indices of Allium senescens L. in ABA and GA3 treatment

種子在萌發(fā)過程中與其內(nèi)源激素含量的變化密切相關(guān)，內(nèi)源激素能夠誘導(dǎo)貯藏物質(zhì)的分解及合成并最終使種子的發(fā)芽[33]。本研究表示，100 mg·L-1ABA顯著增加了山韭胚芽GA3的含量，而顯著降低了胚芽ABA的含量；且100 mg·L-1GA3顯著降低了山韭胚芽IAA的含量，這與袁夢佳等[34]在赤霉素浸種對(duì)柴胡(BupleurumchinenseDC.)種子的研究結(jié)論相同。ABA和GA3處理均顯著增加了山韭胚芽ETH含量，GA3處理下山韭胚芽ABA和ETH含量成正比，這與黎正英等[35]的研究結(jié)果相同。發(fā)芽率與發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、可溶性蛋白含量、α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性、脂肪酶活性之間呈正相關(guān)性，說明發(fā)芽指標(biāo)與淀粉酶活性、脂肪酶活性和可溶性蛋白含量之間密切相關(guān)性，這與雍太文等[36]在外源ABA含量對(duì)雜交水稻種子萌發(fā)的研究結(jié)論一致。ABA與GA3含量之間呈負(fù)相關(guān)性，說明ABA具有拮抗GA3的作用，這與Birgit[37]和Rohde[38]等人的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

綜合種子發(fā)芽情況及形態(tài)指標(biāo)，100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3是促進(jìn)山韭萌發(fā)的最佳濃度。100 mg·L-1ABA和100 mg·L-1GA3處理顯著提高了發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚芽胚根長和胚芽胚根重且均顯著提高了可溶性蛋白含量、脂肪酶和蛋白酶活性。100 mg·L-1GA3處理顯著提高了山韭胚芽ETH含量和ABA含量，100 mg·L-1ABA的處理顯著增加了山韭胚芽GA3含量但顯著降低了ABA含量。主成分分析和相關(guān)性分析表明：山韭種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與可溶性蛋白、可溶性糖含量以及酶活性之間顯著正相關(guān)。