芮亞培，陳 穎，趙 聘，黃 立，劉 濤，馬全朝，丁志剛，楊新亞，張文翔，王 偉，李森茂，盛 偉，李 華，邱 剛*

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南信陽(yáng) 464001；2.固始縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南固始 465250；3.信陽(yáng)市平橋區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南信陽(yáng) 464000）

1 獸藥殘留概況

1.1 獸藥殘留現(xiàn)狀 2017年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃結(jié)果顯示，畜禽產(chǎn)品合格率為99.72%（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告，2017）。2019年山東省雞蛋中檢出批數(shù)最多的藥物是氟苯尼考，檢出率較高的有恩諾沙星和環(huán)丙沙星（楊修鎮(zhèn)等，2020）。2016年云南省部分地區(qū)的67份雞蛋檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類(lèi)藥物的檢出率為4.48%（楊萍等，2017）。2017年杭州市88份動(dòng)物性食品喹諾酮類(lèi)藥物總檢出率為19.4%，在陽(yáng)性樣品中恩諾沙星的檢出比例最高，為68%（劉少穎等，2018）。2018年京冀兩地動(dòng)物源性食品樣品檢測(cè)中71批雞肉恩諾沙星不合格率為1.41%，62批雞蛋中恩諾沙星不合格率為4.84%（許健和彭婷婷，2020）。以上研究表明，喹諾酮類(lèi)藥物殘留是食品檢測(cè)不合格的重要原因，且以恩諾沙星所占比例較高。

1.2 高效液相色譜儀適用性

1.2.1 高效液相色譜儀的定量方法 外標(biāo)法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，適用于樣本量較大的檢測(cè)，且外標(biāo)法與內(nèi)標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異（許健和彭婷婷，2020）。

1.2.2 高效液相色譜儀的優(yōu)勢(shì) 氣相色譜對(duì)分析化合物要求較高，在應(yīng)用范圍存在一定限制（周春紅等，2011）。高效液相色譜儀應(yīng)用范圍廣，大多數(shù)有機(jī)物可使用高效液相色譜分析，且對(duì)大分子，強(qiáng)極性，高沸點(diǎn)，熱穩(wěn)定性差的化合物仍有較好的分析效果，較好的解決了氣相色譜應(yīng)用范圍小的問(wèn)題。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用在色譜分離基礎(chǔ)上利用質(zhì)荷比進(jìn)行二次分離，用保留時(shí)間和離子豐度比雙重定性較高效液相色譜儀更加準(zhǔn)確，但液質(zhì)聯(lián)用儀的價(jià)格遠(yuǎn)高于高效液相色譜儀，在我國(guó)獸藥殘留檢測(cè)一線(xiàn)較難普及（李國(guó)琛等，2020）。

1.3 獸藥殘留檢測(cè)趨勢(shì) 在新基質(zhì)中檢測(cè)獸藥殘留。大多數(shù)抗生素的活性成分在給藥后以原型或新陳代謝的形式排出體外，通過(guò)檢測(cè)糞便和尿液可以了解抗生素在牲畜中的使用情況（Patyra等，2020）。也可通過(guò)對(duì)馬的毛發(fā)進(jìn)行檢測(cè)和定量去了解使用藥物種類(lèi)和用藥時(shí)間（Madry等，2016）。該方法為馬的用藥回顧性追蹤提供了非常有價(jià)值的工具。

同時(shí)，測(cè)定食品中多類(lèi)別、多組分的獸藥殘留。液質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合QuEChERS-MAS分散式固相萃取凈化方法可同時(shí)測(cè)定雞蛋中38種藥物（王嬌等，2020）。QuEChERS EMR-Lipid技術(shù)結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用可以檢測(cè)豬肉中55種獸藥殘留（黃澤瑋等，2019）。

1.4 研究意義 我國(guó)規(guī)定蛋雞產(chǎn)蛋期禁用恩諾沙星，但多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)存在養(yǎng)殖密度過(guò)大，環(huán)境衛(wèi)生惡劣等問(wèn)題，需要使用大量的廣譜抗生素。恩諾沙星屬于喹諾酮類(lèi)抗生素，長(zhǎng)期過(guò)量食用恩諾沙星超標(biāo)的食品會(huì)損害肝臟，影響神經(jīng)系統(tǒng)和軟骨的發(fā)育。長(zhǎng)期濫用抗生素會(huì)導(dǎo)致菌群耐藥性逐漸增強(qiáng)，使得治療相關(guān)感染失敗和感染嚴(yán)重的頻率提高。長(zhǎng)時(shí)間或大劑量的喹諾酮類(lèi)藥物會(huì)致癌、致畸、致突變。研究表明，喹諾酮類(lèi)抗生素內(nèi)服后會(huì)迅速吸收，在體內(nèi)廣泛分布，后經(jīng)肝臟代謝特異性蓄積在卵黃中，導(dǎo)致蛋黃殘留的時(shí)間延遲（陳佳靜等，2020）。恩諾沙星分子及其代謝物在雞蛋煮沸、微波和煎蛋的過(guò)程中是穩(wěn)定的（Canton等，2019）。恩諾沙星在雞蛋中易蓄積且代謝緩慢，停藥25 d后儀器才未檢測(cè)出恩諾沙星（侯軒等，2020）。恩諾沙星是養(yǎng)殖過(guò)程中的常用藥物，且在雞蛋中易蓄積，代謝緩慢，烹飪過(guò)程中穩(wěn)定不易被破壞，對(duì)人體危害較大。因此，雞蛋中恩諾沙星的獸藥殘留檢測(cè)意義重大。

2 材料與方法

2.1 試劑 85%磷酸；三乙胺；氫氧化鈉；磷酸二氫鉀；正乙烷均為分析純（鄭州派尼化學(xué)試劑廠(chǎng)）；甲醇（美國(guó)Fisher）；乙腈（鄭州派尼化學(xué)試劑廠(chǎng)）為色譜純；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；超純水。

2.2 儀器 Waters e2695（配備2998 PDA Detector檢 測(cè) 器）；色 譜 柱 WAT054275（C18 250mm 5μm）；色譜柱 WAT045905（C18 150mm 5μm）；ME204E電子天平（梅特勒-托利多）；PH測(cè)定儀（上海精科）；100μL移液槍?zhuān)―ragonLab）；1 mL移液槍?zhuān)―ragonLab）；真空泵（上海亞榮生化儀器）；JJ-2BS勻漿機(jī)；QL-902渦旋儀（海門(mén)其林貝爾）；LKTC-L水浴加熱鍋；L400離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 稱(chēng)取0.12 g氫氧化鈉于燒杯中，用100 mL超純水溶解，獲得0.03 mol/L氫氧化鈉溶液。稱(chēng)取10 mg恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL棕色容量瓶中，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度線(xiàn)，獲得1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。從1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中量取100μl置于10 mL棕色容量瓶中，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度線(xiàn)，獲得10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。重復(fù)上述操作可獲得0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

從10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中量取500μL置于10 mL棕色容量瓶中，使用流動(dòng)相磷酸三乙胺-乙腈（82：18）稀釋定容，獲得 500μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。從10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中量取100μL置于10 mL棕色容量瓶中流動(dòng)相定容，獲得100μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。從0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中量取500μL置于10 mL棕色容量瓶中流動(dòng)相定容，獲得5μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

通過(guò)上述的操作獲得5、100、500μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。將標(biāo)準(zhǔn)工作液裝入樣品小瓶送入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以恩諾沙星的濃度為橫坐標(biāo)，色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)繪制。

2.3.2 儀器參數(shù) 本次試驗(yàn)的儀器參數(shù)參考農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告中動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)高效液相色譜法。色譜柱WAT045905（C18 150 mm 5μm）與 公 告 中 色 譜 柱（C18 250 mm 5μm）有所不同，流動(dòng)相A：0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液（85%磷酸量取1.7 mL用超純水稀釋至500 mL，加入三乙胺調(diào)定pH至2.4）流動(dòng)相C：乙腈，流動(dòng)相A（82%）與流動(dòng)相（18%）的比例進(jìn)行等度洗脫，流速：0.8 mL/min，每個(gè)樣品運(yùn)行5 min，進(jìn)樣量：20μL，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

2.3.3 樣品前處理 本次樣品前處理參考高效液相色譜法快速測(cè)定飼料和雞蛋中5種氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留。稱(chēng)取10 g氫氧化鈉置于燒杯中用50 mL超純水溶解，獲得5 mol/L氫氧化鈉溶液。稱(chēng)取磷酸二氫鉀3.4 g置于燒杯中用250 mL超純水溶解，再加入5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)定pH至7.0，獲得0.1 mol/L磷酸緩沖液。

將飼料（加入一定比例蒸餾水）或雞蛋樣品加入到勻漿機(jī)中勻漿，稱(chēng)取勻漿后的樣品2 g置于15 mL離心管中，加入1.25 mL乙腈后渦旋1 min，向離心管中加入0.1 mol/L磷酸緩沖液至13 mL刻度線(xiàn)，渦旋1 min。將離心管放入55℃水浴加熱鍋中加熱20 min后渦旋1 min，冷卻至室溫后加入2 mL正乙烷，渦旋1 min，離心管放入離心機(jī)中以4000 r/min離心15 min，棄去上層的正乙烷，取下層清液，通過(guò)0.22μm的一次性針式過(guò)濾器后裝入樣品小瓶。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 本次試驗(yàn)使用濃度為5、100、500μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液送入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測(cè)，獲得3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖，以恩諾沙星的濃度為橫坐標(biāo)，色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=1.51e+02X+2.22e+03，R2=0.999650。相關(guān)系數(shù)（R2）是試驗(yàn)數(shù)據(jù)和擬合函數(shù)之間吻合程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)系數(shù)的值越接近1代表試驗(yàn)數(shù)據(jù)和擬合函數(shù)的吻合程度越高。R2=0.999650說(shuō)明本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)與擬合函數(shù)間吻合度高，誤差較小。

3.2 實(shí)際檢測(cè) 本次試驗(yàn)檢測(cè)的飼料和雞蛋分別從飼料店、兩個(gè)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。利用建立的方法對(duì)3批次飼料和150批次雞蛋進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果合格率為100%。表明150批次飼料和雞蛋樣品質(zhì)量安全，不含恩諾沙星。高效液相色譜儀通過(guò)保留時(shí)間定性，由圖1標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖可知恩諾沙星的保留時(shí)間為2.874 min。在樣品色譜圖2.874 min未見(jiàn)色譜峰則認(rèn)為該樣品中不含恩諾沙星。

圖1 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和色譜圖

圖2 樣品檢測(cè)圖

4 討論

4.1 色譜條件優(yōu)化 本試驗(yàn)將WAT054275（C18，250 mm 5μm） 和 WAT045905（C18，150 mm 5μm）兩種不同長(zhǎng)度的色譜柱進(jìn)行了對(duì)比。由圖3可知，250 mm色譜柱的保留時(shí)間為7.842 min，150 mm色譜柱的保留時(shí)間為2.874 min。色譜柱的柱效是以每米塔板數(shù)來(lái)計(jì)量的，色譜柱的長(zhǎng)度與柱效和分離度成正比，但色譜柱長(zhǎng)度的增加會(huì)導(dǎo)致分析時(shí)間的延長(zhǎng)和成本的增加（許建軍等，2019）。本試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)工作液送入高效液相色譜儀并換上150 mm的色譜柱進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)色譜峰峰形良好，分離效果滿(mǎn)足試驗(yàn)需要，且分析時(shí)間縮短。

圖3 250nm和150nm色譜柱色譜圖的對(duì)比

4.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化 本次試驗(yàn)利用水溶性有機(jī)溶劑乙腈作為去蛋白試劑，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵變化而出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀（晉齊中等，2014）。在加入乙腈后再水浴加熱20 min幫助蛋白質(zhì)快速沉淀，可較完全除去飼料和雞蛋中的蛋白質(zhì)，避免對(duì)儀器的污染。根據(jù)相似相溶原理，飼料和雞蛋中的脂類(lèi)溶解于正己烷，且正己烷的密度較小處于液體上層較易除去。目標(biāo)物恩諾沙星溶于磷酸緩沖液中，使用渦旋儀充分混勻溶解。被渦旋振蕩的提取液充分乳化，有利于在低速離心時(shí)形成結(jié)構(gòu)較緊密的絮狀層，使下層溶液清澈透明（楊嘉偉等，2016）。

4.3 樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)的意義 2019年國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督抽檢中恩諾沙星和環(huán)丙沙星不合格率為1.3%，同年的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全專(zhuān)項(xiàng)整治禽蛋產(chǎn)品的監(jiān)督抽查中恩諾沙星的不合格率為1%（彭文繡等，2020）。喹諾酮類(lèi)藥物因抗菌譜廣和價(jià)格低廉等原因廣受畜禽養(yǎng)殖業(yè)的青睞。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)2020年將停止生產(chǎn)、進(jìn)口、經(jīng)營(yíng)、使用部分藥物飼料添加劑，退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加劑品種。目前多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)存在雞群密度高、衛(wèi)生環(huán)境差等問(wèn)題，且抗生素替代物的研究有限，與抗生素的效果相比還存在較大差距。本次樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)幫助我們了解第194號(hào)公告發(fā)布后市場(chǎng)上雞蛋中恩諾沙星的獸藥殘留情況。

4.4 對(duì)策與建議

4.4.1 加強(qiáng)檢測(cè)，嚴(yán)厲打擊 對(duì)地區(qū)內(nèi)的養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行全面排查，并做好相應(yīng)記錄，建立“黑名單”，對(duì)檢測(cè)不合格的養(yǎng)殖場(chǎng)依法進(jìn)行嚴(yán)厲處罰。中國(guó)獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)仍存在種類(lèi)不全面、限量值有待研究等問(wèn)題，應(yīng)加快制定科學(xué)全面且符合國(guó)情的中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，推動(dòng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定工作（張凱華等，2016）。

4.4.2 推廣使用非抗生素類(lèi)飼料添加劑 微生態(tài)制劑在腸道中可分泌有機(jī)酸，抑制病原菌，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，產(chǎn)生的代謝物和酶可形成化學(xué)屏障（周芷錦和穆琳，2020）。中藥抗菌成分眾多，可通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性、影響蛋白質(zhì)和核酸的合成等方式產(chǎn)生抗菌作用（樸喜航和艾紅佳，2017）。噬菌體因其特異性強(qiáng)、無(wú)明顯副作用成為抗生素替代物中的一種。

5 結(jié)論

本文在國(guó)標(biāo)動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)高效液相色譜法和其他參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了快速檢測(cè)雞蛋中恩諾沙星的方法，并對(duì)三地飼料和雞蛋進(jìn)行檢測(cè)。該方法樣品前處理較方便、快捷，無(wú)需使用固相萃取儀，且使用150 mm短色譜柱分析時(shí)間較短。飼料和雞蛋樣品的檢測(cè)為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告實(shí)行后市場(chǎng)上飼料中和雞蛋恩諾沙星的獸藥殘留情況提供參考。