劉瑞芳,張志遠(yuǎn),陳 球,王藝偉,蘇利紅
(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100)
粗蛋白質(zhì)是飼料中最重要的營養(yǎng)物質(zhì),其含量直接影響動(dòng)物的生長速度、新陳代謝、繁殖發(fā)育和生產(chǎn)性能。飼料中蛋白質(zhì)含量是評(píng)定飼料營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一(伊麗君和孫強(qiáng),2020)。因此,快速、準(zhǔn)確測定飼料中粗蛋白質(zhì)含量,在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要意義(于菲等,2019;丁進(jìn)海,2015;朱宇旌等,2011)。飼料中粗蛋白質(zhì)檢測的方法有多種,常用的是國標(biāo)測定法——?jiǎng)P氏定氮法。凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)的過程包括消化、蒸餾、吸收和滴定4個(gè)環(huán)節(jié),消化是影響蛋白質(zhì)測定效率和成敗的關(guān)鍵(藍(lán)億陽等,2019;劉慶等,2015)。國標(biāo)法用硫酸銅和硫酸鉀作催化劑進(jìn)行消化,因其使用量較大易造成消化液冷卻后出現(xiàn)大量結(jié)晶而影響后續(xù)的測定,同時(shí)消化時(shí)間較長(張澤泉等,2017;曲玲等2015)。在確保測定結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下,如何縮短檢測時(shí)間、降低試驗(yàn)成本、提高試驗(yàn)效率是飼料粗蛋白質(zhì)測定需要改進(jìn)的首要問題。本試驗(yàn)通過研究添加硒粉的混合催化劑對(duì)飼料粗蛋白質(zhì)含量測定的影響,旨在篩選最佳的組合水平。
1.1 試驗(yàn)材料 玉米青貯由西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)基地提供。采用四分法將試樣縮減至1 kg,65℃烘箱烘干、粉碎、過40目篩,制成的風(fēng)干樣裝于密閉容器備用。
1.2 試劑及配制方法
1.2.1 主要試劑 硫酸銅·5H2O、硫酸鉀(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、碳酸鈉(分析純)、硼酸(分析純)、硒粉(分析純),購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲基紅(分析純)、溴甲酚綠(分析純),購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸(98%,分析純),濃鹽酸(分析純),購于上海源葉生物科技有限公司。
1.2.2 試劑配制
(1)40% NaOH溶液:準(zhǔn)確稱取400 g氫氧化鈉(分析純),用蒸餾水溶解,定容至1000 mL。
(2)混合指示劑:準(zhǔn)確稱取0.1 g甲基紅,用無水乙醇將其溶解,定容至100 mL,制成甲基紅0.1%的乙醇溶液;準(zhǔn)確稱取0.5 g溴甲酚綠,用無水乙醇將其溶解,定容至100 mL,制成溴甲酚綠0.5%的乙醇溶液;然后將兩者等體積混合,裝于棕色試劑瓶,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)2%硼酸溶液:準(zhǔn)確稱取20 g硼酸(分析純),用蒸餾水將其溶解,定容至1000 mL。
(4)0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:用移液管準(zhǔn)確移取8.3 mL濃鹽酸(分析純),緩慢注入蒸餾水中,搖勻,定容至1000 mL,然后用碳酸鈉標(biāo)定后備用。
1.3 主要儀器 半自動(dòng)凱氏定氮儀(型號(hào)為KDNAA),由上海新嘉電子科技有限公司生產(chǎn);消化爐(型號(hào)為AED-AV),由北京博瑞賽儀器有限公司生產(chǎn);鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)為DHG-9123),由湖南湘儀儀器有限公司生產(chǎn);粉碎機(jī)(型號(hào)為FW-500D),由天津鑫博得儀器有限公司生產(chǎn);分析天平(型號(hào)為ATY220),由日本島津有限公司生產(chǎn)。
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 硒粉用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 用分析天平準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g(精確至0.0002 g),小心無損地將試樣放入干凈的消化管底部(每個(gè)水平稱取5個(gè)平行樣),然后加入0.2 g硫酸銅·5H2O,1.0 g硫酸鉀和不同量的硒粉(0.05、0.10、0.15、0.2、0.3、0.4g),使其與試樣均勻混合。再向消化管中緩慢加入12 mL濃硫酸,然后置于420℃的消化爐上消化2 h,待消化管中液體徹底透明清亮結(jié)束消化。將堿管和水管分別插入裝有40%氫氧化鈉溶液和蒸餾水的桶中,設(shè)定加堿量為5 mL和蒸餾時(shí)間為6 min,打開冷凝水和電源,對(duì)凱氏定氮儀管路清洗3~5次后,將消化管置于凱氏定氮儀,同時(shí)用裝有20 mL 2%硼酸和2滴混合指示劑的三角瓶吸收氨氣。蒸餾結(jié)束后,立即用0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收液,當(dāng)溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為滴定終點(diǎn),記錄鹽酸用量。
2.1.2 硫酸銅用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g(精確至0.0002 g),小心無損地將試樣放入干凈的消化管底部(每個(gè)水平稱取5個(gè)平行樣),然后加入1.0 g硫酸鉀、硒粉(2.1.1篩選的最佳量)、不同量的硫酸銅·5H2O(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4 g),使其與試樣均勻混合,后續(xù)測定步驟同上。
2.1.3 硫酸鉀用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g(精確至0.0002 g),小心無損地將試樣放入干凈的消化管底部(每個(gè)水平稱取5個(gè)平行樣),然后加入硒粉(2.2.1篩選的最佳量)、硫酸銅·5H2O(2.1.2篩選的最佳量)和硫酸鉀(2、2.5、3、3.5、4、5 g),使其與試樣均勻混合,后續(xù)測定步驟同上。
2.2 正交試驗(yàn)
在結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)影響粗蛋白質(zhì)含量的催化劑(硒粉、硫酸銅和硫酸鉀)用量進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)(如表1)。
表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的處理因素及水平 g
2.3 空白測定 準(zhǔn)確稱取0.5 g蔗糖代替試樣,按上述步驟進(jìn)行空白測定,消耗0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積不得超過0.2 mL。
2.4 改進(jìn)法和國標(biāo)法對(duì)粗蛋白質(zhì)含量測定的比較 準(zhǔn)確稱取試樣1.0 g(精確至0.0002 g),每種方法稱取5個(gè)平行樣,改進(jìn)法稱取硒粉0.2 g、硫酸銅0.2 g、硫酸鉀3 g作催化劑;國標(biāo)法稱取硫酸銅0.4 g、硫酸鉀6 g作催化劑。兩種方法硫酸用量、消化溫度和消化時(shí)間均相同且同上,后續(xù)方法和測定步驟同上。
2.5 結(jié)果計(jì)算
CP/%=c×(V1- V2)×0.014×F/M×100。
式中:c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度,mol/L;V1為滴定試樣時(shí)所需的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液體積,mL;V2為滴定空白時(shí)所需的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液體積,mL;0.014為1 mL的1 mol/L鹽酸相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量;M為樣品的質(zhì)量,g;CP為粗蛋白質(zhì)含量。
F為氮轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)的系數(shù)(取均值6.25)。
2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 硒粉、硫酸銅和硫酸鉀最適添加量試驗(yàn)用單因素方差分析。在單因素方差分析中用Duncan’s法對(duì)不同添加量組間均數(shù)進(jìn)行多重比較。3種催化劑和3種添加劑量正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用雙因素方差分析檢驗(yàn)催化劑和添加量組合間差異,篩選3種催化劑最佳劑量組合。用SAS 21.0軟件中ANOVA過程執(zhí)行單因素和雙因素方差分析,主效應(yīng)和多重比較顯著水平為P<0.05,結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。
3.1 單因素試驗(yàn)
3.1.1 硒粉用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 由表2可知,隨著硒粉用量的增加,粗蛋白質(zhì)含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。其中處理4所測玉米青貯的粗蛋白質(zhì)含量最高,顯著高于處理1和處理2(P<0.05),與其他處理差異不顯著(P>0.05)。從結(jié)果分析可知,可能由于處理1和處理2的硒粉用量偏少,樣品消化不徹底,從而導(dǎo)致測定的粗蛋白質(zhì)含量偏低。處理5和處理6所測粗蛋白質(zhì)含量低于處理3和處理4,可能由于硒粉用量過多導(dǎo)致氮的損失所致,該結(jié)果與陸曉濱等(2003)、楊文華(2017)的報(bào)道結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)果表明,硒粉的最佳用量為0.2 g。
表2 硒粉用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響
3.1.2 硫酸銅用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 由表3可知,處理2~6中所測粗蛋白質(zhì)含量高于處理1,但差異不顯著(P>0.05)。處理2~6中,隨著硫酸銅用量的增加,粗蛋白質(zhì)含量無明顯變化,但消化管中出現(xiàn)結(jié)晶的現(xiàn)象明顯增多,特別是處理5和處理6,消化管中的結(jié)晶片為后續(xù)測定帶來影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,過量使用硫酸銅不影響粗蛋白質(zhì)的含量,但影響消化液的結(jié)晶狀況。該結(jié)論與顏常盛(2020)、李敏等(2015)、張生輝(2009)的研究結(jié)果一致。綜合試樣蛋白質(zhì)含量和消化管中結(jié)晶的程度來考慮,添加0.2 g硫酸銅為宜。
表3 硫酸銅用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響
3.1.3 硫酸鉀用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響 硫酸鉀在消化粗蛋白質(zhì)的過程中可提高濃硫酸沸點(diǎn),加快有機(jī)物分解(梁世岳等,2019)。不同量的硫酸鉀對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響如表4所示,處理2~6測得的粗蛋白質(zhì)含量均高于處理1,其中處理3顯著高于處理1(P<0.05),其他處理與處理1差異不顯著(P>0.05)。隨著硫酸鉀用量的增多,處理4~6中所測粗蛋白質(zhì)含量低于處理3,但差異不顯著(P>0.05)。可能由于過量使用硫酸鉀,引起消化液溫度太高而導(dǎo)致氮的損失。國標(biāo)法測定粗蛋白質(zhì)時(shí),硫酸鉀用量為6 g(王志剛等,2017)。該試驗(yàn)結(jié)果表明,在最佳硒粉和硫酸銅用量的作用下,硫酸鉀的用量明顯減少,其最佳使用量為3 g。
表4 硫酸鉀用量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響
3.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)硒粉、硫酸銅、硫酸鉀用量進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量的最佳催化條件。從表5的試驗(yàn)結(jié)果看出,混合催化劑的3個(gè)組分對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響順序依次為硒粉>硫酸鉀>硫酸銅,這與(李敏等,2015;陸曉濱等,2003)的研究報(bào)道一致,硒粉可加速消化反應(yīng)的速度及硫酸鉀在消化粗蛋白質(zhì)過程中所起作用大于硫酸銅。試驗(yàn)結(jié)果表明,催化劑的最佳組合為A2B1C2,即硒粉0.2 g、硫酸銅0.2 g、硫酸鉀 3.0 g。
表5 正交試驗(yàn)及結(jié)果分析
3.3 改進(jìn)法和國標(biāo)法對(duì)粗蛋白質(zhì)含量測定的比較 由表6可知,兩種方法對(duì)粗蛋白質(zhì)測定的結(jié)果無明顯影響,但改進(jìn)法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯低于國標(biāo)法。國標(biāo)法使用0.4 g硫酸銅和6 g硫酸鉀作為催化劑。而改進(jìn)法在混合催化劑中添加0.2 g硒粉后,硫酸銅和硫酸鉀的用量明顯減少,且消化管中無結(jié)晶現(xiàn)象。
表6 改進(jìn)法和國標(biāo)法對(duì)粗蛋白質(zhì)含量測定的比較
在國標(biāo)法測定粗蛋白質(zhì)采用硫酸鉀和硫酸銅作混合催化劑的基礎(chǔ)上添加高效催化且抑泡的硒粉。通過單一變量試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究改進(jìn)法混合催化劑(硒粉+硫酸銅+硫酸鉀)最佳用量組合,篩選的混合催化劑(0.2 g硒粉+0.2 g硫酸銅+3.0 g硫酸鉀)測定效果較理想,這為建立高效催化和快速消化測定粗蛋白質(zhì)的模式開拓了新途徑。