陳 昊，馬旭林，劉永軍，王 玲*

（1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川 712100；2.寧夏農(nóng)墾乳業(yè)股份有限公司，750004）

圍產(chǎn)期是奶牛繁殖過程中的重要時期，經(jīng)歷妊娠-分娩-泌乳等生理階段，奶牛生理功能和機體代謝發(fā)生巨大變化，由于分娩應激、轉(zhuǎn)群、變換日糧及干物質(zhì)采食量較低等原因，奶?？寡趸芰兔庖吡档?，是酮病、產(chǎn)乳熱、乳腺炎等營養(yǎng)代謝病或感染性疾病的發(fā)病高峰期。如果此階段飼養(yǎng)管理不當或瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生紊亂，奶牛極易發(fā)生健康障礙，影響泌乳期的產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)，甚至嚴重影響犢牛的生長發(fā)育（李政等，2020）。鋅、硒、維生素E作為常見的飼料添加劑被廣泛應用，其中維生素E和硒（Se）是有效的抗氧化劑和自由基清除劑，二者具有協(xié)同作用（Zahrazadeh等，2018），在體內(nèi)抗氧化、免疫、運輸和調(diào)節(jié)激素合成各方面均具有重要作用（Lopez等，2011）。鋅是動物體必需微量元素，具有催化、構(gòu)建、調(diào)節(jié)等作用，廣泛分布于動物機體所有的器官、組織和體液中，是動物體內(nèi)300多種酶的組成成分或輔助因子，參與并影響機體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程，與動物生長發(fā)育、免疫功能和繁殖性能密切相關。有大量研究證明，維生素E和硒、鋅是通過參與瘤胃微生物代謝這一途徑來促進瘤胃微生物的生長以及瘤胃的正常發(fā)酵（王峰，2001），從而對機體起到積極作用（Wei等，2015；Kincaid等，2000）。

奶牛圍產(chǎn)期通常需要添加無機微量元素滿足其需要，而無機微量元素的吸收率低于有機微量元素，本研究在日糧中添加維生素E和有機形式的硒和鋅，利用16sDNA測序技術研究其對圍產(chǎn)前期奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響，從而為三者在奶牛圍產(chǎn)期飼養(yǎng)管理中的應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物的選擇及試驗設計 試驗將40頭胎次、體況和預產(chǎn)期相近的干奶牛隨機分為兩組，每組20頭，分別為對照組（CG）和試驗組（EG）。對照組飼喂基礎日糧，試驗組在基礎日糧中添加1000 IU/d·頭維生素E和2 mg/d·頭有機硒、360 mg/d·頭有機鋅。從奶牛轉(zhuǎn)入圍產(chǎn)圈開始飼喂，直至產(chǎn)犢，試驗期共24 d。試驗基礎日糧及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平（DM基礎）

1.2 瘤胃液的采集及微生物區(qū)系測定

1.2.1 瘤胃液的采集 在產(chǎn)前7 d每組按照胎次、產(chǎn)犢日期、體況相近的原則選擇7頭奶牛，在早飼前用瘤胃液采樣器經(jīng)口腔采集100 mL左右的瘤胃液，用4層無菌棉紗布過濾后收集濾液，分裝至無菌離心管中-80℃保存，用于瘤胃微生物區(qū)系的測定。

1.2.2 瘤胃微生物區(qū)系的測定 使用Hipure Soil DNA 提取試劑盒（Magen，Guangzhou，Chin）抽提瘤胃液總DNA進行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的樣品-20℃保存。取適量檢測合格的DNA樣品進行PCR擴增，DNA擴增目的片段為V3-V4區(qū)（測序引物為341F：CCTACGGGNGGCWGCAG、806R ：GGACTACHVGGGTATCTAAT）， 用Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads對擴增產(chǎn)物進行純化，使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit試 劑 在 Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx800）上進行定量，根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例進行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。采用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫在Agilent Bioanalyzer上進行質(zhì)檢，之后采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega Quanti Fluor熒光定量系統(tǒng)上對文庫進行定量，將合格的各上機測序文庫梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進行上機測序。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 測序數(shù)據(jù)使用QIIME2（2019.4）軟件進行處理，分析樣本在門、屬分類水平上的組成分布，使用Python LEfse包進行差異標志物篩選、物種網(wǎng)絡分析及代謝通路分析。試驗數(shù)據(jù)使用Excel2016軟件進行整理，均以“平均值±標準誤”表示，采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對圍產(chǎn)前期奶牛瘤胃細菌α-多樣性的影響 由圖1可知，與對照組相比，試驗組瘤胃微生物區(qū)系的Chao1指數(shù)顯著降低（P＜0.05），其他指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），表明試驗組及對照組多樣性相似，但對照組的豐富度更高。

圖1 Alpha多樣性指數(shù)的分組箱線圖

2.2 對圍產(chǎn)前期奶牛瘤胃細菌β多樣性分析的影響 基于bray-curits距離的試驗組和對照組PCoA分析，特征值Axis1和Axis2對樣本群落組成差異的解釋度分別為17.2%和13%，將樣本矩陣投射到Axis1、Axis2構(gòu)成的二維平面上，95%置信區(qū)間基本重合，無分離現(xiàn)象，表明試驗組和對照組無顯著差異。此外，與試驗組相比，對照組對應的95%置信區(qū)間面積更大，組內(nèi)樣本的PCoA特征向量相對離散，提示對照組瘤胃微生物群落存在較大異質(zhì)性和波動性。

2.3 對圍產(chǎn)前期瘤胃細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 門水平 如表2可知，通過計算組均物種豐度得到不同組間豐度前10的物種門類，分 別 為 厚 壁 菌 門（Firmicutes）、擬 桿 菌 門（Bacteroidetes）、Patescibacteria菌門、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、螺旋體門（Spirochaetes）、變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、放線菌門（Actinobacteria）、Kiritimatiellaeota菌門、未分類細菌（unclassified_Bacteria）。試驗組及對照組瘤胃細菌在門水平上各物種均無顯著性差異。

表2 不同試驗組瘤胃細菌門水平組成 %

2.3.2 屬水 屬水平中，試驗組和對照組瘤胃細菌豐度前10的物種門類見表3，分別為普雷沃氏菌屬_1（Prevotella_1）、克里斯滕森菌_R-7 群 屬（Christensenellaceae_R-7_group）、瘤胃球菌_NK4A214群屬（Ruminococcaceae_NK4A214_group）、理 研 菌 科 _RC9腸 道 群屬（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、F082菌 屬、解 琥 珀 酸 菌 屬（Succiniclasticum）、Muribaculaceae菌屬、瘤胃球菌_UCG-014菌屬（Ruminococcaceae_UCG-014）、產(chǎn) 乙 酸 糖 發(fā)酵 菌（Saccharofermentans）、丁 酸 弧 菌 _2菌 屬（Butyrivibrio_2）。試驗組及對照組瘤胃細菌屬水平上各物種均無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 不同試驗組瘤胃細菌屬水平組成 %

2.4 差異標志物篩選 由圖2～3可知，共篩選出19個特征菌群，包括綱水平1個，目水平3個，科水平3個，屬水平12個。

圖2 LDA值分布柱狀圖

試 驗 組 中，噬 纖 維 菌 目（Cytophagales）、紅 桿 菌 目（Rhodobacterales）、紅 桿 菌 科（Rhodobacteraceae）、Cyclobacteriaceae 菌科、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、聚乙酸菌屬（Acetitomaculum）、布 勞 特 氏 菌 屬（Blautia）、Lachnoclostridium菌 屬、probable_genus_10菌屬、瘤胃球菌_UCG_013菌屬（Ruminococcaceae_UCG_013）、Ruminiclostridium_5菌 屬、芽 孢 桿菌屬（Gemmobacter）、韋榮球菌科 _UCG_003菌屬（Erysipelotrichaceae_UCG_003）、噬 冷 菌 屬（Algoriphagus）顯著富集；對照組中，黑色素桿菌 綱（Melainabacteria）、Gastranaerophilales菌目、Gastranaerophilales菌科、Gastranaerophilales菌屬、瘤胃球菌屬_2菌屬（Ruminococcus_2）表達豐度差異顯著。

3 討論

瘤胃作為反芻動物機體內(nèi)的一個微型生態(tài)系統(tǒng)，其微生物組成結(jié)構(gòu)的動態(tài)演替會受到外界條件改變所影響（Weimer，2015），如季節(jié)、飼喂方式和飼糧營養(yǎng)水平等（李子健，2018）。大量研究證實，可通過改變飼糧組成及添加添加劑等方法對消化道微生物區(qū)系進行調(diào)控，從而保證瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

圖3 進化分支圖

Wei等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，在牛日糧中添加維生素E和硒可以促進瘤胃內(nèi)微生物生長，從而改善瘤胃發(fā)酵環(huán)境。烏日力嘎等（2022）針對放牧綿羊研究發(fā)現(xiàn)，硒添加組較對照組擬桿菌門相對豐度降低6.03%、厚壁菌門相對豐度提高6.14%，且瘤胃球菌科UCG-004、UCG-005和UCG-010菌屬以及毛螺菌科FE2018菌群顯著富集。謝亮等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，與無機硒組相比，有機硒組厚壁菌門的相對豐度較低，擬桿菌門的相對豐度較高，NKA214菌群相對豐度極顯著低于無機硒組，但普雷沃菌屬的相對豐度顯著高于無機硒組，并推測添加不同硒源可能會影響瘤胃中優(yōu)勢菌門的豐度。雖然目前仍無研究報道在飼糧中添加鋅對瘤胃微生物區(qū)系的影響，但現(xiàn)有的部分研究證明了鋅會參與瘤胃微生物的代謝，在瘤胃發(fā)酵中，其對微生物的促生長有關鍵作用（李萬棟等，2019）。

本研究中，在門分類水平上篩選出豐富度較高的10個細菌門類，其中厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）相對含量遠高于其他細菌門類。α-多樣性分析結(jié)果顯示，試驗組Chao1指數(shù)顯著降低，其他指標差異不顯著。Chao1指數(shù)是衡量菌群豐富度的指標，數(shù)值與菌群豐富度正相關，因此，試驗組瘤胃內(nèi)微生物α-多樣性除豐富度顯著降低外并未發(fā)生顯著改變。β多樣性分析結(jié)果顯示，雖然試驗組與對照組之間微生物群落多樣性無顯著差異，但試驗組傾向于擁有更加相似的微生物群落，而對照組傾向于擁有差異較大的微生物群落，這表明試驗組相對于對照組擁有更加穩(wěn)定的瘤胃內(nèi)環(huán)境，異質(zhì)性和波動性較小。研究表明，牛瘤胃中厚壁菌門相對含量高于擬桿菌門且二者均為優(yōu)勢菌種（Guo等，2015；Eric等，2018），本研究中試驗組厚壁菌門和擬桿菌門相對含量分別為56.7%和38.1%，對照組分別為52.1%和43.0%，與前人研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中加入維生素E、有機鋅和有機硒后，厚壁菌門相對含量有所升高，擬桿菌門有所降低。目前在多個物種中均有研究發(fā)現(xiàn)，相對于體瘦個體，肥胖個體中擬桿菌門比例較低，厚壁菌門比例較高，這主要是因為厚壁菌門的代謝多樣性高于擬桿菌門（分別為348條代謝途徑和76條代謝途徑），可以從飲食中獲取更多能量（Caspi等，2016；Ley，2005）。 此 外，LEFSE 分析還發(fā)現(xiàn)，試驗組中起重要作用的優(yōu)勢菌主要為厚壁菌門、擬桿菌門及變形菌門，對照組中的優(yōu)勢菌門為藍細菌門和擬桿菌門。瘤胃中的厚壁桿菌門可以幫助宿主分解植物纖維和蛋白質(zhì)，與乙酸和乳脂的生成及脂肪沉積密切相關，擬桿菌門主要參與動物體內(nèi)的碳水化合物等代謝過程（曾鈺，2020）。因此，試驗組較對照組有更大的能量攝入和儲存能力，表明在日糧中加入維生素E、有機鋅和有機硒或許可以改善圍產(chǎn)期奶牛的能量攝入。變形菌門多為致病菌，此類菌群的含量變化會影響動物個體代謝和免疫等生理功能，但本研究的試驗個體均無明顯病癥，因此，這幾種變形菌與動物個體健康之間的關系仍有待研究。

此外，LEFSE分析發(fā)現(xiàn)，試驗組中瘤胃球菌屬、聚乙酸菌屬、布勞特氏菌屬、Lachnoclostridium菌屬、probable_genus_10菌屬、瘤胃球菌_UCG_013菌屬、Ruminiclostridium_5菌屬、芽孢桿菌屬、韋榮球菌科_UCG_003菌屬、噬冷菌屬顯著富集，對照組中Gastranaerophilales菌屬、瘤胃球菌屬_2菌屬顯著富集。瘤胃球菌、噬纖維菌（周德慶等，2005）都具有較強的分解纖維素的能力，可以通過分解宿主消化系統(tǒng)內(nèi)的纖維素來獲取營養(yǎng)，也能發(fā)酵葡萄糖和木糖。聚乙酸菌是瘤胃中常見的一種有益菌，嚴格厭氧，可以通過發(fā)酵甲酸、葡萄糖、纖維二糖、果糖和七葉靈產(chǎn)生乙酸，布勞特氏菌屬、Lachnoclostridium菌屬與瘤胃碳水化合物酯酶豐度成正相關，可促進碳水化合物酯鍵斷裂，促進多糖的降解利用（於江坤，2021）。Gastranaerophilales是吲哚的主要產(chǎn)生菌，吲哚可以轉(zhuǎn)化為吲哚丙酸，其具有在胃腸道和外周的抗炎特性（Rosario等，2021），而黑色素桿菌暫無明確功能及作用。

由于16sDNA測序技術的局限性，不能從種或菌株水平揭示瘤胃內(nèi)微生物的組成和功能的變化特征，目前宏基因組技術已經(jīng)廣泛應用到各種研究中，該技術不僅能深入到種水平解釋微生物的物種變化，還能反映菌群變化對菌群功能的影響，故下一步可應用該技術做進一步的研究，以期揭示飼料添加劑與瘤胃微生物的互作機制。

4 結(jié)論

與對照組相比，在日糧中添加維生素E、有機鋅和有機硒瘤后，胃微生物Chao1指數(shù)顯著降低，α-多樣性和β多樣性無顯著差異，厚壁菌門相對含量有所升高，擬桿菌門有所降低，但無顯著性差異。差異標志物篩選結(jié)果表明，試驗組表達豐度差異顯著的瘤胃細菌主要與碳水化合物的代謝有關，這表明日糧添加維生素E、有機硒、有機鋅可能影響瘤胃內(nèi)碳水化合物代謝。