彭怡心，符春花，王亞，吳澤君

（株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲 412000）

無患子皂苷為天然的非離子型表面活性劑，具有很強(qiáng)的降低表面張力的作用［1］，泡沫豐富、手感細(xì)膩、去污力強(qiáng)、易降解、對(duì)皮膚刺激性小，是洗發(fā)香波、化妝品以及各種生物洗滌劑的優(yōu)良原料［2］。同時(shí)無患子皂苷還具有抗細(xì)菌、抗真菌、殺蟲、抗炎、抗腫瘤、保肝等功效［3］，對(duì)人體皮膚有抗菌、殺菌和消炎作用，還有去屑止癢功效，經(jīng)科學(xué)純化處理的無患子洗潔產(chǎn)品還具有泡沫豐富、柔嫩肌膚、增白祛斑、祛痘、防治皮膚病等特點(diǎn)［4，5］。因此，無患子皂苷在醫(yī)藥及日化領(lǐng)域的價(jià)值倍受重視，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

目前關(guān)于無患子皂苷提取方式主要包括溶劑浸提、超聲提取、酶提取、微波提取等［6-17］，其中大部分采用有機(jī)溶劑提取法，雖然雜質(zhì)含量較水提法低，但成本較高，易引起環(huán)境和安全問題。酶具有高效性和特異性，可改變植物細(xì)胞壁的通透性，有利于活性成分的溶出［18，19］，魏鳳玉等［20］發(fā)現(xiàn)纖維素酶有助于無患子皂苷的提取，提取率比未加酶處理時(shí)提高了19.63%。鄭林祿等［21］采用復(fù)合酶提取無患子皂苷，得出當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量濃度0.6 mg/mL，酶解溫度50℃，pH 4.5，酶解時(shí)間2.5 h時(shí)，提取率為64.40%。因此從環(huán)保和經(jīng)濟(jì)的角度考慮，本研究以水為溶劑，采用纖維素酶解法首次分粒度提取無患子皂苷，并以高效液相色譜法測(cè)定及計(jì)算皂苷的提取率，優(yōu)化了粒度較大無患子粉末的提取工藝，有效提高了皂苷的提取率并節(jié)約了資源和成本，同時(shí)探究了不同纖維素酶對(duì)不同粒度無患子皂苷提取率的影響，為無患子皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)和原料粒度分級(jí)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

纖維素酶（酶活力≥15 000 U/g）、無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；纖維素酶RS（酶活力16 000 U/g），北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；纖維素酶（酶活力50 U/mg），上海源葉生物科技有限公司；無患子果皮粉，湖南省仙泉自然生物科技有限責(zé)任公司。

試驗(yàn)儀器：藥典篩，浙江上虞市五四儀器廠；XSE105DU型電子分析天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；SHY-2A型水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；醫(yī)用離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司；Utimate 3000 HPLC，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理取無患子果皮粉碎后分別過1-2號(hào)篩（過1號(hào)篩、不能通過2號(hào)篩），2-3號(hào)篩（過2號(hào)篩、不能通過3號(hào)篩），3-5號(hào)篩（過3號(hào)篩、不能通過5號(hào)篩），大于5號(hào)篩（全部通過5號(hào)篩）得到4組不同粒度的無患子粉末。

1.2.2 無患子皂苷的提取稱取不同粒度的無患子粉末，用去離子水作為溶劑以1∶10固液比置于50 mL離心管中，加酶后于一定溫度的水浴恒溫振蕩器中酶解一定時(shí)間，每隔0.5 h振搖20 s，轉(zhuǎn)速100 r/min。將離心管置于80℃恒溫水浴鍋滅酶30 min，8 000 r/min離心10 min后吸取上清液即為無患子皂苷水提液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取自制無患子皂苷對(duì)照品（分離純化的部分物質(zhì)）0.04 g用甲醇溶解并定容至10 mL，稀釋得到0.05、0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 mg/mL濃度的皂苷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照液相色譜條件：色譜柱Xtimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動(dòng)相：A為水，B為乙腈，洗脫梯度見表1；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，無患子皂苷對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立皂苷含量的回歸方程y=50.276x-0.671 1，R2=0.999 4。

表1 洗脫梯度

1.2.4 無患子皂苷提取率的計(jì)算取“1.2.2”中的無患子皂苷水提液用無水乙醇稀釋5倍，離心后吸取上清液用“1.2.3”中液相色譜方法測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出測(cè)定液中無患子皂苷的濃度，皂苷提取率計(jì)算公式如下。

式中，w表示無患子皂苷提取率（%）；c表示測(cè)定液中無患子皂苷的濃度（mg/mL）；v表示提取液的體積（mL）；m表示無患子粉末質(zhì)量（g）；f表示稀釋倍數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2019軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同纖維素酶對(duì)不同粒度無患子皂苷提取率的影響

將北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司、上海源葉生物科技有限公司、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的纖維素酶按照同一酶活定義換算酶活單位后，按照6、15 U/mL分別加入4組不同粒度的無患子粉末中，50℃酶解2 h，同時(shí)做空白試驗(yàn)，考察不同纖維素酶對(duì)不同粒度無患子皂苷提取率的影響。由圖1可知，拜爾迪纖維素酶對(duì)2-3號(hào)篩、3-5號(hào)篩、大于5號(hào)篩無患子粉末的皂苷提取率有促進(jìn)作用，對(duì)1-2號(hào)篩的粉末無明顯影響。酶活濃度為15 U/mL時(shí)2-3號(hào)篩粉末的皂苷提取率從2.83%提高至3.21%，提高了13.4%，3-5號(hào)篩無患子皂苷提取率從3.42%提高至4.22%，對(duì)大于5號(hào)篩的粉末皂苷提取率也有明顯提高。

圖1 拜爾迪纖維素酶對(duì)不同粒度無患子皂苷提取率的影響

由圖2可知，上海源葉纖維素酶提高了1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩、3-5號(hào)篩無患子粉末的皂苷提取率，而對(duì)更細(xì)的粉末促進(jìn)作用不明顯。6 U/mL和15 U/mL酶活濃度使1-2號(hào)篩粉末的皂苷提取率分別提高了7.09%和8.96%，使2-3號(hào)篩無患子皂苷提取率從2.83%分別提高至3.04%和3.06%，提高了7.42%和8.13%，同時(shí)15 U/mL酶活濃度還將3-5號(hào)篩的皂苷提取率提高了19.3%。

圖2 上海源葉纖維素酶對(duì)不同粒度無患子皂苷提取率的影響

由圖3可知，國(guó)藥纖維素酶對(duì)1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩、3-5號(hào)篩無患子粉末的皂苷提取率有明顯促進(jìn)作用，對(duì)更細(xì)的大于5號(hào)篩的粉末幾乎無影響。15 U/mL酶活濃度將1-2號(hào)篩無患子皂苷提取率提高了13.1%，將2-3號(hào)篩粉末皂苷提取率提高了13.4%，同時(shí)6、15 U/mL的纖維素酶活濃度還使3-5號(hào)篩粉末提取率分別提高了16.1%和20.8%。

圖3 國(guó)藥纖維素酶對(duì)不同粒度無患子皂苷提取率的影響

綜上可知，由于無患子皂苷工業(yè)化提取時(shí)考慮成本、能耗等因素對(duì)原料的粉碎程度不會(huì)特別高，大多數(shù)為最粗粉或粗粉級(jí)別，即1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩粉末，少數(shù)為3-5號(hào)篩級(jí)別，國(guó)藥纖維素酶對(duì)前2種粒度無患子粉末的皂苷提取率提高得最明顯，同時(shí)對(duì)更細(xì)的3-5號(hào)篩粉末促進(jìn)作用較明顯，因此選國(guó)藥纖維素酶和1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩粉末做下一步試驗(yàn)。同時(shí)可以看出粒度越小的無患子粉末皂苷提取率越大，當(dāng)粉末粒度均大于5號(hào)篩時(shí)纖維素酶對(duì)無患子皂苷的提取率幾乎無影響或促進(jìn)作用較小，說明無患子果皮粉碎的越細(xì)，越有利于皂苷的提取，當(dāng)植物細(xì)胞粉碎的很細(xì)時(shí)極大促進(jìn)了皂苷的溶出從而使酶的破壁作用不明顯。因此，對(duì)于無患子皂苷工業(yè)化提取時(shí)，原料粉末加酶提取可選擇國(guó)藥的纖維素酶，而對(duì)原料粒度大于5號(hào)篩時(shí)，考慮成本因素可不加纖維素酶提取，這為無患子皂苷工業(yè)化提取的粒度分級(jí)提供了參考。

2.2 纖維素酶添加量對(duì)無患子皂苷提取率的影響

在纖維素酶添加量分別為0、3、6、12、18、24 U/mL時(shí)，50℃條件下提取2 h，考察加酶量對(duì)1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩無患子粉末皂苷提取率的影響。由圖4可知，隨著纖維素酶活濃度的增加，1-2號(hào)篩粉末的皂苷提取率逐步提高，至18 U/mL時(shí)提取率顯著提高且達(dá)到最大，從2.79%提高至3.15%，之后隨著酶添加量的增加，皂苷提取率無顯著變化，因此對(duì)1-2號(hào)篩無患子粉末皂苷提取的最佳酶活濃度為18 U/mL。對(duì)2-3號(hào)篩無患子粉末隨著酶活濃度的提高，皂苷提取率整體呈上升趨勢(shì)，至12 U/mL時(shí)提取率顯著提高，從2.82%提高至3.24%，再增加酶的濃度雖然有所提高但考慮成本因素，酶活濃度12 U/mL最合適。

圖4 酶添加量對(duì)1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩無患子皂苷提取率的影響

綜上分析，對(duì)最粗粉（1-2號(hào)篩）和粗粉（2-3號(hào)篩）而言，在無患子皂苷提取時(shí)加入一定量的纖維素酶，改變了其果皮細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)了無患子果皮細(xì)胞中皂苷的溶出，使得提取率增加，且要達(dá)到一定的酶活濃度皂苷提取率才有顯著提高，對(duì)于越粗的原料粉末所需酶活濃度越高。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)無患子皂苷提取率的影響

1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩無患子粉末加酶量分別為18、12 U/mL，50℃條件下酶解0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 h，考察酶解時(shí)間對(duì)無患子皂苷提取率的影響。由圖5可知，1-2號(hào)篩無患子粉末（最粗粉）隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，皂苷提取率先增加后略有降低，當(dāng)酶解時(shí)間為2.5 h時(shí)皂苷提取率為3.16%，達(dá)到最大值，之后便不再增加，因此對(duì)于1-2號(hào)篩無患子粉末在加酶量為18 U/mL時(shí)酶解2.5 h即可。2-3號(hào)篩無患子粉末（粗粉）隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，皂苷提取率先增加后下降，當(dāng)酶解時(shí)間為1.5 h時(shí)皂苷提取率最大，達(dá)3.32%，之后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)皂苷提取率不再增加。因此對(duì)于2-3號(hào)篩無患子粉末在加酶量為12 U/mL時(shí)最佳酶解時(shí)間為1.5 h。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩無患子皂苷提取率的影響

綜上分析，2種粒度無患子粉末在最佳纖維素酶添加量的條件下，皂苷提取率均隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)先增加，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間時(shí)皂苷提取率均不再增加，可能是因?yàn)?種粒度的無患子粉末在各自酶添加量的條件下分別提取2.5、1.5 h后酶促反應(yīng)已達(dá)到平衡，之后略有下降可能是因?yàn)闊o患子皂苷大部分為三萜皂苷，而三萜皂苷多具有羧基，纖維素分解產(chǎn)物葡萄糖可能會(huì)與其發(fā)生酯化反應(yīng)使得皂苷提取率有所下降，并且無患子皂苷提取率隨酶解時(shí)間的變化并不顯著。

2.4 酶解溫度對(duì)無患子皂苷提取率的影響

1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩無患子粉末在酶添加量分別為18、12 U/mL，提 取 溫 度 分 別 為30、40、50、60、70℃，酶解1.5 h時(shí)，考察酶解溫度對(duì)無患子皂苷提取率的影響。由圖6可知，1-2號(hào)篩無患子粉末隨著酶解溫度的升高，皂苷提取率上升，50℃時(shí)提取率最大，達(dá)3.00%，繼續(xù)升高溫度則皂苷提取率顯著下降，因此對(duì)1-2號(hào)篩無患子粉末最適提取溫度為50℃。2-3號(hào)篩無患子粉末隨著酶解溫度的增高，皂苷提取率逐漸增大，至50℃時(shí)達(dá)到最大，提取率為3.28%，之后隨溫度升高皂苷提取率反而明顯下降。

圖6 酶解溫度對(duì)1-2號(hào)篩、2-3號(hào)篩無患子皂苷提取率的影響

綜上分析，酶解溫度對(duì)2種粒度的無患子皂苷提取率均有顯著影響，由于高溫會(huì)破壞纖維素酶的蛋白結(jié)構(gòu)使酶變性失活從而導(dǎo)致皂苷提取率顯著下降，同時(shí)低溫也會(huì)抑制纖維素酶的活性使得溫度低于50℃時(shí)皂苷提取率偏低。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)首次對(duì)無患子果皮粉末進(jìn)行了粒度分級(jí)并按粒度優(yōu)化了纖維素酶法提取無患子皂苷的工藝條件，探究多種纖維素酶對(duì)不同粒度的無患子粉末的影響，得出當(dāng)粉末粒度大于5號(hào)篩時(shí)纖維素酶對(duì)無患子皂苷提取率幾乎無影響或促進(jìn)作用較小，即當(dāng)植物細(xì)胞粉碎得很細(xì)時(shí)極大促進(jìn)了皂苷的溶出從而使酶的破壁作用不明顯，纖維素酶法提取無患子皂苷的較優(yōu)工藝條件為1-2號(hào)篩粉末（最粗粉）酶添加量18 U/mL，酶解時(shí)間2.5 h，酶解溫度50℃；2-3號(hào)篩粉末（粗粉）酶添加量12 U/mL，酶解時(shí)間1.5 h，酶解溫度50℃，對(duì)于粒度大于5號(hào)篩的考慮成本因素可不加纖維素酶提取，該方法經(jīng)濟(jì)環(huán)保，可有效提高無患子中皂苷的提取率，為纖維素酶法工業(yè)化提取無患子皂苷打下基礎(chǔ)。