姚瑞祺，胡家棟，王鋒，周博

（楊凌職業(yè)技術學院，陜西 楊凌 712100）

山茱萸是山茱萸科（Cornaceae）山茱萸屬（MacrocarpiumNakai）山茱萸種（Macrocarpium offcinalis）的成熟果實，為中國傳統(tǒng)名貴中藥材，藥用歷史悠久，具有補益肝腎、調氣補虛的有益功效，中國第一部藥物典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。山茱萸多糖是山茱萸果實重要的功效成分［1］，在體內(nèi)外免疫調節(jié)、預防及治療腫瘤、預防衰老、神經(jīng)保護和心肌保護等方面均效果顯著［2-4］，已成為科研工作者的研究熱點，具有廣闊的市場前景和應用價值。

超聲波輔助提取是一種有效的物理加工技術，可用于植物功能因子（如多糖、黃酮、多酚、原花青素）的提取制備，不僅提高產(chǎn)品得率，且能改善功能性質，尤其是在蘋果［5］、大棗［6］、枸杞［7］等果蔬中效果更為明顯，展示了良好的應用前景。超聲波頻率有單頻和多頻之分，目前研究較多的主要為單頻超聲波。多頻超聲波輔助提取是基于多個頻率的超聲波組合［8］，與傳統(tǒng)單頻超聲相比，能耗低，噪聲小，空化作用明顯，可直接破壞植物細胞的細胞壁結構，有助于細胞內(nèi)容物的滲出［9］，能顯著提高有效成分提取率，更有利于進行科學研究和工業(yè)生產(chǎn)。

本研究探討多頻超聲波輔助對山茱萸多糖提取率的影響，通過正交試驗確定超聲波輔助提取山茱萸多糖最佳工藝條件，以期為超聲波在山茱萸多糖工業(yè)生產(chǎn)中的應用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

山茱萸，產(chǎn)自陜西省周至縣厚畛子林場；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、活性炭、三氯甲烷、正丁醇、濃鹽酸、NaOH、石油醚、95%乙醇，均為分析純。

1.2 儀器

JM-15D-45/80型超聲波萃取儀器、JM-07D-28/45型超聲波萃取儀器、JM-20D-28型超聲波萃取儀器、JM-16D-80型超聲波萃取儀器、JM-16D-40型超聲波萃取儀器，深圳市潔盟清洗設備有限公司；UV1901PCS型雙光束紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LXJ-II型離心沉淀機，上海醫(yī)用分析儀器廠；BSA423S-CW型分析天平，德國賽多利斯集團；FB-10T型過濾瓶，Automatic Science（TIAN JIN）Instrument Co.，Ltd。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸多糖提取液制備參考張茜等［10］的方法。山茱萸鮮果無損采摘，清洗，置于50℃水中浸泡15 min，取出去核，保留果肉并在50℃下烘干備用。將山茱萸干果粉碎，過40目篩。稱取適量山茱萸干果粉末，加入石油醚進行脫脂處理，50℃回流4 h后加入一定量的水，在超聲波輔助條件下進行提取，提取液分別用紗布和濾紙抽濾1次，然后用旋轉蒸發(fā)器在50℃下濃縮至提取液的1/5。在濃縮液中加入1/3的sevager試劑（正丁醇與三氯甲烷的比例為5∶2）進行脫蛋白處理，充分振蕩15 min后置于分液漏斗中靜置，待分層明顯后收集上面水層，如此反復操作3次。在得到的水層溶液中按照5 g/L的用量加入活性炭進行30 min的脫色處理，過濾活性炭，所得即為山茱萸多糖提取液。

1.3.2 山茱萸多糖制備參考郭耀東等［11］的方法。按照“1.3.1”的步驟制得山茱萸多糖提取液，在提取液中加入3倍體積95%乙醇，靜置5 h后離心，所得固體于50℃下干燥至恒重，即為山茱萸多糖。

1.3.3 山茱萸多糖含量測定

1）標準曲線制作。參考王彥平等［12］的方法。以葡萄糖為標準品，精密吸取7個濃度的葡萄糖供試液2.0 mL，分別加入5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻后迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，置于40℃水浴中顯色30 min，取出置于冰水中快速冷卻以終止顯色反應，然后置于室溫條件下10 min，于波長488 nm處用紫外可見分光光度計測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標繪制葡萄糖標準曲線，并得出回歸方程。

2）換算因子計算。準確稱取“1.3.2”中制得的山茱萸多糖10.0 mg，加水定容至100 mL。準確吸取該山茱萸多糖稀釋液2.0 mL，按照標準曲線制作的步驟和方法加入苯酚、濃硫酸等試劑進行顯色反應，于波長488 nm處測定吸光度，由回歸方程得出山茱萸多糖中的葡萄糖含量C0，按式（1）計算換算因子f。

3）山茱萸多糖提取率的測定。利用“1.3.1”中得到的山茱萸多糖提取液，稀釋至合適濃度。精確吸取2 mL稀釋液，按照標準曲線制作的步驟和方法加入苯酚、濃硫酸等試劑進行顯色反應，于波長488 nm處測定吸光度，由回歸方程得出山茱萸提取液中的葡萄糖含量C，按式（2）計算山茱萸多糖提取率w。

式中，C為稀釋液的葡萄糖含量（mg/mL）；D為稀釋倍數(shù)；f為測算出的換算因子；m為稱取的山茱萸干果質量（mg）。

1.3.4 超聲輔助浸提單因素試驗

1）超聲頻率的單因素試驗。固定料液比1∶6，浸提時間30 min，浸提溫度45℃，選擇超聲波頻率28、40、80、28/45、45/80 kHz，進行山茱萸多糖的超聲波頻率單因素試驗。利用苯酚-硫酸法測定山茱萸多糖提取率。以無超聲波輔助提取作為試驗對照。

2）料液比的單因素試驗。固定超聲波頻率28/45 kHz，浸提時間30 min，浸提溫度45℃，選擇料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，進行山茱萸多糖的料液比單因素試驗。利用苯酚-硫酸法測定山茱萸多糖提取率。以無超聲波輔助提取作為試驗對照。

3）浸提溫度的單因素試驗。固定超聲波頻率28/45 kHz，浸提時間30 min，料液比1∶6，選擇浸提溫度30、35、40、45、50、55℃，進行山茱萸多糖的浸提溫度單因素試驗。利用苯酚-硫酸法測定山茱萸多糖提取率。以無超聲波輔助提取作為試驗對照。

4）浸提時間的單因素試驗。固定超聲波頻率28/45 kHz，浸提溫度45℃，料液比1∶6，選擇浸提時間30、45、60、75、90、105、120 min，進行山茱萸多糖的浸提時間單因素試驗。利用苯酚-硫酸法測定山茱萸多糖提取率。以無超聲波輔助提取作為試驗對照。

1.3.5 超聲輔助提取正交試驗以超聲頻率、料液比、浸提溫度、浸提時間為因素，設計L9（34）正交試驗，探討不同水平條件下這些因素對山茱萸多糖提取率的影響，并確定最佳浸提條件。因素與水平見表1。

表1 因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線制作

葡萄糖標準曲線如圖1。由圖1可知，葡萄糖含量在0.0～60.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關系，吸光度為0.000～0.667，所得的回歸方程如下。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲波頻率的單因素試驗超聲波頻率對山茱萸多糖提取率的影響見圖2。由圖2可知，無論是單頻超聲波（28、40、80 kHz）還是雙頻組合超聲波（28/45、45/80 kHz），與無超聲波對照相比，超聲波輔助提取均能提升山茱萸多糖的提取率。3種單頻超聲波中，低頻率28 kHz超聲波提取率高于40 kHz和80 kHz，山茱萸多糖提取率達15.72%，較對照組提高了60.1%。2種雙頻超聲波提取率均高于單頻28 kHz，其中28/45 kHz組合高于45/80 kHz組合，達18.72%，較對照組提高了90.7%。

圖2 超聲波頻率對多糖提取率的影響

有研究表明，空化效應是超聲波的一種主要效應，與頻率有密切聯(lián)系。頻率較低的超聲波本身攜帶較強的能量，更容易直接作用于植物細胞，產(chǎn)生較為明顯的破壁效果和空化效應［13］。但是，由于不同樣品的內(nèi)部組織結構存在差異，共振頻率也不相同。當超聲波頻率與樣品的共振頻率接近時，樣品體系才能積極響應超聲波能量，達到理想提取效果［14］。在本研究中，可能是因為28/45 kHz雙頻組合超聲波更加接近于山茱萸提取液的共振頻率，所以較45/80 kHz雙頻組合和其他單頻超聲波，28/45 kHz雙頻組合超聲波提取效果較佳。

2.2.2 料液比的單因素試驗料液比對山茱萸多糖提取率的影響見圖3。由圖3可知，與無超聲波輔助對照相比，在各料液比水平下，山茱萸多糖的提取率均明顯提高，表明在1∶3至1∶8料液比范圍內(nèi)，超聲波輔助提取能有效提高山茱萸多糖的提取率。另外，隨著溶液體積的增大，山茱萸多糖提取率呈逐漸升高直至平穩(wěn)的變化規(guī)律。當料液比從1∶3變化至1∶6時，出現(xiàn)拐點；而料液比1∶6以后的提取率，變化不顯著。這可能是因為在超聲波頻率28/45 kHz，浸提時間30 min，浸提溫度45℃的條件下，1∶6的料液比已經(jīng)接近于最佳料液比條件，無需繼續(xù)增大溶液的比例。

圖3 料液比對多糖提取率的影響

2.2.3 浸提溫度的單因素試驗浸提溫度對山茱萸多糖提取率的影響見圖4。由圖4可知，在30～55℃內(nèi)，隨浸提溫度的升高，樣品和對照的提取率均呈逐漸增大的趨勢；與無超聲波輔助對照相比，山茱萸多糖提取率明顯提高。當浸提溫度為50℃時，山茱萸多糖的提取率為17.28%，與對照相比，增加了59.8%。當浸提溫度為55℃時，山茱萸多糖略有增加，但與50℃相比，差異不顯著?？紤]到升高浸提溫度對山茱萸多糖的活性可能造成影響，以及增加能耗等問題，在后續(xù)的試驗中，選擇50℃進行進一步的研究。

圖4 浸提溫度對多糖提取率的影響

2.2.4 浸提時間的單因素試驗浸提時間對山茱萸多糖提取率的影響見圖5。由圖5可知，在30～120 min內(nèi)，隨浸提時間的延長，樣品的提取率呈先增大后平穩(wěn)最后趨于減小的趨勢。在30～75 min時，山茱萸多糖提取率增加較為明顯；75～105 min時，提取率基本趨于穩(wěn)定；105～120 min時，提取率又有下降。而對于無超聲輔助的對照而言，30～75 min時，提取率增加明顯；75～120 min時，提取率趨勢基本趨于平穩(wěn)，無顯著變化。這可能是因為在超聲波頻率28/45 kHz，浸提溫度45℃，料液比1∶6的條件下，75 min的浸提時間已經(jīng)基本達到了最大提取率，若繼續(xù)延長一小段浸提時間，提取率基本沒有變化；但若延長至105 min以上時，可能過長時間的超聲波作用，會導致部分山茱萸多糖發(fā)生降解，反而使得山茱萸多糖的提取率下降。因此，在后續(xù)的試驗中，選擇75 min進行進一步的研究。

圖5 浸提時間對多糖提取率的影響

2.3 正交試驗設計

4因素3水平正交試驗結果及極差分析結果見表2。方差分析結果見表3。由表2和表3可以看出，在超聲頻率（A）、料液比（B）、浸提溫度（C）和浸提時間（D）4個研究因素中，超聲頻率（A）極顯著（P＜0.01），料液比（B）、浸提溫度（C）和浸提時間（D）均顯著（P＜0.05）。影響山茱萸多糖提取率因素的主次關系是超聲頻率（A）＞浸提溫度（C）＞浸提時間（D）＞料液比（B），最佳工藝組合為A2B2C3D3，最佳工藝條件為超聲頻率雙頻28/45 kHz，浸提溫度52℃，浸提時間80 min，液料比1∶6。在得出的最佳工藝條件下，平行進行3次山茱萸多糖提取試驗，得出山茱萸多糖提取率為18.92%，優(yōu)于表2中最高值，證實了正交試驗結果的可靠性。

表2 正交試驗結果及極差分析

表3 正交試驗方差分析

3 小結

與無超聲波輔助浸提相比，超聲波輔助提取能有效提高山茱萸多糖的提取率，且雙頻組合超聲波優(yōu)于單頻超聲波。基于超聲頻率、料液比、浸提溫度和浸提時間等因素對山茱萸多糖提取率影響的研究，發(fā)現(xiàn)影響主次關系是超聲頻率（A）＞浸提溫度（C）＞浸提時間（D）＞料液比（B），最佳工藝組合為A2B2C3D3，最佳工藝條件為超聲頻率雙頻28/45 kHz，浸提溫度52℃，浸提時間80 min，液料比1∶6，山茱萸多糖提取率為18.92%。