劉丹陽，崔汝菲，耿 貴，王宇光

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜是莧科屬，2年生草本植物，于世界范圍內(nèi)廣泛種植，有較高的經(jīng)濟適用價值[1]。甜菜塊根中的糖分含量極高，僅次于甘蔗，是中國第二大糖料作物，其加工品也深受廣大民眾喜愛[2]。隨著集約化生產(chǎn)的進行，追求經(jīng)濟效益最大化的同時，部分農(nóng)作物也表現(xiàn)出土傳病害現(xiàn)象，造成了不同程度的經(jīng)濟損失，甜菜就是典型的土傳病害作物之一[3]。甜菜的土傳主要病害有立枯病、褐斑病、根腐病等，其中甜菜立枯病又稱黑腳病，是甜菜苗期重要的病害之一。導(dǎo)致甜菜立枯病的原因，多為甜菜的生長過程中會受到植物病原菌的侵染，甜菜根莖從而受到損傷，嚴(yán)重影響經(jīng)濟價值[4]。甜菜立枯病的侵染越重，保苗率就越低[5]。在中國各大甜菜產(chǎn)區(qū)均有立枯病頻發(fā)，一般發(fā)病率為20%～40%，嚴(yán)重可達60%～80%，甚至毀種[6]。病菌單獨或復(fù)合侵染可導(dǎo)致立枯病的發(fā)生，使得植株養(yǎng)分和水分流失，導(dǎo)致作物減產(chǎn)，同時莖部纖維受損引起植株倒伏[7]。王文君等[8]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜幼苗受到立枯病菌侵害時，長勢明顯較弱，真葉出土?xí)r間慢，莖基部出現(xiàn)黃褐色病斑等病癥。咸洪泉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，由于種植地區(qū)的不同，氣候環(huán)境等因素影響，導(dǎo)致甜菜苗期立枯病的病原菌不同，常見種類主要有：蛇眼病菌(Phoma betae)、鐮孢菌(Fusarium solani)、摔倒病菌(Pythium debaryanum)、絲核菌(Rhizoctonia solani)、苗腐病菌(Aphanomyces cochlioides)。也有研究表示，栽培甜菜上的土傳真菌鐮孢菌可引起甜菜鐮刀菌黃化和立枯病，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[10]。然而，土壤傳播病原體鐮孢菌(Fusarium solani)年復(fù)一年地存在于土壤中，早已成為植株病害的致命殺手[11]。鐮孢菌的主要種類有腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)、黃色鐮孢菌(F.culmorum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、木賊鐮孢菌(F.equseti)、尖孢鐮孢菌 (F.oxysporum)和層 出 鐮孢菌(F.proliferatum)等[12]。導(dǎo)致植物立枯病的病原菌有很多種，為找到于甜菜致病的病原菌種類，從而需進行此次實驗設(shè)計。長期以來，對甜菜病害的發(fā)生、分析、防治等國內(nèi)外有許多報道，但缺乏對甜菜立枯病病原菌種類的了解，可能會對病因判斷失誤，不能及時控制病害，造成經(jīng)濟損失。本研究通過對黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)甜菜生長時期的病害調(diào)查以及植株病原菌分析，對致病性進行初步研究，以期為哈爾濱市呼蘭區(qū)甜菜的立枯病防治工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

甜菜立枯病樣品于2021年采自黑龍江哈爾濱市黑龍江大學(xué)試驗室，甜菜品種為KWS1176，將種子置于甜菜重茬二年的實驗土中種植。采用組塊分離法，將甜菜幼苗病根剪成1 cm長接入PDA平板，于28℃培養(yǎng)，待長出菌絲后，挑取少量菌絲在PDA培養(yǎng)基上進一步純化，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和致病性確定菌株，命名為L1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 在PDA平板上活化菌株，挑取少量菌絲于光學(xué)顯微鏡下鏡檢。參考許志[13]的方法觀察病原菌形態(tài)特征，并對病原菌進行鑒定，初步明確菌株的分類地位。

1.2.2 致病性測定 首先，將甜菜種子種于培養(yǎng)盆中，每盆均勻播種20粒，重復(fù)3盆，準(zhǔn)備每盆接種病原菌3處。然后，將培養(yǎng)好的菌株L1用打孔器制成8 mm菌餅，接種在培養(yǎng)盆內(nèi)甜菜生長點的周圍，以不接種病原菌為對照。并觀察記錄甜菜生長和發(fā)病情況。同時，將發(fā)病部位組織進行再次分離和鏡檢，對比形態(tài)特征是否與接種的菌株一致。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 利用生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速提取試劑盒進行菌株基因組提取，并以此為模板進行PCR擴增，引物為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和 ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，采用 25 μL PCR 反應(yīng)體系：基因組DNA(20～25 ng/μL)0.5 μL、10*Buffer(Mg2+)2.5 μL、dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL、酶0.2 μL、引物 ITS1(10 μmol/L)、引物 ITS4(10 μmol/L)，加 ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序如下：94℃ 4 min；94℃ 45 s，55℃45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得序列與BLAST比對，運用MEGA11軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定實驗菌株分類地位[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜立枯病病原菌分離

苗期甜菜受到立枯病感染會出現(xiàn)根莖組織受傷發(fā)黑，變細，出現(xiàn)倒伏，葉片枯黃等并發(fā)癥狀，見圖1。依據(jù)發(fā)病癥狀采集菌株樣本，而后進行組織分離，獲得目標(biāo)菌株。通過觀察分離菌株在PAD培養(yǎng)基上的特征，發(fā)現(xiàn)菌株的氣生菌絲比較豐富，菌落呈圓形，菌絲為灰白色，生長速度快，菌落呈環(huán)形放射狀，見圖2。

2.2 致病性測定

待幼苗生長至7天時，將L1菌株接種于甜菜幼苗培養(yǎng)盆內(nèi)的土壤中，實時觀察生長。菌株L1接種3天時，甜菜幼苗開始出現(xiàn)病狀。從幼苗根莖處開始萎蔫，病處根莖開始枯萎逐漸細小。隨著接種菌落時長增加，患病根莖由枯黃逐漸呈現(xiàn)黑色，最后直至甜菜幼苗死亡。在接種菌株5天時，將接種菌株幼苗與未接種菌株CK進行對比，能明顯對比出，未接種菌株CK葉片更綠，幼苗根莖更加挺拔，幼苗根莖處未出現(xiàn)枯萎、細小、變黑等染病癥狀，見圖3 a；接種L1菌株的培養(yǎng)盆中，幼苗根莖普遍呈現(xiàn)枯萎狀，幼苗葉片泛黃，幼苗地上部倒伏染病癥狀。觀察圖3 b可得，接種菌株10天后，甜菜幼苗地上部倒下嚴(yán)重，根莖染病處完全枯萎，呈黑色。

圖3 未接種菌株CK與接種菌株對比圖

2.3 致病菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株L1于PAD培養(yǎng)基上生長迅速，菌落為灰白色，表面呈環(huán)形放射狀。利用顯微鏡觀察，分生孢子呈鐮刀型。大型孢子大小為(33.21～49.72)μm×(7.75～9.21)μm，多數(shù)有0～3個隔膜，散生于氣生菌絲上；小型孢子大小為(16.28～24.28)×(5.52～9.4)μm，多為單細胞，少數(shù)有隔膜，形狀有卵形、橢圓形，形成于氣生菌絲上，見圖4。

圖4 大型分生孢子和小型分生孢子

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 將L1菌株進行分子鑒定，將該菌株的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得約543bp的擴增條帶，得到菌株L1的序列長度為543 bp(GenBank的登錄號為DQ513513)，見圖5。使用Mega11軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖6系統(tǒng)樹可知，黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)甜菜立枯病病原分離物L(fēng)1菌株與腐皮鐮孢菌(Fusarium solanistrain)MW165532.1 39-b處于同一個分支，近緣關(guān)系最近。通過結(jié)合甜菜立枯病病原菌的形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，可將引起黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)甜菜苗期立枯病的病原菌L1確定為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)。

圖5 菌株P(guān)CR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳

圖6 菌株L1序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

鐮孢真菌是重要的植物病原真菌之一，是多種植物在生長過程中一大病害，是世界糧食生產(chǎn)體系中重要的致病因素之一[15]。鐮孢菌易滋生在潮濕溫暖地區(qū)，病發(fā)嚴(yán)重時可導(dǎo)致作物產(chǎn)量驟減，損失達到50%以上[16-17]。以及不同的地理、氣候、土壤等條件的差異[7]，導(dǎo)致不同鐮孢菌的組成也各不相同[18]。本實驗采集的病原菌試材為黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)的幼苗期甜菜，該種植地位于中國半干旱地區(qū)。推測此病原菌多在甜菜幼苗時期侵染的原因，是由于當(dāng)?shù)氐臍夂蛴绊?，使得甜菜苗期的生長環(huán)境過于潮濕，從而利于病原菌的滋生。鐮孢菌屬中所含毒素，不僅會造成甜菜種子的發(fā)芽減少，發(fā)育不良等病癥，還可引起植株萎蔫和壞死[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)論，接種病原菌3天后的甜菜幼苗開始出現(xiàn)幼苗倒伏、根莖部枯萎、壞死等情況。鐮孢菌單獨或復(fù)合侵染都可導(dǎo)致立枯病的發(fā)生，使得植株養(yǎng)分和水分流失，導(dǎo)致作物減產(chǎn)，同時莖部纖維受損引起植株倒伏[7]。有很多種鑒定鐮孢菌基因位點的方法，在前人研究中，ITS、tef1等方法最常使用[20]。如，高園園等[21]基于ITS和tef1基因序列的分子鑒定，構(gòu)建其基因系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了引起山東大蒜根腐病的主要病原菌為尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum)。劉文杰等[22]研究結(jié)果顯示，基于rDNAITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定引起山東青島膠州南瓜果實腐爛的病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)和匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)。本實驗通過形態(tài)學(xué)觀察，ITS和tef1基因序列的分子鑒定相結(jié)合，構(gòu)建該基因系統(tǒng)發(fā)育樹，將分離出的菌株L1確定為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)，為甜菜該病原菌的防控提供了理論基礎(chǔ)。但研究該地區(qū)甜菜立枯病的病原菌生物學(xué)特征的探究是開展有效防控的前提條件，還需要進一步研究。除此以外，腐皮鐮孢菌的侵染范圍很廣[23]，不僅可以造成各種植物的立枯病、根腐病外，還會侵染其他農(nóng)產(chǎn)品，如桃子[24]、咖啡[25]、香蕉[26]等，造成其果腐病，造成茶葉、刺桐等的葉斑病以及枯萎病[27-28]。本研究中鑒定的L1菌株的侵染范圍如何，有待進一步的研究發(fā)現(xiàn)，該研究結(jié)果可為防控管理該病害的下一步研究提供依據(jù)。

綜上，本實驗通過對黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)立枯病甜菜進行分離獲得菌株L1，并對其進行致病性測定和形態(tài)學(xué)觀察初步確定引起黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)甜菜立枯病的病原菌是鐮孢菌屬(Fusarium)真菌。而后進一步確定病原，經(jīng)過柯赫氏法則認證，通過運用分子生物手段對病原菌進行PCR擴增，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)。