董世良，詹斯文，何結(jié)望，邱 彤，張雪瓊，劉峰峰

（1湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430048；2武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430070）

0 引言

煙草為茄科煙草屬植物的全草，作為一種農(nóng)作物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。它化學(xué)成分復(fù)雜，目前檢測(cè)到的化學(xué)成分就有4000余種[1]，各化學(xué)成分的含量與多種因素有關(guān)，包括產(chǎn)地、氣候、加工工藝等。煙草化學(xué)成分是影響煙葉品質(zhì)的內(nèi)在因素[2]。如何通過(guò)可檢測(cè)的化學(xué)成分含量來(lái)全面整體地反映烤煙的質(zhì)量是目前研究的難點(diǎn)。目前，烤煙品質(zhì)大多是通過(guò)煙葉中的單項(xiàng)或常規(guī)化學(xué)成分含量來(lái)評(píng)判[3-5]，評(píng)價(jià)結(jié)果比較片面僅能起到煙葉評(píng)價(jià)的輔助作用。例如，鉀氯比僅能表明煙葉的燃燒性，施木克值僅能描述烤煙和香料煙的吃味品質(zhì)，糖酸比僅能反映烤煙的香氣風(fēng)格和香氣品質(zhì)，氮堿比反映煙氣的濃度、吃味，糖堿比只能用來(lái)判斷煙氣的柔和性和香味[6-7]等。

指紋圖譜技術(shù)是從物質(zhì)所含有的特性成分出發(fā)，運(yùn)用光譜、色譜、核磁、X射線、電化學(xué)、質(zhì)譜等現(xiàn)代分析技術(shù)，得到能夠表征藥材或中藥產(chǎn)品特性的譜圖[8]。在中藥評(píng)價(jià)中應(yīng)用頗多[9-11]，在煙葉品質(zhì)鑒別中屬于比較新的一類技術(shù)。目前指紋圖譜技術(shù)在煙草行業(yè)的應(yīng)用主要集中在煙用香精的質(zhì)量控制上，運(yùn)用指紋圖譜技術(shù)對(duì)烤煙品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)的報(bào)道較少。

指紋圖譜的基本屬性是整體性和模糊性[12]。模糊性強(qiáng)調(diào)的是對(duì)照樣品與待測(cè)樣品指紋圖譜的相似性，而不是完全相同；整體性是強(qiáng)調(diào)完整地比較色譜的特征“面貌”，而不是將其“肢解”?？緹煙熑~的指紋圖譜將烤煙作為一個(gè)整體進(jìn)行分析，對(duì)烤煙內(nèi)部的多種化學(xué)成分進(jìn)行整體的把控，相比于傳統(tǒng)的評(píng)判烤煙質(zhì)量的方法，是通過(guò)多種成分對(duì)烤煙質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)比單項(xiàng)化學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)更具可靠性。

劉偉等[13]為優(yōu)化煙葉原料感官質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法，運(yùn)用系統(tǒng)聚類和Fisher線性判別法，建立基于化學(xué)成分的烤煙感官質(zhì)量特征分類評(píng)價(jià)方法，結(jié)果表明，聚類分析可將陜西中煙曲靖沾益基地縣煙葉的感官質(zhì)量特征合理分類。楊明峰等[14]根據(jù)烤煙外觀關(guān)鍵指標(biāo)，采集了全國(guó)112個(gè)典型生態(tài)點(diǎn)初烤C3F煙葉樣品，運(yùn)用快速聚類法(K-means cluster)分析了各煙草種植區(qū)烤煙外觀質(zhì)量區(qū)域特征及分布，結(jié)果表明5個(gè)煙草種植區(qū)中部烤煙外觀質(zhì)量均可分為3類。上述研究均需依靠主觀經(jīng)驗(yàn)，首先將烤煙外觀、感官指標(biāo)進(jìn)行打分，樣品量大時(shí)耗費(fèi)人力物力，且存在主觀偶然性。為解決此問(wèn)題，本研究依托高效液相色譜法，結(jié)合主成分及聚類分析對(duì)烤煙質(zhì)量進(jìn)行分類，擬解決當(dāng)前烤煙質(zhì)量分類費(fèi)時(shí)費(fèi)力且主觀偶然性強(qiáng)的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙葉包含多個(gè)品種，14批煙葉分別為10批‘云煙87’、2批‘K326’、1批‘龍江911’、1批‘紅大’，等級(jí)為B2F下限，2019年及2020年分別取自全國(guó)多個(gè)省份14個(gè)不同的煙葉產(chǎn)區(qū)，包括湖北襄陽(yáng)?？?、湖北恩施宣恩、湖北十堰房縣、湖北?？?、湖北咸豐、安徽皖南宣城、福建龍巖、湖南永州、黑龍江林口、河南駐馬店、云南馬龍、云南沾益、四川涼山會(huì)東、貴州威寧。所有煙樣在2019—2020年采樣收集后，經(jīng)湖北中煙工業(yè)有限公司統(tǒng)一復(fù)烤后制成烤煙。

1.2 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

1.2.1 供試品溶液的制備 煙葉粉碎成細(xì)粉，精密稱取0.1 g，置于50 mL錐形瓶中，精密加入20.0 mL 50%甲醇+水溶液，置于溫度25℃、頻率為40 MHz的超聲波儀器中超聲波振蕩器超聲提取20 min。取約2 mL萃取液經(jīng)0.45μm的水相濾膜過(guò)濾。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 配制綠原酸、莨菪亭、蘆丁、山萘酚對(duì)照品的混合溶液。

1.2.3 液相條件 色譜柱為Agilent ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相 A 為水:甲醇:乙酸=88:10:2（體積比），流動(dòng)相B為水:甲醇:乙酸=10:88:2（體積比）。梯度洗脫程序：0 min，A與B體積比為100:0，16.5 min體積比80:20，30 min體積比20:80，柱溫30℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm，參比波長(zhǎng)480 nm。

測(cè)試完得到的液相指紋圖譜用2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版進(jìn)行處理，峰匹配后生成對(duì)照?qǐng)D譜，得到14批烤煙的高效液相指紋圖譜庫(kù)。

1.3 化學(xué)測(cè)定方法及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

煙堿、總氮、總糖、還原糖、鉀、氯等常規(guī)化學(xué)成分分別參考 YC/T 468—2013、YC/T 161—2002、YC/T 159—2002、YC/T 217—2007、YC/T 162—2002、YC/T216—2013測(cè)定。應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行主成分分析、簡(jiǎn)單相關(guān)分析、復(fù)相關(guān)分析，用類平均法進(jìn)行聚類分析。采用Excel 2003軟件進(jìn)行做圖分析。用2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版對(duì)指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉指紋圖譜及其主成分分析

2.1.1 指紋圖譜共有模式的建立 選取不同產(chǎn)地的B2F下限煙葉樣品共14批，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A版），選擇樣品峰較為明顯、形狀較為規(guī)整的樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，選用平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正后選取峰占比在0以上的峰進(jìn)行匹配與識(shí)別，得到指紋圖譜共有模式圖譜，確定了16個(gè)共有峰。通過(guò)與混合對(duì)照品色譜圖（圖1）和液質(zhì)聯(lián)用圖譜對(duì)比，指認(rèn)了其中4個(gè)色譜峰，分別為4號(hào)峰（17.94 min，綠原酸）、10號(hào)峰（26.42 min，東莨菪內(nèi)酯）、12號(hào)峰（35.60 min，蘆?。?、14號(hào)峰（38.45 min，山奈酚）。14批煙葉樣品的疊加指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜如圖2～3所示，其中R為峰匹配后建立的對(duì)照?qǐng)D譜。

圖1 混合對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 14批煙葉樣品的HPLC疊加指紋圖譜

圖3 煙葉樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜

由圖2可以看出，指紋圖譜中主要峰群的整體面貌基本一致，但其中不同成分量的相對(duì)值有所不同，表明煙葉樣品的質(zhì)量受多種化學(xué)成分含量的影響，烤煙質(zhì)量評(píng)價(jià)要結(jié)合多種化學(xué)成分含量綜合考慮。

2.1.2 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A版），以每批樣品生成的對(duì)照?qǐng)D譜為對(duì)照，計(jì)算14批樣品的相似度。結(jié)果（表1）表明，14批樣品的相似度較高，樣品相似度計(jì)算結(jié)果都在0.950以上，說(shuō)明各批煙葉單獨(dú)比對(duì)時(shí)不同煙葉產(chǎn)區(qū)樣品之間的多酚成分差異不大。

表1 14批烤煙樣品及對(duì)照?qǐng)D譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.1.3 指紋圖譜主成分分析 主成分分析是最常用的多指標(biāo)線性降維壓縮和多變量分析方法。它可將眾多具有一定相關(guān)性的原始變量，重新組合成為一組新的、相互無(wú)關(guān)的綜合指標(biāo)來(lái)代替原有的變量，從而實(shí)現(xiàn)以最少的主成分盡可能多地體現(xiàn)原始變量的信息。

由表2可以看出，前5個(gè)主成分特征值均大于1，累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.179%，可以表征原始因子代表的全部信息，故選取前5個(gè)主成分進(jìn)行分析。

表2 煙葉指紋圖譜共有峰峰面積的主成分分析

根據(jù)主成分的因子載荷矩陣可以得到每個(gè)主成分的信息來(lái)源。由表3可以看出，第1主成分中的信息主要來(lái)自色譜峰3、4、6、9、10、14、15、16，第2主成分中的信息主要來(lái)自色譜峰1、5、11，第3主成分中的信息主要來(lái)自色譜峰8，第4主成分中的信息主要來(lái)自色譜峰7，第5主成分中的信息主要來(lái)自色譜峰12。

表3 前5個(gè)主成分的因子載荷矩陣

由于主成分載荷矩陣U和因子載荷矩陣A滿足式(1)的關(guān)系，故可得主成分的載荷矩陣。將主成分的載荷矩陣與標(biāo)準(zhǔn)化后的原始數(shù)據(jù)相結(jié)合，即可得到主成分的綜合評(píng)價(jià)得分，如表4所示。

表4 前5個(gè)主成分的主成分得分值

其中，λi為主成分的特征值。

從表4來(lái)看，在成分1中樣品13得分最高，表明其包含色譜峰3、4、6、9、10、14、15、16的信息最為豐富；成分2中樣品83得到最高，表明其包含色譜峰1、5、11的信息最為豐富；成分3中樣品56得分最高，表明其包含色譜峰8的信息最為豐富；成分4中樣品40得分最高，表明其包含色譜峰7的信息最為豐富；成分5中樣品58得分最高，表明其包含色譜峰12的信息最為豐富。

2.2 煙葉化學(xué)成分相關(guān)性分析

相關(guān)性分析是研究2個(gè)或2個(gè)以上處于同等地位的隨機(jī)變量間相關(guān)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)分析方法。它是描述客觀事物之間相互關(guān)系的密切程度并用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)指標(biāo)將其表示出來(lái)的過(guò)程。2個(gè)變量之間的相關(guān)程度通常用相關(guān)系數(shù)r來(lái)表示。相關(guān)系數(shù)r的取值在-1～1之間，它可以是此范圍內(nèi)的任何值。正相關(guān)時(shí)，r值在0～1之間，此時(shí)一個(gè)變量增加，另一個(gè)變量也增加；負(fù)相關(guān)時(shí)，r值在-1～0之間，此時(shí)一個(gè)變量增加，另一個(gè)變量將減少。r的絕對(duì)值越接近于1，2個(gè)變量間的關(guān)聯(lián)程度越強(qiáng)，r的值越接近于0，2個(gè)變量間的關(guān)聯(lián)程度越弱。在進(jìn)行回歸分析時(shí)，經(jīng)常研究因變量與多個(gè)自變量之間的相關(guān)程度，此時(shí)可以使用復(fù)相關(guān)系數(shù)。

由于14批B2F下限等級(jí)的煙葉樣品中，湖北咸豐、貴州威寧2批煙葉樣品的常規(guī)化學(xué)成分含量數(shù)據(jù)暫未獲取，因此選用數(shù)據(jù)完整的12批煙葉樣品進(jìn)行分析，不同產(chǎn)地?zé)熑~樣品的常規(guī)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)如表5所示。將主成分得分值與煙葉化學(xué)成分做相關(guān)性分析，結(jié)果如表6所示。

表5 不同產(chǎn)地?zé)熑~常規(guī)化學(xué)成分%

表6 主成分與化學(xué)成分相關(guān)性分析

由表6可知，鉀與第1主成分呈極顯著的正相關(guān)，與主成分值的復(fù)相關(guān)也達(dá)到了極顯著水平；總糖與第1主成分呈顯著的負(fù)相關(guān)。

2.3 應(yīng)用指紋圖譜的聚類分析對(duì)煙葉品質(zhì)進(jìn)行分類

聚類分析是指將不同的樣本分類到不同的類或簇的過(guò)程，其與分類的區(qū)別在于，聚類所要求劃分的類是未知的。一般來(lái)說(shuō)，同一個(gè)類中的對(duì)象有很大的相似性，而不同類間的對(duì)象有很大的相異性。

根據(jù)主成分得分值對(duì)12批煙葉樣品進(jìn)行聚類分析，得到的系統(tǒng)聚類系譜圖（圖4）。根據(jù)譜系圖可將等級(jí)為B2F下限的12批煙葉樣品大致分為3類。樣品產(chǎn)區(qū)湖北十堰房縣、四川涼山會(huì)東為第1類，樣品產(chǎn)區(qū)湖北恩施宣恩、云南馬龍、湖北?？?、黑龍江林口、河南駐馬店、云南沾益為第2類，樣品產(chǎn)區(qū)安徽皖南宣城、福建龍巖、湖南永州、湖北襄陽(yáng)?？禐榈?類。

圖4 系統(tǒng)聚類譜系圖

對(duì)3類煙葉中各種化學(xué)成分的含量進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表7所示。

表7 不同類別煙葉化學(xué)成分含量范圍%

由之前相關(guān)分析的結(jié)果可知，鉀和主成分值之間極顯著相關(guān)，而由聚類結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，根據(jù)鉀的含量可以較好地區(qū)分第1類樣品與第2類樣品。對(duì)于氯的含量，第2類樣品中有一半達(dá)到了0.7以上，明顯高于第1、3類樣品。而對(duì)于其他4種化學(xué)成分，3類樣品間區(qū)分度較低。

3 結(jié)論與討論

比對(duì)烤煙的高效液相指紋圖譜特征峰，可以找到不同烤煙中化學(xué)成分的區(qū)別，結(jié)合主成分分析和化學(xué)成分相關(guān)性分析以及聚類分析結(jié)果可以初步判別不同產(chǎn)地烤煙的品質(zhì)。不同產(chǎn)區(qū)、品種、等級(jí)的煙葉，究其原因是煙葉中的多種化學(xué)成分組成或組成比例的不同，而指紋圖譜可以將烤煙看作一個(gè)整體對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行整體的把控，從而降低從單項(xiàng)化學(xué)成分來(lái)評(píng)價(jià)烤煙質(zhì)量的不準(zhǔn)確性。通過(guò)指紋圖譜對(duì)烤煙中多種化學(xué)成分的含量進(jìn)行比較，可以找到不同產(chǎn)區(qū)煙葉的成分差異。但如果只通過(guò)指紋圖譜比較其中的多個(gè)色譜峰信息，從中找出區(qū)別并以此來(lái)區(qū)分產(chǎn)區(qū)的話，因變量太多以致推斷過(guò)程繁瑣難以實(shí)施。為此，筆者結(jié)合主成分分析法來(lái)選取能夠反映綜合信息的代表值，將眾多的峰信息轉(zhuǎn)換成較少的變量。相關(guān)性分析可以看出，前5個(gè)主成分與煙葉中鉀、總糖達(dá)到了顯著或極顯著的相關(guān)性，可見(jiàn)指紋圖譜主成分分析可以用來(lái)對(duì)煙葉進(jìn)行質(zhì)量控制，并以此建立烤煙品質(zhì)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，這將極大減輕品吸師的工作量。不同產(chǎn)區(qū)之間的聚類結(jié)果表明，鉀含量與氯含量等煙葉中化學(xué)品質(zhì)成分指標(biāo)在同一類別中結(jié)果相近，所以基于HPLC指紋圖譜進(jìn)行的聚類分析基本可以區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)的烤煙，從而給煙葉的種植培養(yǎng)和加工提供理論依據(jù)。

在煙草行業(yè)中，將指紋圖譜與主成分分析、聚類分析結(jié)合起來(lái)應(yīng)用的例子也有一些報(bào)道。唐徐紅[15]采用指紋圖譜結(jié)合主成分分析、聚類分析等方法對(duì)云南省15個(gè)典型煙葉產(chǎn)區(qū)C3F等級(jí)的煙葉進(jìn)行了質(zhì)量分類。結(jié)果表明，2010年收獲的云南省典型煙葉產(chǎn)區(qū)的煙葉質(zhì)量可分成4個(gè)基本類型，區(qū)分結(jié)果較好。向剛[16]利用超聲萃取-超高效液相色譜法對(duì)30個(gè)煙草樣品（4個(gè)品種）的多酚類物質(zhì)進(jìn)行了快速分離與檢測(cè)，建立了不同種類煙草中多酚類物質(zhì)的UPLC指紋圖譜，并對(duì)煙草樣品進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果表明，這種基于煙草多酚指紋圖譜的分析策略是一種可同時(shí)實(shí)現(xiàn)整體性、模糊性分析且簡(jiǎn)便易行的方法模式，為煙草識(shí)別及煙草制品的質(zhì)量控制提供了部分科學(xué)依據(jù)。楊軍[17]建立了1115煙用香精香料的氣相色譜指紋圖譜，并分析了9個(gè)不同批次的1115煙用香精香料樣品，結(jié)合系統(tǒng)聚類分析法區(qū)分了不同批次的樣品指紋圖譜，并進(jìn)一步通過(guò)摻兌試驗(yàn)驗(yàn)證了方法用于煙用香精質(zhì)量控制的可行性。這些研究都證明了指紋圖譜技術(shù)用于煙葉和煙用香精的質(zhì)量評(píng)價(jià)與分類是完全可行的。

近年來(lái)，各種分析技術(shù)越來(lái)越完善，分析儀器的準(zhǔn)確度和精確度也越來(lái)越高。與其他的煙草品質(zhì)和種類鑒別方法相比，指紋圖譜技術(shù)具有多成分控制、準(zhǔn)確以及快速的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前指紋圖譜技術(shù)在煙草鑒定應(yīng)用中主要是用來(lái)鑒別煙用香精的種類[18-19]，在烤煙產(chǎn)地鑒別中也有一些應(yīng)用[20-21]，但在煙草其他方面應(yīng)用較少，指紋圖譜在煙草行業(yè)中還存在著巨大的應(yīng)用潛力。但圖譜建立過(guò)程較為繁瑣，并且需要的樣品數(shù)較大；指紋圖譜包含的潛在信息量非常大，包含有雜質(zhì)或與指紋圖譜研究無(wú)關(guān)的信息，因此結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)信息進(jìn)行整理，在保留原始特征信息的同時(shí)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化是非常有必要的。

本研究因不同產(chǎn)地同一等級(jí)樣本量相對(duì)較少，指紋圖譜評(píng)估結(jié)果可能存在偶然性，日后可提高樣本量或進(jìn)行平行試驗(yàn)減小偶然性誤差。今后的研究可基于指紋圖譜發(fā)展思路，將其他現(xiàn)代化分析技術(shù)，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、光譜學(xué)等技術(shù)手段應(yīng)用到烤煙質(zhì)量分類研究中，實(shí)現(xiàn)烤煙的快速質(zhì)量分類鑒別。

人們逐漸意識(shí)到指紋圖譜技術(shù)在煙草品質(zhì)評(píng)價(jià)中的便捷性，針對(duì)煙草指紋圖譜的研究也發(fā)展迅速，指紋圖譜技術(shù)將會(huì)在煙草品質(zhì)鑒別中起到主導(dǎo)作用?？梢酝ㄟ^(guò)指紋圖譜發(fā)現(xiàn)市面上的偽劣產(chǎn)品，這能有效地遏制煙草市場(chǎng)混雜的局面。此外，還能通過(guò)指紋圖譜對(duì)煙草進(jìn)行產(chǎn)地識(shí)別，對(duì)品質(zhì)較好的煙草的生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行研究，對(duì)其所需的土壤條件、水分、光照、生長(zhǎng)周期及加工工藝進(jìn)行考察，篩選出煙草比較合適的生長(zhǎng)環(huán)境和氣候，助力煙草病蟲(chóng)害的防控以及煙草品質(zhì)的控制，以促進(jìn)煙草產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程。