張 赫，尤夢(mèng)瑤，萬(wàn) 璐，閆佳佳，劉松梅，鄭春英

（1黑龍江大學(xué)/農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

刺五加為五加科植物刺五加(Acanthopanax senticosus)的干燥根及根莖或莖，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效[1]，是藥食兩用功能性保健食品。刺五加富含苷類[2]、黃酮[3]、多糖[4]、有機(jī)酸、木脂素、香豆素[5]等多種活性化學(xué)成分，具有抗疲勞[6]、抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗抑郁[9]、降壓[10]、保肝[11]、降糖[12]等作用，廣泛用于醫(yī)藥和食品行業(yè)。

刺五加主產(chǎn)于黑龍江，寒地黑土造就了刺五加的特有品質(zhì)，現(xiàn)已成為寒地龍藥的領(lǐng)軍品種，享譽(yù)國(guó)內(nèi)外。刺五加需求量上漲，森林面積逐漸減少以及盲目的采挖，使刺五加資源面臨考驗(yàn)，目前刺五加是國(guó)家二級(jí)瀕危物種，三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)品種[13]。盡管栽培種植在某種程度上緩解了刺五加的使用，但刺五加生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，種植戶資金回籠慢，尋找生產(chǎn)刺五加次生代謝產(chǎn)物的新方法已成為研究熱點(diǎn)。

植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[14]，將甘草內(nèi)生菌作為發(fā)酵菌株，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)刺五加次生代謝產(chǎn)物，對(duì)開(kāi)發(fā)新資源、生產(chǎn)新型保健食品及開(kāi)發(fā)新藥具有重要意義。筆者以分離自刺五加根部的內(nèi)生真菌CJ7為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物篩選及抑菌活性研究，并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，旨在為采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)刺五加次生代謝產(chǎn)物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌為內(nèi)生真菌CJ7，分離自黑龍江省帽兒山區(qū)野生刺五加根部；NA、PDA培養(yǎng)基配制方法參閱文獻(xiàn)[15-16]；金黃色葡萄球菌等11株受試菌購(gòu)于黑龍江省微生物研究所；ITS序列通用引物ITS1、ITS4由上海生物工程有限公司合成；除液相用甲醇為色譜純級(jí)別，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FL2200型高效液相色譜儀（浙江溫嶺福立分析儀器有限公司），HZQ-C空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備 無(wú)菌條件下，取已活化的內(nèi)生真菌CJ7，加無(wú)菌水適量，制成1×107CFU/mL種子液；取CJ7種子液，以2%(v/v)接種至裝液量為50 mL PDA培養(yǎng)基后，置于空氣浴搖床中培養(yǎng)14天(28℃，140 r/min)，終止發(fā)酵，抽濾，取濾液，作為發(fā)酵液供試品備用。

1.3.2 內(nèi)生真菌CJ7發(fā)酵液活性成分分析 HPLC檢測(cè)條件：VenusilXBP-C18柱(4.6mm×250mm，5μm，USA)，流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(15:85:1)，流速1 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)269 nm。

（1）供試品液的制備。取“1.3.1”發(fā)酵液供試品10 mL，減壓回收至干(50℃，0.1 MPa)，加1 mL甲醇溶解后，過(guò)濾（0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾），取濾液作為供試品溶液。

（2）對(duì)照品液的制備。精密稱取紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解后，使紫丁香苷形成1 mg/mL的對(duì)照品溶液備用。

（3）空白對(duì)照品液的制備。取PDA培養(yǎng)基10 mL，同“1.3.2（1）”法制成空白對(duì)照品液。

（4）分別取供試品液、對(duì)照品液及空白對(duì)照品液各10 μL注入HPLC儀器進(jìn)行分析。

1.3.3 內(nèi)生真菌CJ7抑菌活性分析 取“1.3.1”發(fā)酵液，凍干，稱取適量，加甲醇溶解后制成0.1 mg/mL甲醇提取物，分別以100 μg/mL鏈霉素和制霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，以甲醇溶液為空白對(duì)照，參閱文獻(xiàn)[17]，采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)內(nèi)生真菌CJ7發(fā)酵液進(jìn)行抗菌活性分析。

1.3.4 內(nèi)生真菌CJ7發(fā)酵條件優(yōu)選

（1）單因素實(shí)驗(yàn)。

①接種量對(duì)抑菌活性的影響。取“1.3.1”1×107CFU/mL種子液分別依次按1%、2%、3%、4%、5%(v/v)比例接種到50 mL初始pH 7.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)8天(28℃，120 r/min)，按“1.3.3”測(cè)定發(fā)酵液對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baummanii)抑菌活性(n=3)。

②裝液量對(duì)抑菌活性的影響。將“1.3.1”1×107CFU/mL種子液以2%(v/v)的接種量分別接入到裝有20、30、40、50、60 mL初始pH 7.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)8天，其他操作同“1.3.4（1）①”。

③初始pH對(duì)抑菌活性的影響。將“1.3.1”1×107CFU/mL種子液以2%(v/v)的接種量接入到裝有50mL初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)8天，其他操作同“1.3.4（1）①”。

④發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響。將“1.3.1”1×107CFU/mL種子液以2%(v/v)的接種量接入到裝有50mL初始pH 7.0的PDA培養(yǎng)基中，分別發(fā)酵培養(yǎng)4、6、8、10、12天，其他操作同“1.3.4（1）①”。

⑤搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)抑菌活性的影響。將“1.3.1”1×107CFU/mL種子液以2%(v/v)的接種量接入到裝有50mL初始pH 7.0的PDA培養(yǎng)基中，分別發(fā)酵培養(yǎng)8天，搖床轉(zhuǎn)數(shù)分別為100、120、140、160、180、200 r/min，其他操作同“1.3.4（1）①”。

⑥發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響。將“1.3.1”1×107CFU/mL種子液以2%(v/v)的接種量接入到裝有50mL初始pH 7.0的PDA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，搖床溫度分別設(shè)定為24、26、28、30、32℃，其他操作同“1.3.4（1）①”。

⑦碳源對(duì)抑菌活性的影響。分別選用2%(m/v)的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、蔗糖做為碳源制備“1.1”PDA培養(yǎng)基，并將“1.3.1”1×107CFU/mL種子液以2%(v/v)的接種量分別接入到裝有50 mL初始pH 7.0的培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)8天，其他操作同“1.3.4（1）①”。觀察不同質(zhì)量濃度的碳源對(duì)抑菌活性的影響(n=3)。

⑧氮源對(duì)抑菌活性的影響。分別選用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆粉、(NH4)2SO4為氮源，加入到“1.1”PDA培養(yǎng)基中，其他條件及發(fā)酵培養(yǎng)同“1.3.4（1）①”。觀察不同質(zhì)量濃度的氮源對(duì)抑菌活性的影響(n=3)。

（2）正交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果，選取碳源濃度、氮源濃度、接種量和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素作為實(shí)驗(yàn)因素，采用[L9(34)]正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

1.3.5 內(nèi)生真菌CJ7的鑒定

（1）內(nèi)生真菌CJ7形態(tài)學(xué)觀察。參閱文獻(xiàn)[18]，觀察CJ7于平板PDA培養(yǎng)基（28℃，8天）上菌落形狀、顏色、濃密程度、基內(nèi)菌絲形態(tài)及是否產(chǎn)色素等；同時(shí)，取CJ7 PDA平板（培養(yǎng)3天），將無(wú)菌蓋玻片傾斜扦入該平板中，繼續(xù)培養(yǎng)5天后取出，鑷取蓋玻片，置顯微鏡下觀察，初步確定菌株的分類地位[19]。

（2）內(nèi)生真菌CJ7 ITS序列分析。參閱文獻(xiàn)[20]的方法提取菌株CJ7 DNA，PCR產(chǎn)物純化，測(cè)序（委托上海生工生物工程股份有限公司完成）。所測(cè)得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定CJ7菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌CJ7發(fā)酵液活性成分分析

由圖1可知，在內(nèi)生真菌CJ7發(fā)酵液中，在與紫丁香苷對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間位置出現(xiàn)相同的色譜峰，而且色譜峰經(jīng)過(guò)對(duì)照品加入法得到了較好確認(rèn)，且空白對(duì)照無(wú)干擾。由此說(shuō)明，內(nèi)生真菌CJ7為紫丁香苷產(chǎn)生菌。

圖1 CJ7發(fā)酵液活性成分分析結(jié)果

2.2 內(nèi)生真菌CJ7抑菌活性分析結(jié)果

由表2可以看出，刺五加內(nèi)生真菌CJ7對(duì)10株致病細(xì)菌均有一定的抑制作用，尤其對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baummanii)抑制作用最強(qiáng)。

表2 CJ7抑菌活性分析結(jié)果mm

2.3 內(nèi)生真菌CJ7發(fā)酵條件優(yōu)選結(jié)果

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）接種量對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果。由圖2可知，隨著CJ7接種量的增加，其發(fā)酵液的抑菌活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)接種量在2%時(shí)，CJ7的抑菌活性達(dá)到最強(qiáng)，此后抑菌活性開(kāi)始減弱?？赡苁怯捎贑J7接種量的增加使菌株生長(zhǎng)密度增大，不利于抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

圖2 接種量對(duì)抑菌活性影響

（2）裝液量對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果。由圖3可以看出，裝液量在20%～40%范圍變化時(shí)，CJ7抑菌活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)裝液量持續(xù)增加時(shí)，抑菌活性開(kāi)始減弱，這與溶氧量有關(guān)，適度的溶氧量可以促進(jìn)抑菌活性的產(chǎn)生。

圖3 裝液量對(duì)抑菌活性影響

（3）初始pH對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果。由圖4可以看出，當(dāng)發(fā)酵液初始由pH 4.0增至pH 8.0時(shí)，CJ7抑菌活性出現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH 7.0時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為(23.32±0.04)mm左右，此后，隨著初始pH的增加，CJ7抑菌活性開(kāi)始出現(xiàn)減弱。上述結(jié)果說(shuō)明，CJ7最適初始為pH 7.0。

圖4 初始pH對(duì)抑菌活性影響

（4）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。由圖5可知，在不同的發(fā)酵時(shí)間下，CJ7的抑菌活性表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，這可能是由于CJ7菌株在發(fā)酵時(shí)間內(nèi)處于不同生長(zhǎng)期，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的量有所不同。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為8天時(shí)，CJ7的抑菌活性最強(qiáng)。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性影響

（5）搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果。由圖6可知，CJ7的抑菌活性隨搖床轉(zhuǎn)數(shù)的增長(zhǎng)表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)數(shù)為120 r/min時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，但搖床轉(zhuǎn)數(shù)過(guò)快也會(huì)影響CJ7菌株的正常生長(zhǎng)，這與搖床轉(zhuǎn)速協(xié)同裝液量完成液態(tài)培養(yǎng)基中氧的溶解有關(guān)。

圖6 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)抑菌活性影響

（6）發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果。由圖7可以看出，CJ7的抑菌活性隨發(fā)酵培養(yǎng)的溫度增加而呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，但發(fā)酵溫度為28℃時(shí)其抑菌活性最強(qiáng)。由此說(shuō)明，發(fā)酵溫度過(guò)低或過(guò)高都不利于CJ7抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響

（7）碳源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果。由圖8可知，不同碳源對(duì)菌株CJ7抑菌活性不同，當(dāng)選取葡萄糖為碳源時(shí)，CJ7菌株的抑菌活性最強(qiáng)，因此選用葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源。

圖8 碳源質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵液抑菌活性影響

（8）氮源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果。由圖9可知，CJ7的抑菌活性與氮源的選擇和濃度有關(guān)，當(dāng)牛肉膏作為氮源時(shí)，CJ7菌株發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)，因此選用牛肉膏作為培養(yǎng)基的氮源。

圖9 氮源對(duì)抑菌活性影響

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表3～4可知，影響CJ7抑菌活性的因素順序?yàn)樘荚促|(zhì)量濃度＞氮源質(zhì)量濃度＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間，其中碳源質(zhì)量濃度對(duì)CJ7抑菌活性的影響極顯著，氮源質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性影響顯著，接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性無(wú)顯著影響，CJ7的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C2D2，即氮源（牛肉膏）質(zhì)量濃度2%，碳源（葡萄糖）質(zhì)量濃度2.5%，接種量為2%(v/v)，培養(yǎng)8天。綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CJ7最佳發(fā)酵條件為2%牛肉膏，2.5%葡萄糖，接種量2%，裝液量40%，初始pH 7.0，培養(yǎng)8天，搖床轉(zhuǎn)數(shù)120 r/min。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

分別采用最佳發(fā)酵條件及“1.3.1”項(xiàng)發(fā)酵條件將內(nèi)生真菌CJ7發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，采用最佳發(fā)酵工藝條件培養(yǎng)CJ7后，其抑菌活性為(30.83±0.15)mm，比未經(jīng)優(yōu)選發(fā)酵工藝組的抑菌活性高4.32 mm。

2.4 內(nèi)生真菌CJ7的鑒定結(jié)果

2.4.1 內(nèi)生真菌CJ7形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 CJ7菌落在培養(yǎng)7天后，菌落直徑為8 cm左右，白色，漸變成灰綠色，中心凸起，菌落致密，毯狀、全緣，無(wú)滲出物（圖10A）；CJ7產(chǎn)分生孢子，頭呈圓柱狀，梗細(xì)長(zhǎng)、無(wú)分支，上部有膨大頂囊，其表面布滿放射狀的小梗，小梗著生單輪，上有球形分生孢子（圖10B）。

圖10 內(nèi)生真菌CJ7形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.4.2 內(nèi)生真菌CJ7 ITS序列分析結(jié)果 刺五加內(nèi)生真菌CJ7 DNA PCR擴(kuò)增后獲得1條550 bp的特異性條帶，將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，然后用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖11），內(nèi)生真菌CJ7序列與曲霉屬煙曲霉(Aspergillus fumigatusFJ810102.1)的相似性達(dá)到98%，序列的同源相似性為99%。綜合CJ7形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，將刺五加內(nèi)生真菌CJ7鑒定為煙曲霉。

圖11 內(nèi)生真菌CJ7系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

從刺五加根部分離得到1株可以產(chǎn)紫丁香苷的內(nèi)生真菌CJ7，紫丁香苷是刺五加的指標(biāo)性成分，具有抗炎[21]、抗腫瘤[22]及神經(jīng)保護(hù)[23]等多種活性。此外，該菌株具有較好的抑菌活性，其發(fā)酵工藝經(jīng)優(yōu)化后，最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度2.5%，牛肉膏質(zhì)量濃度2.0%，初始pH 7.0，裝液量40%，接種量2%，培養(yǎng)8天，搖床轉(zhuǎn)數(shù)120 r/min，發(fā)酵溫度為28℃。以抑菌圈的直徑作為抑菌作用指標(biāo)，在上述條件下，CJ7抑菌活性比未優(yōu)化前提高了4.32 mm；內(nèi)生真菌CJ7鑒定為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。

近年來(lái)，關(guān)于刺五加內(nèi)生菌的研究工作逐漸增多，但大多集中于刺五加內(nèi)生細(xì)菌[24]、內(nèi)生真菌[25]及內(nèi)生放線菌[26]的分離鑒定及抑菌[27]、抗氧化[28]等方面，且進(jìn)行刺五加內(nèi)生菌的分離鑒定工作時(shí)沒(méi)有明確的方向，所分離出的刺五加內(nèi)生菌僅邢朝斌等[29]將刺五加內(nèi)生菌株P(guān)312-1回接到刺五加植株，回接4個(gè)多月后發(fā)現(xiàn)，刺五加根部和莖部中刺五加苷B含量出現(xiàn)顯著提高，說(shuō)明刺五加內(nèi)生菌在其次生代謝產(chǎn)物生物合成過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。

筆者基于刺五加次生代謝產(chǎn)物紫丁香苷的生物合成，以紫丁香苷為對(duì)照，對(duì)刺五加內(nèi)生真菌CJ7進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物篩選，并對(duì)其發(fā)酵工藝采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)以直觀的方式反映出工藝參數(shù)對(duì)內(nèi)生真菌CJ7次生代謝產(chǎn)物紫丁香苷的影響。在工藝篩選過(guò)程中，有學(xué)者采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。在今后的研究中，本課題組將進(jìn)一步運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)刺五加內(nèi)生真菌CJ7的次生代謝產(chǎn)物篩選及發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，將為開(kāi)發(fā)利用刺五加內(nèi)生真菌CJ7，并采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫丁香苷提供參考。