孫計平，李雪君，孫 煥

（河南省農業(yè)科學院煙草研究所/黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室，河南許昌 461000）

0 引言

中國是煙草種植大國，尤其是烤煙，是國內重要的經濟作物[1]，煙草生產的可持續(xù)發(fā)展事關行業(yè)發(fā)展全局。煙蚜是世界性害蟲，也是國內煙草的主要害蟲之一[2]。煙蚜通過刺吸取食危害煙草，造成系統(tǒng)性損傷[3]，同時分泌甜而黏的“蜜露”，常誘發(fā)煙葉產生“煤污病”。此外，煙蚜還傳播黃瓜花葉病(cucumber mosaic virus，CMV)和馬鈴薯Y病毒(potato virus Y，PVY)等多種病毒病[4]?；瘜W農藥防治煙蚜見效快，在農業(yè)生產上被廣泛使用，但容易產生抗藥性，研究表明，煙蚜已經對多種化學農藥產生抗藥性[5-6]。因此，防治蚜蟲最有效的方法是推廣抗蚜蟲品種，利用其防御機制控制蚜蟲是一種有效且環(huán)境友好型防治措施[7]。

蚜蟲取食會誘導植物產生系列化學反應，包括水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)等多種信號傳導途徑的調控[8]，從而抑制蚜蟲取食、產卵等行為[9]，減輕煙蚜危害。茉莉酸是植物抗蟲的主要信號分子，在植物防御昆蟲中發(fā)揮著重要作用[10]。蚜蟲取食小麥同時激活了茉莉酸信號和水楊酸信號傳導途徑[11]，受到蚜蟲為害后，高鉀小麥體內JA含量顯著提高[12]。榆癭蚜為害榆樹葉片后，榆樹葉片JA含量顯著增加[13]。一氧化氮(carbon monoxide，NO)是植物體次生代謝物合成的必需信號分子之一，可以通過合成苯丙氨酸解氨酶促進SA的合成，通過SA改變過氧化氫酶(catalase，CAT)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性以增強植物防御反應[14]。不同口器昆蟲取食煙草葉片后，烤煙和白肋煙均能激發(fā)植物防御初期的NO和JA等信號分子的防御響應[15]，提高相關酶活性。武德功[16]研究認為，玉米品種的抗蚜性與POD和CAT活性的變化具有相關性。關于煙草品種抗蚜機制的研究較少，煙蚜取食可誘導煙草體內信號物質NO和H2S含量增加、防御酶活性提高[17]。本實驗室前期對煙草品種蚜蟲抗性進行了鑒定，并對不同煙蚜抗性煙草品種受到蚜蟲侵襲5 h后JA含量與0 h進行了比較[18]，不同煙蚜抗性煙草品種在受到煙蚜侵襲后NO含量和酶活性變化的研究較少。為深入研究不同蚜蟲抗性煙草品種受到蚜蟲侵襲后信號分子變化趨勢，本研究選用6個不同煙蚜抗性的煙草品種，研究煙蚜侵襲不同時間對JA和NO含量以及CAT活性的影響，以期揭示煙草品種對煙蚜的防御響應機制，并為煙草抗蚜材料的進一步應用提供數(shù)據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6個供試煙草品種具體見表1，均由河南省農業(yè)科學院煙草研究所提供。

表1 參試品種

1.2 煙苗培養(yǎng)和接種蚜蟲

2020年3月，在河南省農業(yè)科學院煙草研究所育苗大棚采用漂浮育苗培育煙苗。煙苗培養(yǎng)至3～4片真葉時，移栽到花盆中培養(yǎng)，每盆1株，每個品種18盆。煙苗培養(yǎng)至7～8片真葉，每個品種選擇有代表性15株接種蚜蟲，每株接種4齡無翅成蚜30頭，0、3、6、9 h分別取葉片，5株混合取樣作為1個重復，試驗重復3次。

1.3 樣品測試分析

1.3.1 茉莉酸含量測定 參考實驗室前期測定方法[18]。稱取0.1 g樣品，液氮中研磨，加入1 mL80%甲醇溶液，-20℃過夜；4℃、8 000 r/min離心1 h，取上清液，過C-18固相萃取柱，氮氣吹干，保存?zhèn)溆?；上機前加入pH 7.4的PBS緩沖液，定容1 mL；室溫條件下放置30 min，4℃離心15 min，取上清液保存于4℃冰箱，采用超高效液相色譜測定。

1.3.2 一氧化氮含量測定 采用試劑盒提?。ㄔ噭┖胁少徲谔K州科銘生物技術有限公司，貨號為NO-1-G），酶標儀微量法測定，測定步驟參考試劑盒說明書進行，讀取特定產物在波長550 nm的吸光值，根據說明書計算樣品一氧化氮含量。

1.3.3 過氧化氫酶活性測定 采用過氧化氫酶試劑盒提取，測定步驟參考試劑盒說明書進行（試劑盒采購于蘇州科銘生物技術有限公司，貨號為CAT-1-Y），采用紫外分光光度計測定，波長240 nm，根據說明書計算樣品CAT活性。

1.4 數(shù)據處理

數(shù)據處理和作圖采用Excel 2007。方差分析應用DPS 14.5軟件，采用LSD法進行多重比較和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 煙蚜取食對不同煙蚜抗性煙草品種茉莉酸含量的影響

不同煙草品種煙蚜取食后茉莉酸含量均呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢（圖1），所有品種JA含量均在煙蚜取食6 h達到最高，且顯著高于其他時間段。煙蚜取食前，茉莉酸含量表現(xiàn)為抗蚜品種＞中抗品種＞感蚜品種＞高感品種，品種間差異達到顯著水平。煙蚜取食3 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’茉莉酸含量增加量最多，比0 h增加67.59 ng/g，其次為‘龍舌煙’、‘毛煙’，茉莉酸分別增加57.70、59.63 ng/g，感蚜品種‘SpeightG-28’、高感品種‘螺絲頭2474’和‘云煙97’茉莉酸增加量分別為37.56、35.90、36.19 ng/g。煙蚜取食6 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’茉莉酸含量比0 h增加357.26 ng/g，其次為‘龍舌煙’和‘毛煙’，茉莉酸分別增加348.18、329.50 ng/g，感蚜品種‘SpeightG-28’、高感品種‘螺絲頭2474’和‘云煙97’茉莉酸增加量均低于300 ng/g。煙蚜取食9 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’茉莉酸含量比0 h增加275.55 ng/g，其次為‘龍舌煙’和‘毛煙’，茉莉酸分別增加250.65、249.47 ng/g，感蚜品種‘SpeightG-28’、高感品種‘螺絲頭2474’和‘云煙97’茉莉酸增加量分別為213.119、206.40、201.99 ng/g。不同煙草品種受蚜蟲侵襲后茉莉酸含量增加量不同，總體表現(xiàn)為抗蚜品種＞中抗品種＞感蚜品種＞高感品種。

圖1 煙蚜取食對不同抗性煙草品種JA含量的影響

2.2 煙蚜取食對不同煙蚜抗性煙草品種一氧化氮含量的影響

由圖2可知，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’各時間點一氧化氮含量均高于其他品種，其中0、6、9 h差異達顯著水平。煙蚜取食后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’、中抗品種‘毛煙’和‘龍舌煙’的一氧化氮含量變化均呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢，一氧化氮含量均在煙蚜取食3 h達到最高，其次為煙蚜取食6 h后，這2個時間段一氧化氮含量顯著高于其他時間段。感蚜品種‘SpeightG-28’、高感蚜蟲品種‘云煙97’和‘螺絲頭2474’在煙蚜取食3 h后一氧化氮含量與0 h差異不顯著，在煙蚜取食6 h和9 h后一氧化氮含量顯著低于0 h。

圖2 煙蚜取食對不同抗性煙草品種一氧化氮含量的影響

所有參試品種的一氧化氮含量均在煙蚜取食9 h后最低，與0 h相比較，感蚜品種‘SpeightG-28’、高感蚜蟲品種‘螺絲頭2474’和‘云煙97’的一氧化氮含量下降幅度較大，分別下降了20.41%、21.31%和29.23%；‘豎把老母雞2113’、中抗品種‘龍舌煙’和‘毛煙’的一氧化氮含量下降幅度相對較小，分別下降了6.36%、8.96%和11.97%。

2.3 煙蚜取食對不同煙蚜抗性煙草品種CAT活性的影響

由圖3可知，所有品種CAT活性均以蚜蟲取食前最低，煙蚜取食后，CAT活性表現(xiàn)為增加趨勢，蚜蟲取食后9 h最高，極顯著高于其他時間點。煙蚜取食3 h后，中抗品種‘龍舌煙’CAT活性增加量最多，比0 h增加19.40 U/mg，其次為抗蚜品種‘豎把老母雞2113’。煙蚜取食6 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’和中抗品種‘毛煙’CAT活性增加量最多，分別22.34、22.73 U/mg。煙蚜取食9 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’CAT活性增加量最多、增幅最大，比0 h增加43.21 U/mg，是0 h的1.66倍。

圖3 煙蚜取食對不同抗性煙草品種CAT活性的影響

3 結論

煙蚜取食可誘導煙草植株體內信號物質NO和JA含量增加、CAT活性提高，進而產生系列防御反應，抗蚜蟲煙草品種在受到煙蚜為害后信號分子和酶活性變化快，且升高幅度大于感蚜蟲品種。煙蚜為害前后煙草葉片NO和JA含量及CAT活性的變化可以作為煙草品種抗蚜性鑒定生理指標，為進一步深入研究煙草品種抗蚜機理提供了參考。

4 討論

植物防御反應是植物應對昆蟲取食的特異性反應，可激發(fā)植物體內乙烯、SA、JA、H2O2等多條信號途徑[15]。JA是關鍵的信號分子之一，與植物的抗逆性密切相關[18,22]，JA最重要的作用就是對傷口誘導的防御響應[23]。張艷敏等[15]研究‘云煙87’接種蚜蟲后發(fā)現(xiàn)葉片和根系中JA含量均顯著增加。本實驗室前期的研究認為，蚜蟲為害5 h后，煙草葉片JA含量顯著增加，且抗蚜品種受到蚜蟲侵襲后JA含量增幅也明顯高于其他品種[18]，但沒有進行蚜蟲危害后多個時間段JA的變化研究。為了深入研究煙草品種受到蚜蟲侵襲后信號分子變化趨勢，選用不同抗蚜性的煙草品種接種蚜蟲，受到蚜蟲為害后，煙草葉片JA含量表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，煙蚜取食6 h后葉片JA含量達到峰值，且抗蚜品種JA含量的增量大于感蚜品種，因此結合前期研究結果，煙蚜取食5～6 h后取葉片測定JA含量，可以用于鑒定煙草品種的抗蚜性。

植物遭受到害蟲侵襲后，可以誘導植物體產生防御信號物質，進而激活防御反應提高抗蟲性[17]。信號分子NO參與植物逆境脅迫的防御反應[24]，能夠介導植物細胞中防衛(wèi)基因表達[15]。Moloi等[25]研究認為，蚜蟲取食能誘導小麥體內NO的增加。余源嬋等[17]研究發(fā)現(xiàn)，煙蚜取食可誘導葉片NO含量顯著升高，不同品種NO含量達到峰值時間不同，推測信號分子NO參與了植物抗蟲性的誘導。張艷敏等[14]研究表明，煙蚜取食‘云煙87’煙株后，NO含量在葉部和根部均呈先增加后降低趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，蚜蟲為害煙草葉片后，不同煙蚜抗性煙草品種表現(xiàn)不同，抗蚜品種NO含量表現(xiàn)為先增加后下降，煙蚜取食3 h后NO含量達到峰值；感蚜品種NO含量在煙蚜取食3 h后與0 h差異不顯著，但煙蚜取食6、9 h后顯著降低，這與張艷敏等[14]研究認為‘云煙87’接種蚜蟲9 h后NO含量達到峰值的結果不一致，可能是煙草品種、苗齡和接種蚜蟲數(shù)量差異所致；但研究結果均表明信號分子NO參與了煙蚜脅迫響應，煙蚜取食前后NO含量變化可以作為鑒定煙草品種抗蚜性的輔助指標。

昆蟲取食可誘導植物多種防御酶活性變化，以形成有效的防御體系來抵制蟲害[26]，抗蚜和感蚜玉米品種在受到蚜蟲為害后，SOD、POD、CAT均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，抗蚜品種升高率高于感蚜品種[16]。本研究結果表明，抗蚜和感蚜煙草品種在受到煙蚜侵襲后，CAT均表現(xiàn)為增加趨勢，煙蚜取食9 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’的CAT活性為0 h的1.66倍，顯著高于其他品種。由于試驗只檢測到接蟲后9 h，CAT活性在9 h之后變化還有待于進一步研究。

本研究僅研究了6個煙草品種煙蚜取食后JA、NO含量和CAT活性的變化，初步探討了不同蚜蟲抗性煙草品種接蟲后的反應。寄主植物對煙蚜的抗性是一個綜合性狀，不僅受葉片結構、腺毛密度等物理特征的影響，而且受葉面化學成分的影響?？瓜x性是一個個體內部全部基因的綜合效應，因此，煙草品種抗蚜機理的研究還有待于進一步開展。