陳騰飛，練東銀，高云航，宋玲，李晗，侯紅平，李建良，彭博，葉祖光，張廣平

中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京100029

金骨蓮為經典苗藥，收載于《國家中成藥標準匯編》和《國家基本醫(yī)療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄》，由透骨香、漢桃葉、大血藤、八角楓、金鐵鎖5味藥組成，具祛風除濕、消腫止痛功效，常用于風濕痹阻所致關節(jié)腫痛、屈伸不利等。方中大血藤又名紅藤、紅皮藤，具有清熱解毒、活血祛風、止痛功效，用于治療風濕、類風濕等疾病，能夠抑制炎性因子，減輕炎癥反應。大血藤主要含有紅景天苷、香草酸、原兒茶酸等酚類成分，以及綠原酸、咖啡酸等有機酸類成分。紅景天苷為其重要的藥理活性成分，藥理學研究表明，紅景天苷通過調控與骨關節(jié)炎相關的TLR4/NF-κB信號通路，減輕大鼠骨關節(jié)炎急性期的疼痛和關節(jié)腫脹，減少血清中炎性因子的含量而發(fā)揮抗炎作用；還可通過HIF-1α/EPO途徑降低腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6水平，促進成骨細胞中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的轉錄活性，激活HIF-1α通路，降低細胞分化和礦化程度，進而發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。課題組前期研究表明，金骨蓮提取物能明顯抑制脂多糖誘導的RAW264.7細胞炎癥反應，減少炎癥因子的釋放，其抗炎作用與抑制PI3K/Akt途徑有關。因此，考察血漿中紅景天苷的濃度有利于進一步明確金骨蓮的藥效物質基礎。

高效液相色譜串聯質譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）技術靈敏度高、重復性好、特異性強，樣品前處理方法相對簡單，尤其適用于血漿、組織等復雜基質中外源性或內源性成分的濃度測定。目前已有文獻報道血漿中紅景天苷的檢測方法及其單體或復方給藥后大鼠體內的藥代動力學研究，但現有方法或靈敏度較低，或分析時間較長，或生物樣本用量大，且未見報道連續(xù)給藥后紅景天苷在體內是否有蓄積效應。因此，本研究建立HPLC-MS/MS測定血漿中紅景天苷濃度的方法，用于金骨蓮連續(xù)14 d給藥后大鼠體內紅景天苷藥代動力學的研究。

1 儀器、試藥與動物

Qtrap 5500超高靈敏度三重四極桿串聯線性離子阱液質聯用系統(tǒng)，包括ExionLC AC液相色譜儀和Qtrap 5500質譜儀（美國SCIEX公司）；MS105DU十萬分之一電子天平（德國Mettler-Toledo 公司）；RVC 2-18 CDplus 真空濃縮儀（德國Christ 公司）；Centrifuge 5254R 離心機（德國Eppendorf 公司）；Vortex-genie2 G560E 漩渦儀（美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司）。

紅景天苷（Salidroside，98.6%，批號110818-202009），中國食品藥品檢定研究院；水楊苷（Salicin，內標，98.0%，批號L810U79），北京百靈威科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，德國Merck公司；甲酸（色譜純），美國ROE SCIENTIFIC公司；丙酮（色譜純），美國Thermo Fisher Scientific 公司；純凈水，中國杭州娃哈哈集團有限公司。金骨蓮膠囊提取物（批號20190314），貴州益佰制藥股份有限公司。

SPF級雄性SD大鼠，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。動物試驗經中國中醫(yī)科學院中藥研究所動物倫理委員會批準（2021B196）。于中國中醫(yī)科學院中藥研究所SPF級動物房適應性飼養(yǎng)至少5 d，溫度（23±1）℃，濕度50%±15%，12 h 晝夜交替。

2 方法與結果

2.1 標準曲線溶液及質控溶液制備

精密稱取紅景天苷適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容至刻度，搖勻后，用甲醇稀釋成濃度為1.00 mg/mL的紅景天苷貯備液。用甲醇按一定比例將貯備液稀釋成紅景天苷濃度依次為10 000、7 500、5 000、2 000、1 000、200、100 ng/mL的系列標準曲線溶液，以及紅景天苷濃度為7 500、2 000、200、100 ng/mL的質控溶液，-80 ℃冰箱冷凍保存。臨用前，用空白血漿將上述標準曲線溶液和質控溶液稀釋10倍，制成標準曲線樣品和質控樣品。

2.2 內標溶液制備

精密稱取水楊苷適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容至刻度，搖勻后，用甲醇稀釋成水楊苷濃度為1.00 mg/mL的內標貯備液。用丙酮按一定比例將其稀釋成水楊苷濃度為50 ng/mL的內標溶液，-80 ℃冰箱冷凍保存。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品50 μL，置1.5 mL離心管中，加入400 μL 內標溶液，渦旋1 min，超聲處理（頻率40 kHz，下同）1 min，4 ℃、14 000 r/min離心5 min，取上層溶液350 μL，45 ℃、1 700 r/min減壓濃縮至干燥，各加入100 μL甲醇，渦旋1 min，超聲處理1 min，4 ℃、14 000 r/min 離心5 min，取上清液10 μL 進樣分析。

2.4 色譜及質譜檢測條件

色譜條件：采用飛諾美Kinetex C18 100 ?色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm），流動相為甲醇（B）-水（A），梯度洗脫（0～1 min，5%B；1～1.5 min，5%～85%B；1.5～2.5 min，85%B；2.5～2.6 min，85%～5%B；2.6～5 min，5%B），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。

質譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），負離子模式，檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM），氣簾氣35 psi，碰撞氣為Medium，噴霧電壓-4 500 V，輔助氣加熱溫度500 ℃，輔助氣1 為45 psi，輔助氣2 為45 psi。紅景天苷和水楊苷（內標）定量分析離子對（）分別為299.0→119.1 和285.2→123.1，碰撞能分別為-17.6 V和-24.1 V，去簇電壓分別為-44.2 V和-81.7 V。

2.5 方法學考察

按2020 年版《中華人民共和國藥典》（四部）“9012 生物樣品定量分析方法驗證指導原則”進行方法學驗證，包括選擇性、線性、定量下限、精密度與準確度、基質效應和提取回收率，以及穩(wěn)定性等。

2.5.1 選擇性考察

取大鼠空白血漿各50 μL，分別加入400 μL丙酮、400 μL內標溶液進行蛋白沉淀處理后，再按“2.3”項下方法制備空白血漿樣品和內標樣品；取“2.1”項下標準曲線樣品50 μL、給藥后血漿樣品50 μL，按“2.3”項下方法處理，制備含標準品血漿樣品和大鼠給藥后6 h血漿樣品。上述4種樣品按“2.4”項下方法進行處理和分析，得紅景天苷和內標水楊苷在不同樣品中的提取離子流色譜圖，見圖1。結果顯示，金骨蓮膠囊中的待測成分紅景天苷的保留時間為3.91 min，內標的保留時間為3.94 min，峰型良好?？瞻籽獫{中相應的保留時間無明顯的內源性物質或雜質的干擾，表明該血漿處理方法和分析方法的選擇性良好。

圖1 大鼠血漿中紅景天苷和內標HPLC-MS/MS圖

2.5.2 標準曲線及定量下限考察

取大鼠空白血漿，按“2.1”項下方法配制7個濃度的標準曲線樣品（紅景天苷濃度依次為1 000、750、500、200、100、20、10 ng/mL），按“2.3”和“2.4”項下方法進行處理和分析，以待測物與內標峰面積比值為縱坐標，待測物濃度為橫坐標，采用加權（1/）最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程＝0.001 19＋0.005 38，＝0.999 1，線性范圍為10～1 000 ng/mL，線性關系良好，定量限為10 ng/mL（信噪比S/N＞10）。

2.5.3 精密度與準確度

取大鼠空白血漿，按“2.1”項下方法制備紅景天苷濃度為10、20、200、750 ng/mL的定量下限、低、中、高4個濃度質控樣品，按“2.3”和“2.4”項下方法進行處理和分析，平行操作6份樣本，測定3 d。根據當日標準曲線，分別計算質控樣品的測得濃度，與標示濃度對照，計算準確度，并計算批內和批間精密度。結果顯示，紅景天苷的批內精密度RSD為1.9%～6.4%，準確度為100.1%～108.0%；批間精密度RSD為3.5%～6.1%，準確度為102.1%～106.4%，均符合相關要求，提示該方法的準確可靠，重復性良好。

2.5.4 基質效應和提取回收率

取娃哈哈純凈水50 μL，按“2.3”項下方法加入內標溶液并濃縮干燥，之后加入100 μL對應濃度的低、高濃度質控溶液復溶，處理后取上清采用“2.4”項下方法進行分析，測得紅景天苷的峰面積為A（每個濃度平行6份）；取大鼠空白血漿50 μL（6個不同來源），按“2.3”項下方法加入內標溶液并濃縮干燥，之后加入100 μL對應濃度的低、高濃度質控溶液復溶，處理后取上清采用“2.4”項下方法進行分析，測得紅景天苷的峰面積為B；取大鼠空白血漿（6個不同來源），按“2.1”項下方法制備低、高濃度的質控樣品，按“2.3”和“2.4”項下方法進行處理和分析，測得紅景天苷的峰面積為C。B與A的比值為基質效應，C與B的比值為提取回收率。結果顯示，紅景天苷的基質效應為32.1%～61.9%，存在一定的基質抑制作用，RSD 為11.0%～14.1%，說明個體間的基質效應差異不大，通過標準曲線校正后，不影響生物樣品定量分析的準確性。血漿樣品中紅景天苷的提取回收率為33.3%～51.7%，RSD為11.4%～11.7%。

2.5.5 穩(wěn)定性

選擇低、中、高3個濃度的質控溶液，以空白大鼠血漿按“2.1”項下方法制備相應濃度的質控樣品，各濃度質控樣品分別在室溫放置2 h、-80 ℃→室溫凍融2次、-80 ℃放置30 d后，按“2.3”和“2.4”項下方法進行處理和分析，并將樣品處理后在進樣器放置24 h后，按“2.4”項下條件進行分析，每個濃度平行6份樣品。以當日新配制的隨行標準曲線計算樣品濃度及各質控樣品的精密度和準確度，考察樣品放置穩(wěn)定性。結果顯示，紅景天苷室溫放置2 h后各濃度質控樣品的準確度為103.1%～104.3%，精密度RSD 為2.0%～5.9%；-80 ℃→室溫凍融2次后各濃度質控樣品的準確度為97.0%～107.1%，精密度RSD 為4.2%～4.9%；-80 ℃放置30 d后各濃度質控樣品準確度為102.4%～103.1%，精密度RSD為1.4%～2.7%；進樣器放置24 h后各濃度質控樣品的準確度為101.7%～107.3%，精密度RSD為2.8%～9.6%，表明上述處理條件及放置條件下樣品穩(wěn)定，可以滿足定量分析的要求。

2.6 藥代動力學研究

雄性SD大鼠5只，適應性飼養(yǎng)后，于實驗前禁食12 h，自由飲水。金骨蓮膠囊提取物用0.5%CMC-Na溶解后，按10 mL/kg灌胃給藥（相當于60 g原藥材/kg），連續(xù)給藥14 d，分別于第1、14日給藥后0.083、0.167、0.333、0.667、1、2、4、6、8、10、12、24 h經大鼠眼眶靜脈叢采血約0.2 mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，12 000 r/min離心3 min，轉移血漿，-80 ℃冰箱冷凍保存。采用已建立的分析方法對血漿中的紅景天苷進行定量分析，并采用MaS Studio 1.5.2.14軟件計算灌胃給藥金骨蓮膠囊提取物后大鼠體內紅景天苷的藥代動力學參數（非房室模型），對第14日和第1日給藥后的藥代參數進行單因素方差分析（One-way ANOVA），＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

取各時間點血漿樣品，按“2.3”項下條件處理，按“2.4”項下方法進行分析，以當日配制的隨行標準曲線計算紅景天苷血藥濃度，繪制平均血藥濃度-時間曲線，見圖2。

圖2 大鼠連續(xù)14 d灌胃金骨蓮膠囊提取物的紅景天苷藥-時曲線（x±s，n＝5）

采用非房室模型計算紅景天苷的藥代動力學參數，并進行統(tǒng)計分析，結果見表1。第14 日給藥后、AUC、AUC、MRT、MRT分別為（1 123.57±88.35）ng/mL、（2 861.62±514.98）ng·h/mL、（2 867.93±514.60）ng·h/mL、（1.56±0.21）h、（1.58±0.21）h，與第1日給藥后的各參數相比較，均無顯著性差異，說明連續(xù)給藥后紅景天苷在大鼠體內的暴露量和平均駐留時間無明顯增加，未發(fā)現蓄積效應。另外，與第1日給藥金骨蓮膠囊提取物后比較，第14日給藥后紅景天苷的明顯縮短（＜0.01），明顯提前（＜0.05），說明連續(xù)給藥后大鼠體內紅景天苷消除變快。

表1 紅景天苷給藥不同時點主要藥代動力學參數（x±s，n＝5）

3 討論

本研究建立了大鼠血漿中紅景天苷濃度測定的HPLC-MS/MS方法，并以此快速、靈敏、準確分析了灌胃給藥金骨蓮膠囊提取物后大鼠血漿中紅景天苷的濃度，系統(tǒng)考察了連續(xù)14 d給藥金骨蓮后紅景天苷的藥代動力學特征，初步明確了紅景天苷的體內暴露程度和體內過程，為苗藥金骨蓮藥效物質基礎的深入研究提供了參考。

首先，對蛋白沉淀試劑進行優(yōu)化。蛋白沉淀試劑的選擇，直接影響到樣品處理的結果。本試驗分別考察了甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯及二氯甲烷作為蛋白沉淀試劑，處理含有同等濃度的紅景天苷血漿樣品，發(fā)現丙酮處理后，樣品中紅景天苷的峰面積最大，靈敏度更高，因此選擇丙酮作為蛋白沉淀試劑。

其次，優(yōu)化了色譜條件。流動相及色譜條件也會影響測定結果，本試驗考察了不同品牌的C18色譜柱，以及乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%甲酸水及甲醇-0.05%甲酸水等不同的流動相系統(tǒng)，并優(yōu)化了等度和梯度洗脫程序，結果表明飛諾美Kinetex C18 100 ?色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）在4種流動相系統(tǒng)均能獲得較好的色譜峰形，綜合考慮色譜柱的清洗、保護及保存等因素，最終選擇甲醇-水梯度洗脫的方式作為流動相系統(tǒng)。

采用以上條件建立的HPLC-MS/MS 方法能夠快速、靈敏、準確分析大鼠血漿中紅景天苷的濃度，適用于藥代動力學研究。通過藥代動力學研究發(fā)現，給藥金骨蓮后，紅景天苷在大鼠體內迅速被吸收并達到峰濃度，第14日給藥后的達峰時間和半衰期比第1日給藥后均有所減少，分析原因可能是金骨蓮膠囊是復方制劑，成分種類較多，單次或連續(xù)給藥后會產生復雜的藥物-藥物相互作用及不同藥物成分與肝藥酶的相互作用，使紅景天苷的吸收、代謝和排泄發(fā)生改變。大鼠1次/d連續(xù)14 d給藥金骨蓮，末次給藥后大鼠血漿中紅景天苷的峰濃度、體內暴露量（曲線下面積）及平均駐留時間與首次給藥后相比較，均無明顯升高，表明連續(xù)給藥金骨蓮后紅景天苷無蓄積效應。