鐘峰，匡泓俊，文錢，曹洋，袁楠，楊臘媛，袁楊陽，章薇

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是以結(jié)腸傳輸時間延遲為特征的腸道疾病，好發(fā)于青年女性和老年群體。STC發(fā)病率逐年提高，全球患病率達14%。此外，STC纏綿難愈、反復發(fā)作，降低患者生活質(zhì)量，部分患者通過服用瀉藥改善癥狀，但長期服用瀉藥會導致腎病、心腦血管疾病患病風險增加。

STC發(fā)病機制尚未明晰，目前認為腸神經(jīng)系統(tǒng)、Cajal間質(zhì)細胞（ICC）是治療STC的關(guān)鍵靶點。酪氨酸激酶受體c-Kit能與干細胞因子（SCF）結(jié)合，形成SCF/c-Kit 通路，調(diào)控ICC 增殖。乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）是膽堿能神經(jīng)元的標志酶，是腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，電針“天樞”“大腸俞”能改善膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子甲基化狀態(tài)，緩解便秘癥狀。俞募配穴是針灸基礎(chǔ)理論最經(jīng)典的配穴法，大腸俞和天樞分別為大腸俞募穴，被廣泛用于治療消化系統(tǒng)疾病。但電針天樞、大腸俞能否通過調(diào)節(jié)ChAT、SCF、c-Kit表達發(fā)揮促進腸動力作用并不清楚。本實驗通過建立STC大鼠模型，觀察電針天樞、大腸俞對結(jié)腸組織ChAT和SCF/c-Kit通路表達的影響，明確電針治療STC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠40 只，5～6 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2016-0003。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，溫度20～25 ℃、濕度40%～60%環(huán)境，標準飼料喂養(yǎng)。實驗過程遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。本實驗方案通過湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審批（LL2021091502）。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol（美國Invitrogen 公司，貨號15596018），RIPA 裂解液（北京百奧萊博公司，貨號MT0066），PVDF 膜（美國Millipore 公司，貨號IPVH00010），SCF抗體（美國GeneTex公司，貨號31379），c-Kit抗體（美國ThermoFisher 公司，貨號14-1172-82），ChAT抗體（英國Abcam公司，貨號ab178850），復方地芬諾酯片（江蘇常州康普藥業(yè)，批號1503030）。HANS-200A型電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），華佗牌針灸針，0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司，MDF-C8V 超低溫冰箱（日本Sanyo 公司），SJX-402，高溫殺菌恒溫箱（上海躍進），CFX96型RTPCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 分組與造模

將復方地芬諾酯片與生理鹽水混合，制成濃度為15 mg/mL地芬諾酯混懸液。將40只大鼠隨機分為空白組、鹽水組、模型組和電針組，每組10只。模型組和電針組參照文獻[7]采用復方地芬諾酯混懸液灌胃建立STC大鼠模型，體積10 mL/kg，空白組不予處理，鹽水組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)21 d。末次灌胃后，大鼠禁食不禁水24 h，予150 g/L活性炭混懸液灌胃，體積1 mL/100 g。第22日記錄首粒黑便排出時間，排出時間長于空白組均值的大鼠為造模成功。鹽水組用于驗證生理鹽水對結(jié)果的影響。

1.4 干預

造模成功后，剔除電針組大鼠腹部和背部毛發(fā)，碘伏消毒。參照《實驗針灸學》，選取雙側(cè)“天樞”“大腸俞”直刺進針5 mm，各穴旁開0.5 mm處刺入一輔助針用于固定，淺刺透皮。主針與輔助針分別接電針儀正、負極，疏密波，頻率2/15 Hz，強度0.5～1 mA，以肢體末端輕微抖動為度，15 min/次，1次/日，空白組、鹽水組和模型組每日固定15 min。連續(xù)14 d。

1.5 胃排空率和小腸推進率檢測

干預結(jié)束后，大鼠禁食不禁水24 h，予半固體糊（含活性炭、淀粉、糖、羧甲基纖維素鈉、奶粉等）1 mL（質(zhì)量為W1）灌胃，30 min后腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠，剖腹，結(jié)扎賁門和幽門，取出胃和小腸，將小腸拉直，用卷尺測量幽門至半固體糊推進處的距離（L1）及幽門到回盲部長度（L2），稱量胃總質(zhì)量（W2），剪開胃體，沖洗內(nèi)容物，稱量胃凈質(zhì)量（W3），計算胃排空率和小腸推進率。胃排空率（%）＝[1－（W2－W3）/W1]×100%，小腸推進率（%）＝L1/L2×100%。

1.6 免疫熒光檢測

大鼠結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片。切片二甲苯脫蠟，過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，PBS浸泡，熱修復法修復抗原，滴加山羊血清室溫封閉30 min，分別加入ChAT、c-Ki t一抗（均為1∶100），4 ℃孵育過夜。加入熒光二抗（1∶200），37 ℃避光孵育30 min，DAPI避光孵育5 min，抗熒光衰減劑封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，每張切片隨機選取3個視野拍照。ChAT標記膽堿能神經(jīng)元，陽性表達為紅色，c-Kit標記ICC，陽性表達為綠色。Image J 1.8.0軟件計算平均熒光強度。

1.7 Western blot檢測

取結(jié)腸組織，加入RIPA裂解液，置于冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。上樣，電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入c-Kit、SCF一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次。加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，PBST洗膜3次。加入ECL化學發(fā)光液顯色曝光，采用Image J 1.8.0軟件分析條帶灰度值。以β-tubulin為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

1.8 RT-PCR檢測

取結(jié)腸組織，加入1 mLTrizol研磨，加入氯仿振蕩15 s，室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移水相，按RNA提取試劑盒說明書提取RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、50 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，用2法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 電針對模型大鼠胃排空率和小腸推進率的影響

空白組與鹽水組大鼠胃排空率、小腸推進率差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠胃排空率、小腸推進率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠胃排空率、小腸推進率顯著升高（＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠胃排空率和小腸推進率比較（，%）

2.2 電針對模型大鼠結(jié)腸組織乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶和酪氨酸激酶受體c-Kit表達的影響

空白組與鹽水組大鼠結(jié)腸組織ChAT和c-Kit表達差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織ChAT和c-Kit表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠結(jié)腸組織ChAT和c-Kit表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。見圖1、圖2、表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織ChAT和c-Kit表達比較（，熒光強度）

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織ChAT陽性表達（免疫熒光染色）

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織c-Kit陽性表達（免疫熒光染色）

2.3 電針對模型大鼠結(jié)腸組織干細胞因子和酪氨酸激酶受體c-Kit蛋白表達的影響

空白組與鹽水組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit蛋白差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。見圖3、表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit蛋白表達比較（）

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit蛋白免疫印跡

2.4 電針對模型大鼠結(jié)腸組織干細胞因子和酪氨酸激酶受體c-Kit mRNA表達的影響

空白組與鹽水組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit mRNA差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit mRNA表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit mRNA表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit mRNA表達比較（）

3 討論

STC屬中醫(yī)學“便秘”范疇，病機以大腸傳導失職為主，涉及脾、腎、肝等臟腑。病機可概括為情志失衡致氣機滯留、飲食失潔致濕熱陰寒積于胃腸、年老勞倦致氣血兩虛不濡胃腸等。五臟六腑之氣匯聚于俞募穴，天樞歸胃經(jīng)，為大腸之募穴?！鹅`樞·本輸》有“大腸小腸，皆屬于胃，是足陽明也”，故論治腸病可從胃經(jīng)出發(fā)。刺激天樞可補益脾胃、益精養(yǎng)血，氣血充盈推動有力，從而促進胃腸傳導。從解剖學上分析，天樞深部為小腸，深刺天樞可調(diào)節(jié)腸功能，且安全性較高。大腸俞是大腸之背俞穴，屬膀胱經(jīng)，可調(diào)節(jié)腸道傳導。兩穴相配，共奏疏通腸腑氣機之效。團隊前期臨床研究表明，電針天樞、大腸俞對功能性腸病有雙向調(diào)節(jié)作用。基礎(chǔ)研究表明，電針“天樞”“大腸俞”能減輕STC大鼠結(jié)腸損傷，修復ICC結(jié)構(gòu)。

腸神經(jīng)系統(tǒng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡構(gòu)成胃腸道動力的基本單位。膽堿能神經(jīng)元是一種廣泛分布的神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元，在腸神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高。ChAT在膽堿能神經(jīng)元胞體中合成，能催化合成促進胃腸動力激素乙酰膽堿。膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量及其合成的ChAT與腸動力密切相關(guān)。ChAT是膽堿能神經(jīng)元的標記物，通過檢測ChAT能反映結(jié)腸膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量及活性。研究表明，膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，結(jié)腸ChAT表達降低，腸道神經(jīng)肌肉傳遞減少，釋放促腸動力激素不足，則導致腸動力下降。ICC是一種廣泛存在于平滑肌組織的間質(zhì)細胞，特別是胃腸道中存在大量ICC，其能激發(fā)慢波電位，與腸道平滑肌細胞相互作用，是胃腸動力的起搏細胞。c-Kit是存在于ICC表面的受體之一，能反映ICC的數(shù)量和活性，其能與SCF通過細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成SCF/c-Kit信號通路，通過活化酪氨酸激酶，在調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，SCF/c-Kit信號通路的抑制與STC發(fā)病密切相關(guān)。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠胃排空率和小腸推進率下降，結(jié)腸組織ChAT、SCF、c-Kit 表達顯著降低，提示結(jié)腸組織ChAT表達和SCF/c-Kit信號通路與STC發(fā)生有關(guān)。電針“天樞”“大腸俞”干預后，大鼠胃排空率和小腸推進率明顯恢復，結(jié)腸組織ChAT、SCF、c-Kit表達顯著升高，表明電針可促進ChAT表達，恢復膽堿能神經(jīng)元功能，激活SCF/c-Kit信號通路，從而改善胃腸道傳輸功能。

綜上所述，電針天樞、大腸俞可能通過促進ChAT表達、激活SCF/c-Kit 信號通路，恢復腸神經(jīng)系統(tǒng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮治療便秘作用。