潘秋，閆玉冰，田聰陽，張志清，于彤，柴欣樓，楊然

1.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091；3.中國醫(yī)科大學航空總醫(yī)院，北京 100012；4.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京100053

高血脂引發(fā)的動脈粥樣硬化及冠心病等成為老年人致死的主要原因，膽固醇作為脂代謝過程的重要部分，被認為是疾病進展的重要影響因素，降膽固醇藥物的研究是當今醫(yī)學研究的熱點問題之一。迄今為止，批準上市的抑制膽固醇吸收藥物只有依折麥布，其與他汀類藥物聯(lián)合應用相比單一使用他汀類藥物可以更好地降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，但藥物聯(lián)用往往會增加肝功能損傷及肌痛等不良反應發(fā)生率。

降脂1號是本課題組從名老中醫(yī)郭維琴臨床經(jīng)驗方中提煉的處方，具有活血消食、祛濕健脾功效，臨床用于治療高膽固醇血癥，但其具體作用機制尚未明確。本實驗采用高脂乳劑誘導建立高脂血癥大鼠模型及Caco-2細胞脂質(zhì)蓄積模型，以小腸為切入點，從膽固醇攝取及排出2個環(huán)節(jié)探討其作用機制，為降脂1號的進一步開發(fā)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物及細胞

8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠48 只，體質(zhì)量（180±20）g，斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學清潔級動物房，（溫度22±2）℃、12 h明暗交替，自由進食飲水，使用許可證號SYXK（京）2019-0010。本實驗由北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批。人結(jié)直腸腺癌細胞Caco-2細胞株購自北京協(xié)和細胞資源中心。

1.2 藥物及制備

降脂1號顆粒由中日友好醫(yī)院制劑室提供，灌胃前用去離子水稀釋溶解；細胞實驗前用去離子水稀釋，并于超凈工作臺內(nèi)用0.22 μm濾膜過濾除菌分裝，-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。阿托伐他汀片，輝瑞制藥有限公司，批號20140326，20 mg/片，將藥片粉碎，使用蒸餾水溶解，制成濃度為1.05 mg/mL溶液。丙硫氧嘧啶片，國藥集團化學試劑有限公司，批號1021045，50 mg/片。依折麥布片，默沙東（中國）有限公司，批號20160181，10 mg/片。

1.3 主要試劑與儀器

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G5（ABCG5）兔多克隆抗體（美國Proteintech 公司，批號27722-1-AP），NPC1L1多克隆抗體（美國Thermo公司，批號PA1-16800），超敏二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號PV-9002），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號ZLI-9018），DAPI染色液（北京Solarbio，批號C0065）。120全自動生化分析儀（日本東芝），D-37520 高速離心機（德國Sigma），RM2235切片機（德國Leica），G1150H石蠟包埋機（德國Leica），CJT-E-Ⅱ超凈工作臺（北京市昌平長城空氣凈化設備公司）。

1.4 分組、造模及給藥

大鼠適應性喂養(yǎng)2周后開始實驗，48只大鼠隨機分為對照組、模型組、阿托伐他汀組和降脂1號低、中、高劑量組，每組8只。高脂乳劑按照課題組前期方法配制：豬油30 g、膽固醇5 g、蛋黃粉5 g、丙硫氧嘧啶0.5 g、吐溫-80 4 mL，加蒸餾水定容至100 mL，80 ℃水浴攪拌充分溶解形成高脂乳劑。對照組予蒸餾水灌胃，其余各組每日固定時間按2 mL/kg予高脂乳劑灌胃，共6周。造模第2周開始給藥，給藥劑量按人與大鼠體表面積進行計算，降脂1號低、中、高劑量組分別為0.37、1.1、3.3 g/kg（相當于臨床等效劑量的1/3、1、3倍），阿托伐他汀組為2.1 mg/kg，灌胃體積2 mL/kg，每日1次，連續(xù)6周。

1.5 取材

末次給藥結(jié)束后大鼠禁食不禁水12 h，稱量體質(zhì)量，10%水合氯醛腹腔注射（5 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，用于血脂及肝腎功能指標檢測。取小腸組織，預冷生理鹽水沖凈，迅速置于4%多聚甲醛中固定。

1.6 細胞培養(yǎng)與分組

Caco-2 細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞（約第5日），加入胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加完全培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)后調(diào)節(jié)細胞密度為1×10～1×10個/mL，將細胞懸液接種至12孔Transwell板，每孔接種細胞1×10個，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種后第1周隔日更換培養(yǎng)基，1周后每日更換培養(yǎng)基，至第21日細胞分化成熟，將細胞分為對照組、模型組、依折麥布組和降脂1號低、中、高濃度組。

1.7 細胞造模與給藥

對照組細胞用不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組細胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，依折麥布組和降脂1號低、中、高濃度組分別在模型組基礎上加入依折麥布和低、中、高濃度降脂1號同時處理24 h。根據(jù)CCK8預實驗結(jié)果，降脂1號低、中、高濃度分別為0.3、0.6、1.2 mg/mL，依折麥布濃度為50 μmol/L。

1.8 指標檢測

1.8.1 一般情況

每日觀察大鼠毛色、狀態(tài)，每周測量大鼠體質(zhì)量。

1.8.2 血脂及肝腎功能指標檢測

采用全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）水平，本實驗由北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院完成。

1.8.3 HE染色

將固定后的小腸組織從4%多聚甲醛中取出，蒸餾水沖洗過夜，脫水機梯度脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），常規(guī)HE染色，光鏡下觀察小腸組織病理變化。

1.8.4 免疫組化檢測

小腸組織石蠟切片脫蠟至水，微波爐加熱修復抗原，流水沖洗，10%山羊血清室溫孵育30 min，滴加ABCG5 一抗（1∶500）、NPC1L1 一抗（1∶100），37 ℃孵育1 h，滴加二抗，室溫孵育30 min，全自動封片機封片，光學顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達。應用ImageJ1.53e圖像分析軟件，根據(jù)陽性染色面積和強度計算平均光密度（MOD）。MOD＝積分光密度÷染色面積。

1.8.5 免疫熒光檢測

用6孔板制作細胞爬片，造模及加藥處理后，收集細胞，將Caco-2 細胞懸液滴至爬片上，放入37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，滴加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞完全貼滿爬片時，取出細胞爬片放入細胞培養(yǎng)皿，加入4%多聚甲醛室溫固定，分別滴加ABCG5 一抗（1∶200）、NPC1L1 一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜，滴加熒光二抗，室溫孵育1 h，DAPI復染，封片，共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。應用Image J 1.53e圖像分析軟件，計算平均熒光強度（累計熒光強度÷染色面積）。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 降脂1號對模型大鼠一般情況的影響

對照組大鼠毛色潔凈有光澤，行動靈活，精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量有所增加；模型組大鼠毛色干黃無澤，活動減少，形體逐漸消瘦；阿托伐他汀組大鼠形體更加消瘦；降脂1號低、中、高劑量組大鼠毛色黃而少澤，形體消瘦有所好轉(zhuǎn)。實驗過程中，因麻醉過量及灌胃不當，共有14只大鼠死亡。

2.2 降脂1號對模型大鼠血脂及肝腎功能指標的影響

血脂檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠TC、LDL-C水平明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組與降脂1號各劑量組大鼠TC、LDL-C水平明顯降低（＜0.05，＜0.01）。各組大鼠TG、HDL-C差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血脂水平比較（，mmol/L）

肝腎功能指標檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠ALT、BUN、SCr水平明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，降脂1號高劑量組大鼠ALT水平明顯降低（＜0.05），降脂1號中、高劑量組大鼠BUN水平明顯降低（＜0.01），阿托伐他汀組和降脂1號低、高劑量組大鼠SCr水平明顯降低（＜0.01）。各組大鼠AST差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝腎功能指標比較（）

2.3 降脂1號對模型大鼠小腸組織病理變化的影響

對照組大鼠小腸肌層完整，上皮隱窩及絨毛排列整齊，刷狀緣整齊；模型組大鼠小腸局部肌層較薄，相鄰絨毛融合，間隙變寬，排列疏松有缺失，部分腺體碎裂；阿托伐他汀組大鼠小腸相鄰絨毛融合變寬，排列疏松有缺失，部分腺體碎裂；降脂1號低、中劑量組大鼠小腸絨毛排列較模型組和阿托伐他汀組緊密、規(guī)則，絨毛高度有所恢復，相鄰絨毛融合較少；降脂1號高劑量組大鼠小腸相鄰絨毛部分融合，排列略疏松，部分上皮細胞脫落，部分腺體碎裂。見圖1。

圖1 各組大鼠小腸組織形態(tài)（HE染色，×20）

2.4 降脂1 號對模型大鼠小腸組織ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G5、NPC1L1表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠小腸組織ABCG5表達降低，NPC1L1表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）；與模型組比較，降脂1號低劑量組大鼠小腸組織NPC1L1表達明顯降低（＜0.05），降脂1號各劑量組大鼠小腸組織ABCG5表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。見圖2、圖3、表3。

表3 各組大鼠小腸組織ABCG5、NPC1L1蛋白表達比較［M（Q1，Q3），MOD］

圖2 各組大鼠小腸組織ABCG5陽性表達（免疫組化染色，×20）

圖3 各組大鼠小腸組織NPC1L1陽性表達（免疫組化染色，×20）

2.5 降脂1號對Caco-2細胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G5、NPC1L1蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞ABCG5、NPC1L1表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，降脂1號高濃度組細胞ABCG5表達明顯升高，NPC1L1表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01），見圖4、圖5、表4。

圖4 各組Caco-2細胞ABCG5陽性表達（免疫熒光染色，×20）

圖5 各組Caco-2細胞NPC1L1陽性表達（免疫熒光染色，×20）

表4 各組Caco-2細胞ABCG5、NPC1L1蛋白表達比較（，平均熒光強度）

3 討論

LDL-C和TC水平升高是動脈粥樣硬化性心血管疾病重要的危險因素。中藥復方可以通過多組分、多靶點、多通路干預血脂代謝，從而實現(xiàn)安全有效調(diào)脂的目的。本課題組以小腸膽固醇代謝為切入點，發(fā)現(xiàn)降脂1號可有效降低高脂血癥大鼠血脂水平，并且具有良好的肝腎保護作用，可明顯改善小腸病變程度，恢復小腸吸收、排出膽固醇平衡，從而達到有效降脂的目的。

本實驗過程中模型組及給藥組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，丙硫氧嘧啶可明顯減少大鼠進食量和體質(zhì)量，灌胃高脂乳劑后進食量進一步減少，而體質(zhì)量可小幅回升。有報道，給予大鼠0.2%丙硫氧嘧啶灌胃可導致LDL-C、TC、TG、HDL-C水平升高，與本實驗結(jié)果不完全一致，考慮可能是本實驗配制的丙硫氧嘧啶濃度偏高，對甲狀腺抑制作用更明顯，大鼠進食及消化功能明顯趨緩，脂質(zhì)代謝受到影響，TG水平不升反降。本實驗發(fā)現(xiàn)，降脂1號各劑量組大鼠體質(zhì)量可緩慢增加，推測可能與降脂1號緩解丙硫氧嘧啶所致大鼠甲狀腺功能減退有關。

小腸在脂類代謝過程中與肝臟協(xié)同分工發(fā)揮作用。HE染色發(fā)現(xiàn)，模型大鼠小腸組織明顯損傷，小腸相鄰絨毛融合，間隙變寬，排列疏松，部分腺體碎裂。降脂1號可顯著改善小腸病理形態(tài)，為發(fā)揮降脂作用提供必要的結(jié)構(gòu)基礎。

NPC1L1在多個組織中廣泛表達，尤其在肝臟和小腸中高表達。NPC1L1能促進小腸上皮細胞攝取膽固醇，當細胞內(nèi)膽固醇含量降低時，NPC1L1將移動至細胞膜側(cè)，參與胞外膽固醇攝取進入細胞。動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降脂1號能降低模型大鼠小腸組織NPC1L1蛋白表達，其中低劑量組效果最明顯，說明減少小腸吸收膽固醇是降脂1號發(fā)揮降脂作用的重要環(huán)節(jié)之一。ABCG5/G8 屬于ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白半轉(zhuǎn)運體，ABCG5/G8結(jié)合成異二聚體，其主要功能是將被攝取進入小腸上皮細胞的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運回腸腔。本實驗中，雖然各組大鼠小腸組織ABCG5蛋白表達無明顯差異，但降脂1號各劑量組ABCG5蛋白表達均有升高趨勢，其中低劑量組最明顯，提示降脂1號可促進小腸排出膽固醇，降低血脂水平。在細胞實驗中，降脂1號高濃度組細胞ABCG5表達明顯降低，與動物實驗結(jié)果不一致。我們認為，這可能與大鼠實驗采用丙硫氧嘧啶灌胃有關。研究表明，臨床或亞臨床甲狀腺功能減退可顯著改變血脂水平，多數(shù)高脂血癥患者伴有甲狀腺功能障礙。提示甲狀腺功能減退可能影響大鼠腸道膽固醇代謝功能，進而導致膽固醇流出受損。

經(jīng)腸膽固醇排泄（TICE）是小腸的另一種外排機制，即膽固醇由血直接經(jīng)腸道分泌和排出體外。有研究表明，依折麥布誘導的TICE大多由ABCG5/G8介導，TICE在人體中很活躍，可能是刺激心血管疾病風險患者消除膽固醇的新靶點。課題組前期預實驗發(fā)現(xiàn)，肝臟在膽固醇攝取及流出方面亦發(fā)揮積極作用，本實驗中各給藥組大鼠血清膽固醇水平明顯下降，我們推測肝臟在調(diào)節(jié)膽固醇代謝方面的正向作用減輕了腸道ABCG5/G8外排膽固醇的負擔，但需進一步實驗驗證。

綜上所述，降脂1號能夠降低高脂血癥大鼠血脂水平，低劑量用藥即可減輕小腸病理損傷，推測其機制可能與抑制小腸膽固醇吸收、促進小腸膽固醇排出有關，其內(nèi)在的相互作用機制有待進一步研究。本研究為指導臨床用藥及藥物進一步開發(fā)提供了實驗依據(jù)。