韓遠山，李萍，王宇紅，李姿蓉，鄒蔓姝，李春艷，牟晴蕊

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙410208

抑郁癥是一類以持續(xù)情緒低落、思維遲緩、意志力減退為臨床表現(xiàn)的精神類疾病，為發(fā)作性疾病，可單次或反復(fù)發(fā)作。據(jù)統(tǒng)計，抑郁癥在中國的患病率約為3.02%，是全球疾病負擔(dān)的主要原因之一，預(yù)計在2030年將上升至世界疾病負擔(dān)首位。研究表明，海馬突觸可塑性改變與抑郁癥密切相關(guān)，其中膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）和樹突棘素（Spinophilin）對于調(diào)控海馬突觸可塑性意義重大。課題組前期研究顯示，復(fù)方柴金解郁片治療抑郁癥肝郁脾虛證效果肯定，不良反應(yīng)少，安全性較高。藥理研究表明，復(fù)方柴金解郁片通過降低海馬神經(jīng)元突觸素-α和突觸素后致密物-95蛋白和mRNA表達、減少炎癥因子分泌，促進海馬神經(jīng)元突觸損傷修復(fù)，發(fā)揮抗抑郁作用。本研究采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)建立抑郁大鼠模型，觀察復(fù)方柴金解郁片對模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響，進一步明確其作用機制，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號1107272011006598，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心，使用許可證號SYXK（湘）2019-0009，室溫（24±2）℃，相對濕度（50±5）%，光暗周期12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物

復(fù)方柴金解郁片浸膏（柴胡、貫葉金絲桃、姜黃、紫蘇葉、白芍、知母），湖南中醫(yī)藥研究院提供，每克浸膏相當(dāng)于3.92 g原藥材，臨用前用蒸餾水稀釋成濃度分別為1.134、0.567、0.284 g/mL。鹽酸文拉法辛緩釋膠囊，蘇州惠氏制藥有限公司，75 mg/粒，批號T37944D，臨用前用蒸餾水配制成濃度為1.35 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

GDNF抗體，英國Abcam公司，批號GR279460-6；Spinophilin抗體，江蘇親科生物科技有限公司，批號76m9086；GAPDH 抗體，北京博奧森，批號BJ09 211758；BCA蛋白定量檢測試劑盒、凝膠制備試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為G2026、G2003、GB23303。YLS-9A電子刺激儀，濟南益延科技有限公司；JJ-12J脫水機、JB-P5包埋機、JB-L5凍臺，武漢俊杰電子有限公司；RM2016 病理切片機，上海徠卡；Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡、DS-U3成像系統(tǒng)，日本尼康公司；RT-6100酶標(biāo)儀，美國Rayto公司；WGXYQ0004封口機，武漢賽維爾生物科技有限公司；6300化學(xué)發(fā)光儀，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；CRYOSTAR NX50 冰凍切片機，美國Thermo 公司；Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀，匈牙利3DHistech公司。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進行糖水消耗實驗。將糖水消耗量接近的60只大鼠隨機分為空白組、模型組、文拉法辛組和復(fù)方柴金解郁片高、中、低劑量組，每組10 只。除空白組外，其余各組大鼠均單籠飼養(yǎng)，采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激復(fù)制抑郁模型，應(yīng)激因素包括：電擊1 min，夾尾1 min，4 ℃冰水浴4 min，晝夜顛倒24 h＋潮濕墊料，禁食24 h，禁水24 h，傾籠45°24 h＋噪音4 h，每種應(yīng)激方式3 d 內(nèi)不重復(fù)出現(xiàn)。造模同時，文拉法辛組按13.5 mg/kg灌胃給藥，復(fù)方柴金解郁片高、中、低劑量組按11.34、5.67、2.84 g/kg 灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積10 mL/kg，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)42 d。

2.2 行為學(xué)實驗

2.2.1 糖水消耗實驗

第28日和第42日灌胃1 h后進行糖水消耗實驗，每次糖水消耗實驗持續(xù)4 d。實驗第1日，單籠左右兩側(cè)均放置1%糖水瓶；第2日上午將左側(cè)換為蒸餾水瓶，下午將左右兩側(cè)水瓶交換位置；第3日禁水24 h；第4日稱量兩水瓶質(zhì)量，左側(cè)放置糖水瓶，右側(cè)放置蒸餾水瓶，30 min后將兩水瓶位置互換，計時30 min，將兩水瓶取下，稱重，計算1 h 內(nèi)大鼠糖水偏好度。糖水偏好度（%）＝糖水?dāng)z入量÷（糖水?dāng)z入量＋蒸餾水?dāng)z入量）×100%。

2.2.2 曠場實驗

第28 日和第42 日，將曠場箱（80 cm×80 cm×40 cm）底面劃分為5×5的小方格，將大鼠從曠場箱中心放入，適應(yīng)30 s后，觀察記錄大鼠4 min內(nèi)水平活動次數(shù)（三爪進入方格）和垂直活動次數(shù)（兩前肢騰空或攀爬箱壁），水平活動次數(shù)和垂直活動次數(shù)總和為總活動次數(shù)。

2.2.3 強迫游泳實驗

第28日和第42日，采用直徑20 cm、高50 cm的透明圓柱形水缸，裝入適量常溫水，將大鼠頭部朝下放入水缸中，適應(yīng)30 s后，觀察并記錄大鼠4 min內(nèi)游泳不動時間（大鼠漂浮在水面，四肢沒有明顯活動或有輕微活動，僅為保持頭露出水面，而沒有水平位移）。

2.3 取材

第42日行為學(xué)實驗結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，各組取6只大鼠，腹主動脈取血，冰盒上剝離全腦后分離海馬，置于液氮中保存?zhèn)溆?。剩?只大鼠先后心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛溶液，待大鼠四肢僵硬后取全腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，室溫保存。

2.4 HE染色

將海馬組織修復(fù)平整后脫水浸蠟，包埋，切片（4 μm）；將切片依次放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、75%酒精5 min，自來水洗；常規(guī)HE染色，脫水封片后顯微鏡下觀察。

2.5 高爾基染色

取固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織，沿冠狀面切取交叉視神經(jīng)根部與腦四疊體之間部分，切成2～3 mm組織塊，生理鹽水漂洗，高爾基染液將腦組織完全浸沒，避光處理14 d；蒸餾水浸洗3次，80%冰醋酸浸泡過夜，待組織變軟后蒸餾水浸洗，置于30%蔗糖溶液中，低溫避光脫水2 d；將組織切成100 μm薄片，貼于明膠玻片上，避光晾干，濃氨水處理15 min，蒸餾水洗1 min，酸性堅膜定影液處理15 min，蒸餾水洗3 min，晾干，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察。

2.6 Western blot檢測

取適量海馬組織，加入裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度；加入適量上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min使蛋白變性；根據(jù)蛋白分子量對應(yīng)范圍配制分離膠，上樣，60 V電泳至濃縮膠與分離膠分界處，80 V電泳至溴酚蘭到達分離膠底部；轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，加入GDNF、Spinophilin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后，滴加二抗（1∶5 000），室溫孵育30～60 min；TBST洗膜，ECL法顯色，使用Image J 軟件測量各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方柴金解郁片對模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠第28、42日糖水偏好度顯著降低，總活動次數(shù)減少，游泳不動時間顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，文拉法辛組大鼠第28、42日糖水偏好度顯著升高，總活動次數(shù)顯著增加，第42日游泳不動時間顯著減少，復(fù)方柴金解郁片高劑量組大鼠第28日糖水偏好度顯著升高，總活動次數(shù)顯著增加，游泳不動時間顯著減少，復(fù)方柴金解郁片中、低劑量組大鼠第42日糖水偏好度顯著升高，總活動次數(shù)顯著增加，游泳不動時間顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)比較（）

3.2 復(fù)方柴金解郁片對模型大鼠海馬組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠海馬錐體細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊密集，胞核大而圓，核仁清晰，細胞質(zhì)豐富，未見明顯炎性改變；模型組大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)錐體細胞胞核固縮，形狀不規(guī)則，出現(xiàn)炎癥改變；文拉法辛組和復(fù)方柴金解郁片高、中、低劑量組大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)可見少量海馬錐體細胞胞核固縮，未見明顯炎癥改變，病變范圍較模型組減少。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織形態(tài)（HE染色，×400）

3.3 復(fù)方柴金解郁片對模型大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷的影響

空白組大鼠海馬神經(jīng)元較多，樹突較長且分支豐富；模型組大鼠海馬CA1、DG區(qū)部分神經(jīng)元消失，樹突分散、排列疏松或纏攪，樹突棘數(shù)量減少或缺失，以海馬DG區(qū)損傷最顯著；文拉法辛組和復(fù)方柴金解郁片高、中、低劑量組大鼠海馬神經(jīng)元突觸損傷有所改善，樹突棘和樹突分支數(shù)量增加。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬樹突棘形態(tài)（高爾基染色，×400）

3.4 復(fù)方柴金解郁片對模型大鼠海馬組織膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和樹突棘素蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬組織GDNF、Spinophilin 蛋白表達顯著降低（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，文拉法辛組和復(fù)方柴金解郁片中、低劑量組大鼠海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白表達顯著升高（＜0.05，＜0.01），復(fù)方柴金解郁片高劑量組大鼠海馬組織GDNF蛋白表達顯著升高（＜0.01）。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白免疫印跡

表2 各組大鼠海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白表達比較（）

4 討論

抑郁癥機制目前廣泛認可的有炎癥反應(yīng)學(xué)說、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其受體學(xué)說、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能失調(diào)學(xué)說、神經(jīng)營養(yǎng)因子學(xué)說等，多種因素通過不同信號途徑、生理病理過程相互作用，最終導(dǎo)致突觸數(shù)量減少和功能損傷，以致發(fā)生抑郁。海馬與學(xué)習(xí)、記憶、行為和情緒密切相關(guān)，是抑郁癥研究的關(guān)鍵靶器官。前期研究表明，復(fù)方柴金解郁片對抑郁大鼠海馬神經(jīng)元突觸功能及結(jié)構(gòu)損傷具有改善作用。本實驗通過行為學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)檢測方法，探討該方對抑郁大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷及海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白表達的影響。

GDNF 來源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是一種在體內(nèi)廣泛表達的多效能神經(jīng)營養(yǎng)因子，對受損神經(jīng)元具有修復(fù)、保護作用，能促進神經(jīng)元存活、神經(jīng)祖細胞分化及突觸形成。有研究顯示，GDNF 及其受體在海馬和前額葉皮質(zhì)呈高表達，GDNF 基因敲除小鼠表現(xiàn)為海馬突觸傳遞功能異常，水迷宮學(xué)習(xí)能力明顯受損。樹突棘位于興奮性突觸后膜，其形態(tài)、數(shù)量變化對突觸可塑性有直接影響。Spinophilin 是一種表達于樹突棘內(nèi)的神經(jīng)支架蛋白，參與樹突棘可塑性調(diào)節(jié)，與樹突棘形態(tài)、數(shù)目及興奮性突觸的傳遞密切相關(guān)，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用。Spinophilin 基因敲除大鼠雖然有完整的感覺信息加工傳遞過程，但是聯(lián)想學(xué)習(xí)能力、厭惡型條件反射學(xué)習(xí)能力與野生型大鼠相比明顯受損，表明Spinophilin 對學(xué)習(xí)認知過程具有重要影響。本研究顯示，與空白組比較，模型組大鼠海馬組織樹突棘和樹突分支數(shù)量減少，突觸形態(tài)損傷，GDNF、Spinophilin蛋白表達顯著降低；與模型組比較，復(fù)方柴金解郁片各劑量組大鼠海馬組織樹突棘和樹突分支數(shù)量增加，突觸損傷有所改善，GDNF、Spinophilin蛋白表達顯著升高，表明復(fù)方柴金解郁片能一定程度上修復(fù)海馬神經(jīng)元突觸損傷，改善神經(jīng)元突觸可塑性。然而，高劑量組作用較中、低劑量組弱，可能是由于高劑量藥物會產(chǎn)生更高濃度的代謝副產(chǎn)物，與藥效成分產(chǎn)生競爭性抑制作用，具體機制有待進一步研究。

抑郁癥可屬中醫(yī)學(xué)“郁證”“百合病”等范疇。復(fù)方柴金解郁片以柴胡為君，疏肝解郁；臣以貫葉金絲桃、姜黃，助君藥疏肝解郁；佐以紫蘇葉、白芍、知母理氣解郁、養(yǎng)血柔肝、滋陰除煩。全方共奏疏肝理氣、活血解郁之效。

綜上，復(fù)方柴金解郁片能改善抑郁模型大鼠抑郁癥狀，修復(fù)海馬神經(jīng)元損傷，增加樹突棘和樹突分支數(shù)量，上調(diào)海馬組織GDNF、Spinophilin蛋白表達，進而調(diào)控海馬神經(jīng)元突觸可塑性，發(fā)揮抗抑郁作用。本研究初步揭示了復(fù)方柴金解郁片抗抑郁的作用機制，可為該方的進一步研究奠定基礎(chǔ)。