楊觀健，汪志文，黎 源，李炳喜，魯義善

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/2.廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學(xué)深圳研究院/4.廣東省水生動(dòng)物健康評(píng)估工程技術(shù)研究中心/5.深圳市海水經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種苗健康評(píng)價(jià)公共技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，廣東 深圳 518120）

清道夫受體（scavenger receptors，SRs）是由一類結(jié)構(gòu)各異功能多樣的糖蛋白組成的蛋白質(zhì)家族，屬于先天性免疫模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），主要分布于吞噬細(xì)胞表面，具有抗原識(shí)別、吞噬、內(nèi)毒素清除、細(xì)胞黏附和細(xì)胞活性調(diào)節(jié)等多種功能[1-4]。而膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細(xì)胞受體（macrophage receptor with collagenous structure，Marco）是清道夫受體家族的重要成員，最早是由Elomaa 等[5]于1995 年在小鼠中發(fā)現(xiàn)并命名，屬于A類第6 號(hào)成員，因此又被稱為SR-A6[6]。從結(jié)構(gòu)上看，Marco包含一個(gè)短的胞內(nèi)部分、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)由間隔結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)的膠原樣結(jié)構(gòu)域與C 端富半胱氨酸受體結(jié)構(gòu)域（scavenger receptor cystein-rich，SRCR）組成的胞外部分，直接或間接參與機(jī)體的防御功能[7-8]。研究表明，Marco是一個(gè)多功能分子，具有廣泛的配體結(jié)合特性，參與內(nèi)吞作用、細(xì)胞黏附、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多生物學(xué)過(guò)程，并參與聚陰離子粒子的結(jié)合與攝取[9-10]，在吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的先天性免疫應(yīng)答中起著重要作用。關(guān)于marco基因的研究主要聚焦在智人（Homo sapiens）[11]、小鼠（Mus musculus）[12]和豬（Sus scrofa）[13]等哺乳動(dòng)物上，在鳥(niǎo)類[14]中也有報(bào)道。然而，有關(guān)魚(yú)類marco基因的研究，特別是它的功能方面的研究較少。目前，在大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）[15]、斑馬魚(yú)（Daniorerio）[16]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[17]和香魚(yú)（Plecoglossus altivelis）[18]中鑒定出Marco同源物，并闡明marco基因在這些魚(yú)類中的表達(dá)模式。迄今為止，marco基因在尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）上的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

羅非魚(yú)原產(chǎn)于非洲，因其具有富含蛋白、肉質(zhì)鮮美、價(jià)格低和易養(yǎng)高產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[19-20]，成為聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織重點(diǎn)推薦的優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)全球養(yǎng)殖羅非魚(yú)產(chǎn)量持續(xù)增長(zhǎng)，2020 年我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)165.54 萬(wàn)t[21]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境惡化，以鏈球菌病為主的羅非魚(yú)病害頻繁發(fā)生，對(duì)該產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[22-24]。目前，針對(duì)羅非魚(yú)抗菌免疫的研究逐漸成為熱點(diǎn)。鑒于marco基因在先天性免疫中能夠發(fā)揮識(shí)別和結(jié)合病原體、清除內(nèi)毒素等重要作用，研究尼羅羅非魚(yú)marco基因（Onmarco）的生物學(xué)特征和調(diào)節(jié)機(jī)制是必要的。在本研究中，從尼羅羅非魚(yú)中克隆獲得marco基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析，以期為闡明marco基因在羅非魚(yú)抗感染免疫應(yīng)答中的作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú) 實(shí)驗(yàn)所用尼羅羅非魚(yú)購(gòu)自廣東省湛江市東風(fēng)市場(chǎng)，規(guī)格為（100 ± 10）g/尾，在水溫28 ℃條件下暫養(yǎng)4周備用。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 RNAlaterTMStabilization Solution、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit）、LipofectaminTM3000 Transfection Reagent、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清FBS 和胰酶Trypsin 購(gòu)自Thermo 公司；RNA 提取試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit）、平末端克隆試劑盒（pEASY?-Blunt Cloning Kit）和qPCR 試劑盒（TransStart?Green qPCR SuperMix）購(gòu)自北京全式金公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Reverse Transcriptase M-MLV）、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 和EcoRI、BamHI 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa 公司（大連）；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（E.Z.N.A.?Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit Ⅱ）購(gòu)自O(shè)mega 公司；聚肌胞苷酸（Poly I:C）、脂多糖（LPS）購(gòu)自Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、40 mg/mL 多聚甲醛、抗熒光猝滅封片劑、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)自碧云天公司；Percoll 細(xì)胞分離液購(gòu)自Solarbio 公司；pDsRed-Monomer-N1質(zhì)粒、無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）菌種ZQ0910 和人胚腎細(xì)胞HEK-293T來(lái)自廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；引物由生工生物工程公司（廣州）合成。

組織研磨器（TissueLyser II）購(gòu)自Qigen公司，超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Nanodrop 2000）和高速離心機(jī)（Sorvall Legend Micro 21）購(gòu)自Thermo 公司，PCR 儀（T100）購(gòu)自BioRad 公司，凝膠電泳系統(tǒng)（BG-Power 600）購(gòu)自Baygene 公司，凝膠成像儀（Tanon 4100）購(gòu)自上海天能科技有限公司，振蕩培養(yǎng)箱（PY-3-3）購(gòu)自蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，激光共聚焦顯微鏡（ZEISS LSM 710）購(gòu)自蔡司公司，熒光定量PCR儀（Light Cycler 96）購(gòu)自上海羅氏公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)引物 實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 The primers in this experiment

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)組織預(yù)處理 撈取暫養(yǎng)的健康尼羅羅非魚(yú)6 尾，收集血液（blood，BL）、皮膚（skin，Sk）、鰓（gill，Gi）、肌肉（muscle，M）、腦（brain，Br）、頭腎（head kidney，HK）、脾臟（spleen，Sp）、肝臟（liver，Li）、胸腺（thymus，Th）和腸道（intestine，In）等10 個(gè)組織各10～20 mg，放入RNAlater 后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

攻毒實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射方式，實(shí)驗(yàn)組分別注射1×107cfu/mL 的無(wú)乳鏈球菌0.1 mL 和0.2 mg/mL 的聚肌胞苷酸（Poly I:C）0.1 mL，對(duì)照組注射等量的磷酸鹽緩沖液（PBS），在感染后0、6、12、24、48、72 和96 h 等7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取尼羅羅非魚(yú)6 尾，收集腸道、頭腎和脾臟等3個(gè)組織，迅速放入裝有RNAlater的無(wú)RNA酶離心管，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

選擇規(guī)格較大的健康尼羅羅非魚(yú)，剖取頭腎組織，用Percoll 分離法分離頭腎白細(xì)胞后，分為4 組，分別用終濃度均為5 μg/mL 的無(wú)乳鏈球菌、脂多糖（LPS）和Poly I:C 進(jìn)行刺激，并用等量PBS 作對(duì)照；分別在0、6、12、24和48 h收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5 mL無(wú)RNA 酶離心管，離心后棄上清；加入1 mL Trizol UP混勻后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA 的提取及cDNA 的合成 取出冷凍保存的組織樣品，參照TransZol Up Plus RNA Kit 說(shuō)明書(shū)提取總RNA，再參照Reverse Transcriptase MMLV說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3Onmarco基因克隆 根據(jù)課題組前期獲得的尼羅羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)克隆引物Onmarco-1F 和Onmarco-1071R（表1），以尼羅羅非魚(yú)脾臟cDNA 為模板，對(duì)Onmarco基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 10 μL，ddH2O 7.5 μL，cDNA 模板0.5 μL，Onmarco-1F 1 μL，Onmarco-1071R 1 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃10 s，55 ℃15 s，72 ℃90 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃5min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物先經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后純化回收，與pEASY?-Blunt Cloning Vector連接，并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR 鑒定，并將陽(yáng)性單克隆送至生工生物工程公司（廣州）測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果通過(guò)SeqMan 軟件進(jìn)行拼接，獲得Onmarco基因序列。經(jīng)NCBI BLAST 比對(duì)確定，利用NCBI ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）并推導(dǎo)氨基酸序列，然后分別用ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列的理化性質(zhì)，用ExPASy-ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析親疏水性，用SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽，用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，用NCBI Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域，用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)并用PyMOL 軟件分析空間結(jié)構(gòu)，用ClustalX 2.1 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA X 軟件基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）自展（bootstrap）1 000 次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 亞細(xì)胞定位 構(gòu)建pDsRed-OnMarco 真核表達(dá)載體，限制性酶切位點(diǎn)為EcoRI和BamHI，然后參照E.Z.N.A.?Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit Ⅱ說(shuō)明書(shū)提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。

將HEK-293T細(xì)胞接種到24孔板（孔直徑15.6 mm）培養(yǎng)18 h 后，參照LipofectaminTM3000 Transfection Reagent 說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pDsRed-Monomer-N1 和重組質(zhì)粒pDsRed-OnMarco，孵育48 h 后，用胰酶消化，然后重懸吸取部分細(xì)胞于處理后的蓋玻片上，繼續(xù)孵育6 h。孵育結(jié)束后，先用PBS 洗滌2 次，用40 mg/mL 多聚甲醛固定，再滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）進(jìn)行細(xì)胞核染色，最后用PBS洗滌2次，加入抗熒光猝滅封片劑封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.6Onmarco基因表達(dá)分析 根據(jù)Onmarco基因序列的保守區(qū)域，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)qPCR引物qRT-Onmarco-427F、qRT-Onmarco-597R（表1），用β-actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。使用Light Cycler 96熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR，分析marco基因在健康尼羅羅非魚(yú)各組織的特異性分布、經(jīng)無(wú)乳鏈球菌和Poly I:C 感染的組織表達(dá)情況以及不同刺激物刺激頭腎白細(xì)胞后的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：Green qPCR SuperMix 5 μL，ddH2O 4.3 μL，cDNA 模 板0.3 μL，qRT-Onmarco-427F 0.2 μL，qRT-Onmarco-597R 0.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃10 s，60 ℃60 s，95 ℃1 s；37 ℃10 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算，用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Onmarco基因克隆及序列分析

實(shí)驗(yàn)克隆獲得Onmarco基因序列（GenBank 登錄號(hào)：MZ352749），開(kāi)放閱讀框（ORF）為1 071 bp，共編碼356個(gè)氨基酸（圖1）；預(yù)測(cè)的編碼蛋白的理論分子質(zhì)量為38.47 ku，理論等電點(diǎn)（PI）為6.14，脂肪指數(shù)（Aliphatic index）為67.58，不穩(wěn)定指數(shù)為24.81，總體平均親水性（GRAVY）為-0.735；不存在信號(hào)肽。用ExPASy-ProtScale 進(jìn)一步分析其親疏水性，親水區(qū)域占比大（圖2）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在推導(dǎo)的OnMarco 氨基酸序列中存在跨膜結(jié)構(gòu)域、膠原樣結(jié)構(gòu)域和SR（即SRCR）結(jié)構(gòu)域，其胞外區(qū)（第72～356位氨基酸）占80%（圖3、4）。

圖1 Onmarco基因ORF序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Open reading frame and deduced amino acid sequences of Onmarco gene

圖2 OnMarco親疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Hydrophobicity prediction of OnMarco

圖3 OnMarco跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of transmembrane domain of OnMarco

圖4 OnMarco保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.4 Conserved domain prediction of OnMarco

2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，OnMarco 中的無(wú)規(guī)則卷曲由205 個(gè)氨基酸組成，占57.58%；α-螺旋由78個(gè)氨基酸組成，占21.91%；β-折疊結(jié)構(gòu)由12 個(gè)氨基酸組成，占3.37%；延伸鏈由61 個(gè)氨基酸組成，占17.13%（圖5）。

圖5 OnMarco二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of OnMarco

利用SWISS-MODLE 對(duì)OnMarco 進(jìn)行同源建模，然后使用PyMOL 進(jìn)行3D 結(jié)構(gòu)可視化，并和小鼠Marco 三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)OnMarco 與哺乳動(dòng)物Marco三級(jí)結(jié)構(gòu)相似（圖6）。

圖6 OnMarco（A）與小鼠Marco（B）三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Three-dimensional structures of Marco in O.niloticus(A)and Mus musculus(B)

2.3 同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

多序列比對(duì)結(jié)果顯示，OnMarco 與奧利亞羅非魚(yú)（Oreochromis aureus）的相似度最高，為99.44%；與斑馬擬麗魚(yú)（Maylandia zebra）、眼斑雙鋸魚(yú)（Amphiprion ocellaris）、小鼠（Mus musculus）、人（Homo sapiens）的相似度分別是94.10%、60.80%、42.79%、43.87%（圖7）。

基于NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，爬行類、鳥(niǎo)類和哺乳類聚為一簇，硬骨魚(yú)類單獨(dú)聚為一簇，其中尼羅羅非魚(yú)與奧利亞羅非魚(yú)聚為一支（圖8）。

圖8 基于NJ法構(gòu)建Marco系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of Marco based on Neighbor-Joining method

2.4 亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HEK-293T 細(xì)胞的全細(xì)胞中都有紅色熒光分布，細(xì)胞膜上的熒光信號(hào)較強(qiáng)（圖9）。

圖9 OnMarco在HEK-293T細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.9 Subcellular localization of OnMarco in HEK-293T cells

2.5 Onmarco基因的組織特異性分布

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)健康尼羅羅非魚(yú)Onmarco基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Onmarco基因在各個(gè)組織中都能廣泛表達(dá)，但在血液組織中表達(dá)量最高，其次為肌肉、腸道、脾臟、肝臟、腦和胸腺，在皮膚、頭腎和鰓中表達(dá)量較低（圖10）。

圖10 Onmarco基因在不同組織中的表達(dá)情況Fig.10 Expression analysis of Onmarco in different tissues

2.6 Onmarco 基因在無(wú)乳鏈球菌和Poly I:C 刺激后的時(shí)序表達(dá)

滅活的無(wú)乳鏈球菌和Poly I:C 感染尼羅羅非魚(yú)后，定量分析檢測(cè)羅非魚(yú)腸道、頭腎和脾臟3個(gè)組織中Onmarco基因的時(shí)序表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)無(wú)乳鏈球菌刺激后，Onmarco基因表達(dá)量在腸道中48 h達(dá)到峰值，其余時(shí)間表達(dá)量較低（圖11(A)）；在頭腎和脾臟中的表達(dá)模式類似，表現(xiàn)出交替的起伏波動(dòng)（圖11(B，C)）。經(jīng)病毒類似物Poly I:C 刺激后，Onmarco基因表達(dá)量在腸道和頭腎中48 h 達(dá)到峰值（圖12(A，B)）；在脾臟中在24 h 出現(xiàn)表達(dá)高峰（圖12(C)）。

圖11 滅活無(wú)乳鏈球菌刺激后Onmarco基因在3個(gè)組織中的時(shí)序表達(dá)Fig.11 Expression analysis of Onmarco in three tissues after S.agalactiae infection

圖12 Poly I:C刺激后Onmarco基因在3個(gè)組織中的時(shí)序表達(dá)Fig.12 Expression analysis of Onmarco in three tissues after Poly I:C infection

2.7 Onmarco基因在不同刺激物刺激頭腎白細(xì)胞后的表達(dá)模式

用Percoll 分離法分離獲得羅非魚(yú)頭腎白細(xì)胞，用LPS、Poly I:C 和滅活后的無(wú)乳鏈球菌孵育細(xì)胞，然后檢測(cè)0、6，12，24 和48 h 等5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)Onmarco基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在LPS 刺激下Onmarco基因表達(dá)量在6 h 達(dá)到峰值（圖13(A)）；在Poly I:C刺激下Onmarco基因表達(dá)量在12 h顯著升高，在24 h下降，在48 h又顯著升高（圖13(B)）；在滅活的無(wú)乳鏈球菌刺激下Onmarco基因表達(dá)量逐漸升高，在48 h達(dá)到峰值（圖13(C)）。

圖13 不同刺激物孵育尼羅羅非魚(yú)頭腎白細(xì)胞后Onmarco基因的表達(dá)Fig.13 Expression of Onmarco in head kidney leukocyte of immunized O.niloticus

3 討論

本研究克隆得到的尼羅羅非魚(yú)marco基因的ORF為1 071 bp，共編碼356個(gè)氨基酸。多序列比對(duì)結(jié)果表明，Marco 蛋白序列和結(jié)構(gòu)域在魚(yú)類中是保守的，OnMarco 與奧利亞羅非魚(yú)的相似度最高（99.44%）；分子系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，尼羅羅非魚(yú)與奧利亞羅非魚(yú)親緣關(guān)系最近，聚為一支。與其他生物Marco類似，OnMarco由一個(gè)短的胞內(nèi)段、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)長(zhǎng)的胞外段組成，胞外段具有膠原樣結(jié)構(gòu)域（第194～251位氨基酸）和SR結(jié)構(gòu)域（第261～355 位氨基酸）。與哺乳動(dòng)物不同的是，OnMarco 僅有一個(gè)膠原樣結(jié)構(gòu)域，這與大黃魚(yú)的結(jié)果一致[15]，表明Marco 在物種進(jìn)化上出現(xiàn)了差異，膠原樣結(jié)構(gòu)域的數(shù)量可能會(huì)影響免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。SR 結(jié)構(gòu)域是SR-A家族成員的典型結(jié)構(gòu)域，在結(jié)合配體時(shí)起到關(guān)鍵作用[9]，對(duì)隨后的免疫反應(yīng)至關(guān)重要。研究表明，在敲除人和小鼠marco基因的SR 結(jié)構(gòu)域后，它無(wú)法正確識(shí)別和結(jié)合相應(yīng)的配體[25]。Novakowski 等[7]認(rèn)為marco基因的SR 結(jié)構(gòu)域還有助于加強(qiáng)吞噬作用，識(shí)別病原體，保護(hù)生物免受損害。因此，OnMarco具備的SR 結(jié)構(gòu)域是其參與機(jī)體免疫活動(dòng)，防御病原體入侵的前提。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HEK-293T 細(xì)胞的全細(xì)胞中都有紅色熒光分布，說(shuō)明OnMarco 為全細(xì)胞分布；細(xì)胞膜上的熒光信號(hào)較強(qiáng)，說(shuō)明OnMarco主要在細(xì)胞膜上表達(dá)。

基因的組織和病理相關(guān)表達(dá)模式通常與它們的功能有關(guān)。有報(bào)道稱小鼠marco基因主要在脾臟中表達(dá)[26]，人類marco基因主要表達(dá)于肺、肝臟和淋巴結(jié)[27]。在本研究中，Onmarco基因在健康尼羅羅非魚(yú)各組織中廣泛表達(dá)，在血液中表達(dá)量最高，與香魚(yú)（Plecoglossusaltivelis）中的表達(dá)特征類似[18]。marco基因在魚(yú)類和哺乳動(dòng)物中的表達(dá)特征存在差異，可能是marco基因的表達(dá)存在物種特異性。血液是魚(yú)體的重要免疫場(chǎng)所，富含吞噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，在魚(yú)類免疫中具有重要的作用，其中白細(xì)胞能夠直接參與免疫應(yīng)答過(guò)程[28-30]，Onmarco基因在血液中出現(xiàn)高表達(dá)量，推測(cè)其參與了羅非魚(yú)對(duì)病原體感染的免疫應(yīng)答。

無(wú)乳鏈球菌感染后，Onmarco基因在腸道、頭腎和脾臟3個(gè)組織中的表達(dá)水平均有顯著上調(diào)。腸道是機(jī)體最大的黏膜免疫器官，屬于外周淋巴器官，是抵御病原體感染的重要防線，能夠識(shí)別清除入侵的細(xì)菌[31]。頭腎和脾臟是魚(yú)類各類血細(xì)胞發(fā)生的主要器官，是無(wú)乳鏈球菌攻擊的主要靶器官[32-33]，所以在腸道中，Onmarco基因在48 h 上調(diào)表達(dá)，而在頭腎和脾臟中6 h 即顯著上升。經(jīng)Poly I:C 刺激后，Onmarco基因在腸道、頭腎和脾臟3 個(gè)組織中表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性上調(diào)。Marco有助于巨噬細(xì)胞識(shí)別病毒，從而引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[34]。Qiu等[35]發(fā)現(xiàn)在美國(guó)紅魚(yú)頭腎和脾臟中，病毒感染會(huì)引起marco基因上調(diào)表達(dá)。在腸道、頭腎和脾臟3 個(gè)組織中，Onmarco基因均顯著上調(diào)，達(dá)到峰值后又恢復(fù)正常水平，可能與魚(yú)類先天性抗病毒免疫反應(yīng)有關(guān)。

通過(guò)LPS、Poly I:C 和滅活后的無(wú)乳鏈球菌刺激，檢測(cè)頭腎白細(xì)胞中Onmarco基因的時(shí)序變化情況，結(jié)果顯示3 種刺激物都可以上調(diào)Onmarco基因的表達(dá)，但最高表達(dá)量出現(xiàn)的時(shí)間略有不同。Poly I:C和無(wú)乳鏈球菌刺激后最高表達(dá)量均出現(xiàn)在48 h，而LPS 刺激后迅速上調(diào)，在6 h 即達(dá)到峰值，隨后成下降趨勢(shì)，表明Onmarco基因?qū)PS 更為敏感且反應(yīng)迅速。與SR-A 家族的其他成員一樣，Marco可以結(jié)合革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌[17]。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，可以刺激白細(xì)胞，促使炎癥介質(zhì)的釋放，從而誘導(dǎo)SR-A表達(dá)[36]。通過(guò)LPS 刺激后，Onmarco基因表達(dá)上調(diào)，這說(shuō)明OnMarco 可能在LPS誘導(dǎo)的炎癥中發(fā)揮抑制作用。Onmarco基因受到滅活的無(wú)乳鏈球菌刺激后上調(diào)表達(dá)，與小鼠SR-A 抵御李斯特菌和其他革蘭陽(yáng)性菌的結(jié)果一致[37]。據(jù)報(bào)道，Marco 還能抑制病毒的復(fù)制[38]。Poly I:C 是一種人工合成的dsRNA，可作為病毒類似物，激活免疫細(xì)胞[39]，Onmarco基因受其刺激后上調(diào)表達(dá)，可以由此推測(cè)OnMarco 在抗病毒感染中發(fā)揮免疫作用。這些結(jié)果表明，Onmarco基因可以通過(guò)革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌和病毒類似物的刺激來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)，以保護(hù)尼羅羅非魚(yú)免受細(xì)菌和病毒的感染。此外，Onmarco基因?qū)Σ煌牟≡w有不同的表達(dá)模式，可能是因?yàn)閰⑴c不同的信號(hào)調(diào)節(jié)途徑。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得的Onmarco基因與其他魚(yú)類的保守性較高，在HEK-293T 細(xì)胞上表現(xiàn)為全細(xì)胞分布，主要在細(xì)胞膜上表達(dá)。Onmarco在尼羅羅非魚(yú)各個(gè)組織中廣泛表達(dá)，其中，血液組織中的表達(dá)量最高；經(jīng)滅活的無(wú)乳鏈球菌和Poly I:C 刺激后，Onmarco在羅非魚(yú)腸道、頭腎和脾臟中的表達(dá)量均呈時(shí)序性變化；用LPS、Poly I:C 和滅活后的無(wú)乳鏈球菌刺激羅非魚(yú)頭腎白細(xì)胞，Onmarco表達(dá)量均顯著上調(diào)，表明Onmarco基因可能在魚(yú)體抵御細(xì)菌和病毒入侵的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。