牛舒藝，段心怡，賀佳，謝春艷

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，洞庭湖區(qū)農(nóng)村生態(tài)系統(tǒng)健康湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128

鎘(cadmium,Cd)是一種毒性大、難降解且污染面積廣的主要環(huán)境污染物[1]。近年來(lái)，隨著科技的發(fā)展和進(jìn)步，鎘被廣泛應(yīng)用于冶煉、電池、農(nóng)藥、化肥等工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，致使環(huán)境中的鎘含量超出正常范圍，生態(tài)系統(tǒng)平衡遭到破壞[2]。鎘可以通過(guò)工業(yè)制造活動(dòng)或食品、水、空氣污染以及許多其他潛在來(lái)源進(jìn)入人體[3]，食物一般是鎘暴露的最主要途徑[4]。與其他重金屬相比，殘留于環(huán)境中的鎘及其代謝產(chǎn)物由于較強(qiáng)的流動(dòng)性、持久性和生物累積性[5]，易被作物根系吸收并積累，從而沿食物鏈富集于人類(lèi)體內(nèi)并長(zhǎng)期蓄積[6-7]，造成多種器官、組織以及細(xì)胞和DNA方面的損傷[8]。已有研究證實(shí)，鎘可引發(fā)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)大腦皮質(zhì)損傷[9]、心肌細(xì)胞凋亡[10]、腎臟淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和肝臟血管炎[11]。此外，鎘能通過(guò)參與Fenton反應(yīng)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增加，造成動(dòng)植物細(xì)胞氧化損傷[12]。鎘還可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性下降，肝臟丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平增加，細(xì)胞自由基代謝失調(diào)，導(dǎo)致氧化傷害[13]。

殼寡糖(chitooligosaccharide,COS)又名殼聚寡糖、幾丁寡糖、低聚殼聚糖，其化學(xué)名為β-1,4-寡聚-葡萄糖胺，是天然、無(wú)毒副作用的低聚糖。COS具有良好的水溶性，有助于提高動(dòng)物機(jī)體免疫力[14]，減少炎癥[15]、各種應(yīng)激[16-17]帶來(lái)的損傷等。相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)表明，COS可以通過(guò)使動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶活性提升，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自由基的清除作用，從而降低氧化破壞[18-19]。COS還能對(duì)炎癥因子的分泌進(jìn)行抑制，或促進(jìn)抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生，以此減少ROS的產(chǎn)生[20]。COS還是一部分金屬離子的良好配體，且對(duì)重金屬離子有較好的吸附效果，可以作為一種吸附劑、配位體或螯合劑[21]。同時(shí)，COS處理可以介導(dǎo)核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)和核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)抗氧化信號(hào)通路，上調(diào)其下游抗氧化靶基因的表達(dá)，在減輕外源性有害物質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[22-23]。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)氧化信號(hào)通路相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[24]。p38 MAPK信號(hào)分子則是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)中的一個(gè)亞族，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激、炎癥和凋亡等生物學(xué)進(jìn)程[25]。研究表明，磷酸化的p38 MAPK作用于NF-κB，激活機(jī)體的炎癥通路，促進(jìn)炎癥因子的釋放；炎癥因子反過(guò)來(lái)促進(jìn)炎癥信號(hào)通路的活化，加劇炎癥反應(yīng)的發(fā)生[26]。有研究顯示，鎘可通過(guò)MAPK途徑誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[27]。Nrf2也是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一[28]。如圖1所示，在重金屬誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下，Nrf2可以結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)誘導(dǎo)多種抗氧化酶的表達(dá)[29]，在抗炎和減少氧化應(yīng)激引起的損傷中起著至關(guān)重要的作用[30]。既往的研究表明，鎘誘導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激常伴隨著Nrf2信號(hào)通路的激活[31]，提示該通路在鎘的主要防御機(jī)制中有重要意義。

圖1 重金屬誘導(dǎo)的Nrf2信號(hào)通路[32]Fig. 1 Heavy metals mediated Nrf2 signaling pathway[32]

綜合以上研究結(jié)果可知，鎘可通過(guò)p38 MAPK/NF-кB p65/Nrf2介導(dǎo)的信號(hào)通路啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，但具有緩解氧化應(yīng)激損傷的COS對(duì)鎘致肝臟損傷的影響方面的研究還鮮有報(bào)道，確切的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究探討。本研究采用腹腔注射CdCl2溶液的方式來(lái)建立急性鎘暴露小鼠模型，通過(guò)在小鼠飲水中添加COS，并對(duì)小鼠進(jìn)行肝臟內(nèi)ROS水平變化的檢測(cè)和病理學(xué)觀察，結(jié)合血液中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)和肝臟氧化應(yīng)激通路關(guān)鍵蛋白p38 MAPK/NF-кB p65/Nrf2表達(dá)水平的檢測(cè)，研究COS在緩解重金屬致肝臟氧化應(yīng)激方面的作用和可能機(jī)制，對(duì)通過(guò)添加COS預(yù)防或改善鎘累積致動(dòng)物機(jī)體的毒性損傷具有一定的參考價(jià)值，有望為COS作為天然生物制劑在重金屬解毒方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，降低部分鎘污染地區(qū)動(dòng)物體和人體的健康風(fēng)險(xiǎn)，達(dá)到緩解生態(tài)危害的目的。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

COS為水溶性寡糖，聚合度在2～10之間，以3～4糖為主，分子質(zhì)量≤2 000，純度為10%，購(gòu)于中泰和(北京)科技發(fā)展有限公司。谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px,GPx)試劑盒、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；MDA試劑盒購(gòu)于碧云天生物公司，其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雌性C57BL/6小鼠32只，體質(zhì)量16～19 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境室內(nèi)平均氣溫22 ℃，室內(nèi)照明控制在12 h/12 h光暗周期節(jié)律。小鼠的食物為小鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲用純凈水及經(jīng)過(guò)COS處理后的純凈水，實(shí)驗(yàn)期為28 d。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理

32只雌性小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)4 d后，隨機(jī)分為4個(gè)處理組，每個(gè)處理組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只小鼠，單欄飼養(yǎng)。4個(gè)組分別為：空白對(duì)照組(Control)、氯化鎘造模組(Cd)、殼寡糖組(COS)、殼寡糖+氯化鎘組(COS+Cd)?？瞻讓?duì)照組和氯化鎘造模組小鼠每日飼喂基礎(chǔ)日糧，給予純凈水；殼寡糖組和殼寡糖+氯化鎘組小鼠每日飼喂基礎(chǔ)日糧，在飲水中添加0.3 g·L-1COS。在第28天向氯化鎘造模組和殼寡糖+氯化鎘組小鼠腹腔注射5.45 mg·kg-1氯化鎘(以體質(zhì)量計(jì))，12 h后眼框取血，置于1.5 mL EP管中，4 ℃下靜置2 h。于3 000 r·min-1、4 ℃離心30 min后，取上清液分裝，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩２裳竺擃i椎處死，取小鼠肝臟組織在福爾馬林中固定，4 ℃靜置避光保存，每12 h更換固定液。另取一份放入包埋盒，加入適量OCT包埋劑，使組織完全被包埋劑覆蓋，置于液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.3.2 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)

福爾馬林固定好的肝臟組織按常規(guī)方法制作石蠟組織切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，光鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)及肝臟組織病理學(xué)變化等。

1.3.3 血清抗氧化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

檢測(cè)小鼠血清中GPx活性以及GSH、MDA和GSSG含量，并計(jì)算出GSSG/GSH的比值。試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 肝臟中ROS水平檢測(cè)

使用活性氧熒光探針測(cè)定，按照說(shuō)明書(shū)建議，以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)配制成溶液，避光放置備用，臨用前將溶液按照1∶1 000的比例稀釋后備用。

將OCT包被好的冷凍組織用冰凍切片機(jī)切片。制片后，將稀釋好的探針溶液滴加到組織中。于37 ℃孵育30 min。用PBS洗去多余探針溶液，用抗熒光淬滅劑封片。用熒光顯微鏡觀察并拍照，計(jì)算各組的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3.5 肝臟蛋白水平檢測(cè)

Western blot方法檢測(cè)肝臟組織中Nrf2、p-NF-кB、NF-кB、p-p38 MAPK、p38 MAPK的蛋白表達(dá)水平。剪取適量肝臟組織研磨成干粉狀，倒入EP管中，提取組織總蛋白，然后檢測(cè)并將蛋白濃度調(diào)至相同，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制溶液、封閉及孵育等操作，最后使用ECL方法顯色。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)，比較組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05、P<0.01表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 飼糧中添加COS對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

由圖2可知，本試驗(yàn)中氯化鎘急性處理和COS添加均未對(duì)小鼠體質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

圖2 各組小鼠體質(zhì)量注：Control表示空白對(duì)照組；Cd表示氯化鎘造模組；COS表示殼寡糖組；COS+Cd表示殼寡糖+氯化鎘組。Fig.2 Body mass of mice in different groupsNote:Control stands for Control group;Cd stands for cadmium chloride model group;COS stands for COS group;COS+Cd stands for COS+cadmium chloride group.

2.2 小鼠肝臟組織病理學(xué)觀察

由圖3可知，空白對(duì)照組小鼠肝小葉染色均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞間有明顯的界限，未見(jiàn)顯著的變性與壞死；殼寡糖組肝臟細(xì)胞未產(chǎn)生明顯變化；氯化鎘造模組肝臟組織產(chǎn)生了明顯病理變化，細(xì)胞間界限模糊、炎癥和凋亡增多，且細(xì)胞核出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象(黑色圓圈及箭頭部分)，表明鎘染毒處理對(duì)肝臟細(xì)胞造成了一定的損傷；殼寡糖+氯化鎘組相對(duì)氯化鎘造模組，細(xì)胞壞死程度和炎癥減輕，肝臟結(jié)構(gòu)較為清晰。

圖3 光鏡下各組小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(100倍)注：(a) Control；(b) Cd；(c) COS+Cd；(d) COS；黑色圓圈及箭頭部分表示肝臟細(xì)胞核萎縮。Fig.3 Morphology and structure of liver tissue of mice (×100)Note:(a) Control;(b) Cd;(c) COS+Cd;(d) COS;the black circles and arrow indicated liver nuclear atrophy.

2.3 飼糧中添加COS對(duì)其血液抗氧化指標(biāo)的影響

由圖4可知，與氯化鎘造模組相比，通過(guò)飲水添加COS顯著降低了小鼠血清中GSH含量和GPx活性(P<0.05)，提高了GSSG含量(P<0.05)，緩解了由于重金屬鎘富集導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，激活了小鼠體內(nèi)的GSSG/GSH系統(tǒng)(P<0.05)。在正常飼養(yǎng)條件下，飲水中添加COS使小鼠血清中GSH含量呈顯著提升趨勢(shì)(P<0.05)，明顯降低了GPx活性和GSSG含量(P<0.05)，使得GSSG/GSH比值大幅升高(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，氯化鎘造模組小鼠血清中GSH含量和GSSG/GSH的比值有一定程度的上升(P<0.05)，MDA的含量呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.01)，而殼寡糖+氯化鎘組的數(shù)據(jù)顯示，COS顯著抑制了鎘中毒小鼠血清內(nèi)MDA的產(chǎn)生P<0.05)。

圖4 小鼠血清抗氧化相關(guān)指標(biāo)注：GSH表示谷胱甘肽，GSSG表示氧化型谷胱甘肽，GPx表示谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，MDA表示丙二醛；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Fig.4 Serum antioxidant indexes of miceNote:GSH stands for glutathione;GSSG stands for oxidized glutathione;GPx stands for glutathione peroxidase;MDA stands for malonaldehyde;different letters indicated significant difference (P<0.05),and the same letters indicated no significant difference (P>0.05).

2.4 飼糧中添加COS對(duì)肝臟中ROS含量的影響

由圖5可知，與空白對(duì)照組相比，氯化鎘造模組小鼠肝臟內(nèi)代表ROS的紅色熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.01)，添加COS之后，殼寡糖+氯化鎘組紅色熒光強(qiáng)度降低，整體狀態(tài)趨近于空白對(duì)照組，說(shuō)明COS可通過(guò)減少肝臟中ROS水平，緩解重金屬鎘蓄積而導(dǎo)致的肝臟損傷。

圖5 小鼠肝臟細(xì)胞中活性氧(ROS)相對(duì)含量注：DAPI表示4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，DHE表示二氫乙啶；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Fig.5 Relative hepatic reactive oxygen species (ROS) content of miceNote:DAPI stands for 4’,6-diamidino-2-phenylindole,and DHE stands for dihydroethidium;different letters indicated significant difference (P<0.05),and the same letters indicated no significant difference (P>0.05).

2.5 肝臟氧化應(yīng)激通路關(guān)鍵蛋白的相對(duì)表達(dá)

由圖6可知，重金屬鎘在機(jī)體的富集可以有效激活小鼠肝臟內(nèi)Nrf2(P<0.05)，同時(shí)抑制炎癥相關(guān)的信號(hào)分子磷酸化NF-кB p65的表達(dá)(P<0.05)。和空白對(duì)照組相比，在小鼠飲水中添加COS后，可顯著抑制Nrf2的表達(dá)(P<0.05)，對(duì)磷酸化p38 MAPK的表達(dá)也有抑制的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)其總蛋白的表達(dá)亦無(wú)明顯影響(P>0.05)。氯化鎘造模組和殼寡糖+氯化鎘組對(duì)比結(jié)果顯示，添加COS后小鼠肝臟內(nèi)Nrf2水平顯著降低(P<0.05)，磷酸化p38 MAPK表達(dá)量也有一定程度的降低(P>0.05)。

圖6 小鼠肝臟氧化應(yīng)激通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平注：NF-κB表示核因子-κB，MAPK表示絲裂原激活蛋白激酶，Nrf2表示核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Fig.6 Relative expression levels of proteins related to oxidative stress in the liver of miceNote:NF-κB stands for nuclear factor-kappa B,MAPK stands for mitogen activated protein kinase,and Nrf2 stands for nuclear factor erythroid 2-related factor 2;different letters indicated significant difference (P<0.05),and the same letters indicated no significant difference (P>0.05).

3 討論(Discussion)

作為一種重金屬環(huán)境污染物，鎘可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，對(duì)多種組織和系統(tǒng)造成不可逆的損傷[33-35]。食源性鎘是畜禽鎘暴露的主要來(lái)源。動(dòng)物飼料中的鎘多來(lái)自于原料和礦補(bǔ)劑添加，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體生長(zhǎng)緩慢，免疫力下降等，進(jìn)而影響后期的生長(zhǎng)性能及胴體性狀[36]。肝臟是鎘損傷的重要靶器官之一，也是最主要的鎘積累器官[37]。Kuester等[38]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟在急性或慢性鎘暴露后幾小時(shí)內(nèi)便可以積累大量的鎘。鎘還能導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)多種病理性變化，以50 mg·L-1鎘的飲水飼喂大鼠12周，大鼠肝臟MDA含量增加，發(fā)生了顯著的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[39]。陳夢(mèng)妍等[40]還發(fā)現(xiàn)，急性鎘暴露可導(dǎo)致小鼠肝臟細(xì)胞局部出現(xiàn)氣球樣變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死等較為明顯的損傷。本試驗(yàn)采用氯化鎘對(duì)小鼠建立急性鎘中毒模型，發(fā)現(xiàn)氯化鎘造模組小鼠肝臟中出現(xiàn)肝臟結(jié)構(gòu)不清楚、肝細(xì)胞顆粒變性且細(xì)胞核萎縮等病理變化，和陳夢(mèng)妍等[40]的發(fā)現(xiàn)基本一致。GSH、GSSG和GPx參與動(dòng)物體內(nèi)氧化還原過(guò)程，能和過(guò)氧化物結(jié)合，以對(duì)抗氧化劑對(duì)臟器細(xì)胞的損害。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，急性鎘中毒處理可以導(dǎo)致小鼠血清中GSH、MDA的含量和GSSG/GSH比值顯著升高，表明氯化鎘導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生了劇烈脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并導(dǎo)致機(jī)體啟動(dòng)了相應(yīng)的抗氧化體系，說(shuō)明本研究成功建立了小鼠的急性鎘應(yīng)激模型。

COS具有抗炎[41-42]、抗菌[43]、提高免疫力[44]和改善腸道微生物[45]等作用。許青松等[46]的研究表明，COS還有緩解氧化應(yīng)激的作用，能抑制肝組織中MDA含量升高，提高肝組織中SOD活性，對(duì)四氯化碳造成的小鼠急性肝損傷進(jìn)行保護(hù)。研究表明，COS可增加細(xì)胞內(nèi)CAT活性，提高GSH含量[47]，且對(duì)重金屬離子也有一定的吸附效果，可以促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體對(duì)鎘的脫除[48]。在本試驗(yàn)中，與氯化鎘造模組相比，COS添加有助于小鼠肝臟組織損傷的的恢復(fù)，減緩炎癥和細(xì)胞凋亡，說(shuō)明COS在保護(hù)急性鎘中毒引起的肝臟損傷中具有一定效果。與氯化鎘造模組相比，殼寡糖+氯化鎘組小鼠血清中GSH、MDA的含量和GPx活性顯著降低，GSSG含量顯著提升，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的GSSG/GSH系統(tǒng)被激活。這顯示COS能夠通過(guò)激活動(dòng)物機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，來(lái)緩解脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生而導(dǎo)致肝臟遭受的氧化損害。

鎘能通過(guò)參與Fenton反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量ROS，引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，造成動(dòng)物細(xì)胞的損傷，其毒性與氧化損傷密切相關(guān)[49]。研究表明，COS有清除活性氧自由基或離子的功能[50]。在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，COS能抑制活化的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量ROS，從而起到抗炎作用[51]。翟星辰[52]認(rèn)為，COS可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，達(dá)到抑制腎癌對(duì)機(jī)體損傷的效果。GSH是ROS的天然清除劑，是細(xì)胞氧化還原的主要調(diào)節(jié)因子，可在酶類(lèi)的催化下氧化生成GSSG[53]。GSH和GSSG之間處于動(dòng)態(tài)平衡，共同緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激，二者的氧化還原循環(huán)是機(jī)體抵抗氧化損傷的重要機(jī)制之一，GSSG/GSH比值則是反映機(jī)體氧化還原狀態(tài)的重要指標(biāo)[54]。本研究中氯化鎘造模組小鼠肝臟細(xì)胞ROS含量急劇上升，而添加COS后小鼠肝臟細(xì)胞ROS含量降低，GSSG/GSH比值下降，細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)有一定的恢復(fù)，提示COS可通過(guò)調(diào)控GSSG/GSH比例減少肝臟ROS產(chǎn)生，具有修復(fù)肝臟氧化損傷的功能。

研究表明，鎘可通過(guò)增加細(xì)胞ROS誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Nrf2、NF-кB等[55]。氧化應(yīng)激條件下Nrf2通路被誘導(dǎo)激活，抵抗ROS導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，是肝臟迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[56]，且在降低鎘致毒性方面發(fā)揮了重要作用[57]。NF-кB是重要的炎癥相關(guān)信號(hào)因子，激活后能夠以NF-кB p65的形式存在，在機(jī)體的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[58]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鎘導(dǎo)致小鼠肝臟組織內(nèi)抗氧化蛋白Nrf2及磷酸化p38 MAPK的相對(duì)表達(dá)量升高，磷酸化NF-кB p65的表達(dá)降低，進(jìn)一步證明鎘誘發(fā)了自由基的產(chǎn)生，使機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷。Luo等[59]對(duì)乙醇誘導(dǎo)的小鼠細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激進(jìn)行COS處理后發(fā)現(xiàn)，COS可通過(guò)抑制p38 MAPK的磷酸化和調(diào)控Nrf2的活化，影響下游抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而清除細(xì)胞內(nèi)積累的ROS。在本試驗(yàn)中，相較氯化鎘造模組，COS添加在一定程度上抑制了小鼠肝臟組織p38 MAPK的磷酸化水平，和Luo等[59]的發(fā)現(xiàn)一致。研究表明，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核參與抗氧化反應(yīng)[60]，機(jī)體恢復(fù)穩(wěn)態(tài)后Nrf2轉(zhuǎn)移回細(xì)胞質(zhì)中，并通過(guò)泛素化降解或負(fù)反饋調(diào)節(jié)回歸正常水平[61]。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，對(duì)急性鎘暴露小鼠進(jìn)行COS處理后，小鼠肝臟細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)顯著降低，這可能因?yàn)镃OS在激活機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的同時(shí)，降低了肝臟組織ROS含量，使機(jī)體內(nèi)恢復(fù)氧化還原穩(wěn)態(tài)。根據(jù)本研究結(jié)果，我們初步推斷：鎘暴露引起小鼠細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)MAPK信號(hào)通路激活，進(jìn)而導(dǎo)致其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶p38 MAPK的激活，激活后的磷酸化的p38 MAPK信號(hào)分子主要調(diào)動(dòng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，說(shuō)明大量鎘蓄積導(dǎo)致肝臟處于急性的炎癥活躍期。同時(shí)，肝臟在鎘誘導(dǎo)的過(guò)量ROS的刺激下負(fù)反饋抑制磷酸化NF-κB的激活，提高氧化應(yīng)激關(guān)鍵信號(hào)分子Nrf2的表達(dá)，減慢炎癥發(fā)展的速度。機(jī)體添加COS后p38的磷酸化水平降低，緩解了肝臟的炎癥程度，同時(shí)通過(guò)抑制磷酸化NF-κB的表達(dá)，使Nrf2的表達(dá)下降至正常水平，從而維持肝臟的氧化還原穩(wěn)態(tài)(圖7)。

圖7 Cd和COS聯(lián)合作用下小鼠肝臟p38 MAPK/NF-кB p65/Nrf2氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路注：ERK-1/2表示細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；SAPK表示應(yīng)激活化蛋白激酶；JNK表示c-Jun氨基末端激酶；黑色實(shí)線表示Cd產(chǎn)生的影響，紅色實(shí)線表示COS產(chǎn)生的影響。Fig.7 Oxidative stress related signaling pathways of p38 MAPK/NF-кB p65/Nrf2 in mouse liver under the combined action of Cd and COSNote:ERK stands for extracellular regulated kinase,SAPK stands for stress-activated protein kinase,and JNK stands for c-Jun N-terminal kinase;the black solid line shows the effect of Cd,and the red solid line shows the effect of COS.

綜上所述，COS可通過(guò)調(diào)控肝臟主要抗氧化信號(hào)通路，來(lái)緩解鎘對(duì)小鼠的應(yīng)激，減少肝臟組織氧化損傷，達(dá)到保護(hù)肝臟組織的目的。為COS調(diào)控重金屬富集的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，為天然多糖類(lèi)復(fù)合物作為生物解毒劑應(yīng)用于重金屬暴露的動(dòng)物和人體提供依據(jù)。