鄧麗思，舒軍輝，王灶生,*

1.江西理工大學江西礦治環(huán)境污染與控制重點實驗室，贛州 341000

2.江西理工大學資源與環(huán)境工程學院，贛州 341000

稀土元素一共有17個，也稱為稀土金屬，是鑭系元素系稀土類元素群的總稱。由于外觀酷似“土壤”，且含此元素的礦物很少，故名為稀土。根據(jù)原子序數(shù)的大小將稀土分為“輕稀土元素”和“重稀土元素”，“輕稀土元素”大多分布在北方；而在南方，特別是被稱為“稀土王國”的江西贛州，擁有大量的中重稀土資源。稀土元素是寶貴的戰(zhàn)略資源，因而多應用在軍事與科技方面，是工業(yè)的“維生素”，是高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)的工業(yè)原料，更是新興產(chǎn)業(yè)中不可缺少的部分[1]。

鐿是重稀土元素，性質(zhì)與釔相似，大多運用于光纖通訊和激光等高新技術(shù)。隨著“信息高速公路”的建設發(fā)展，鐿在光纖材料上得到了快速的發(fā)展。利用鐿的光譜特性可以制作優(yōu)質(zhì)的激光材料，如激光玻璃、激光武器和光纖激光器等[2-3]。而這些激光材料酸洗過程的廢水排放將帶來污染問題。杜正清等[4]研究了高氯酸鐿對大鼠背根神經(jīng)元細胞毒性及對膜上鉀通道的影響，并對比了鑭、釓和鐿3種稀土離子誘導背根神經(jīng)元的凋亡程度，實驗結(jié)果表明鐿離子有一定的神經(jīng)毒性且毒性比鑭、釓都要強；徐婷[5]通過研究紫背浮萍對稀土元素鐿的脅迫應答機制，發(fā)現(xiàn)隨著鐿的處理濃度的逐漸增大，紫背浮萍的葉片色素含量逐漸下降，并出現(xiàn)褪色現(xiàn)象，此外還影響對其他礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收；聶毓秀等[6]的研究表明5 mm的鐿離子對體外培養(yǎng)的細胞具有很大的毒性效應，而鐿所形成的不同配合物對人二倍體細胞不但沒有毒性作用，還可以破壞癌細胞，使癌細胞死亡。據(jù)報道，在高濃度的稀土元素下，蠶豆根尖生長會受到明顯抑制作用，根尖顏色變黃、發(fā)黑，根尖組織變硬；會改變細胞的結(jié)構(gòu)與功能，具有一定毒性效應；還會破壞葉綠體結(jié)構(gòu)而影響光合作用等等[7-11]。但目前國內(nèi)研究金屬鐿離子對水生生物大型溞的毒性效應較少。

稀土釹元素為過渡稀土金屬，為銀白色，有順磁性，化學性質(zhì)較活潑，化合價主要為正三價，廣泛分布在土壤中，在植物體內(nèi)中不同器官和生長部位含量不一。我國釹正處于迅速發(fā)展時期，特別是在一些高端產(chǎn)業(yè)當中，憑借獨特的理化性質(zhì)，多應用于永磁材料、合金制備以及高端技術(shù)產(chǎn)業(yè)中[12-13]；在20世紀60年代人們發(fā)現(xiàn)某些稀土元素具有抗菌、抗癌和消炎的作用，并得到釹的抗菌與消炎功效相比其他稀土元素更強，使釹在臨床診斷和醫(yī)療價值方面有了廣泛的應用[14]。釹元素的廣泛應用可能會進入周圍水體環(huán)境，進而對水生生物影響的研究需求也愈加迫切。胡勤海等[15]采用722型分光光度計，在波長為692 nm處通過測OD值來反映小球藻的生長狀況，實驗結(jié)果表明在初期稀土元素有促進小球藻生長的作用，但到后期則為抑制作用，甚至出現(xiàn)小球藻停止生長繁殖的現(xiàn)象。此外他還發(fā)現(xiàn)單一稀土元素釹的毒性比混合稀土元素對水藻的毒性作用要更強[16]。屈艾和高寬場[17]采用細胞有絲分裂指數(shù)和微核測試技術(shù)，用硝酸釹溶液處理玉米根尖，研究對玉米的遺傳及細胞毒性，結(jié)果表明硝酸釹在不大于8 mg·L-1的濃度下對玉米根尖有促進生長的作用，而在高濃度下，>16 mg·L-1時，具有抑制的作用，稱之為“低促高抑”效應，同時對遺傳的影響也具有同樣的特點。Xing等[18]以釹為脅迫因子，對渦蟲進行研究，結(jié)果顯示隨著釹濃度的增高，渦蟲體內(nèi)中的釹積累量變大，同時礦質(zhì)營養(yǎng)代謝出現(xiàn)失衡現(xiàn)象，渦蟲的解體死亡數(shù)量變多。

世界約含440多種溞類，而我國含有130多種，分布在各地淡水水體。溞類以最初生產(chǎn)者藻類為食，也可食水中的碎屑和細菌，而它本身又被魚類捕食，故在食物鏈中起著重要的作用，同時也影響著水體的凈化。實驗中的大型溞體長2～6 mm，體呈寬卵形，發(fā)達的第二觸角是它的主要游泳器官，具有繁殖周期短、繁殖數(shù)量多、對水體中的毒性物質(zhì)敏感、容易獲得和培養(yǎng)等特點，故在國內(nèi)外常常用作測試生物。

本次實驗主要以釹和鐿對水域中的大型溞的危害作用為例，鑒于大型溞在水生食物鏈中擔任重要的角色，一旦溞類受到危害不僅僅會影響其種群的數(shù)量，而且會在體內(nèi)積聚，隨著食物鏈，危害水中的其他水生生物，最終危害人體健康，以致影響人類生存發(fā)展和自然生態(tài)環(huán)境，故通過研究稀土元素對大型溞的毒性效應，找到危害大型溞的濃度范圍，計算出半數(shù)致死率，并分別考察有關(guān)稀土元素暴露液對大型溞的急性和慢性毒性，從而綜合評價釹和鐿對大型溞的毒性生態(tài)效應，為開展這2種元素的生態(tài)風險評價提供可靠數(shù)據(jù)，為減少稀土礦開采過程中所造成的環(huán)境危害的評估提供思路，以及為確定流域稀土的生態(tài)效應與環(huán)境治理提供科學基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗生物

大型溞(Daphniasp.)購于中國科學院水生生物研究所，在實驗中采用的是經(jīng)過2 d以上曝氣的自來水，并放于溫度為(20±2) ℃、光照強度為1 200 lx、14 h光/10 h暗的1 000 mL的燒杯中培養(yǎng)。實驗中采用由中國科學院城市環(huán)境研究所提供的小球藻進行飼喂，小球藻使用BG11培養(yǎng)液放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間的小球藻再放入離心機離心后，倒去上清液，濃縮后的小球藻放置4 ℃的冰箱中保存，可對大型溞進行飼喂，食物量保持在0.1～0.2 mg·溞-1·d-1(以碳計)，此外，每天要定時清理大型溞退去的殼，2 d換一次培養(yǎng)液。

1.2 暴露液與試劑

本實驗的暴露培養(yǎng)液采用改良重組水，為防止標準重組水中的碳酸根離子與鈣離子產(chǎn)生沉淀，而將碳酸氫鈉換成氯化鈉，改良后的重組水成分為氯化鈣0.294 g·L-1，硫酸鎂0.123 g·L-1，氯化鈉0.065 g·L-1和氯化鉀0.00575 g·L-1。

五水硝酸鐿(Yb(NO3)3·5H2O)為分析純，純度為99.99%，六水硝酸釹(Nd(NO3)3·6H2O)為分析純，均購買于上海麥克林試劑。試驗液由儲備液稀釋而成。稱量2.6 g的硝酸鐿，去離子水溶解后，定容到1 L，即可得到1 g·L-1的鐿儲備液；稱量3.0 g的硝酸釹，采用同樣的方法可得到1 g·L-1的釹儲備液。稀釋到各個濃度對大型溞進行暴露實驗，另外用ICP法測定試驗液中鐿和釹的實際濃度。

1.3 實驗方法

1.3.1 預實驗

依據(jù)文獻，設置預實驗濃度范圍為1、5、10、50和100 mg·L-1，不設置平行組，分別記錄其24 h和48 h的死亡個數(shù)。依據(jù)預實驗結(jié)果確定正式試驗濃度范圍。

1.3.2 稀土鐿和釹元素的急性毒性

參考經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)大型溞急性抑制測試方法，采用約繁殖3代后已經(jīng)穩(wěn)定的新生幼溞，將鐿的濃度范圍設為1、4.4、9、20、40和80 mg·L-1，1個空白對照組；釹的濃度設為5、13.24、21.92、36.26、50和60 mg·L-1和1個對照組。每個濃度均有3組平行，選擇10只剛出生形態(tài)相似的健康大型溞放置于含100 mL暴露液體的燒杯中，將其放入光照培養(yǎng)箱中，不對大型溞投喂，分別記錄大型溞24 h和48 h的死亡個數(shù)及任何異常癥狀。

1.3.3 稀土釹元素的慢性毒性

參考OECD大型溞21 d慢性抑制測試實驗方法，暴露液為改良重組水配制，在最低濃度的1/10與1/50之間按等對數(shù)間距設置慢性毒性的濃度，以確保大型溞在21 d內(nèi)能夠正常生長，實驗中的濃度分別為0.12、0.15、0.22、0.3和0.47 mg·L-1，設置1個對照組，每個濃度設置9個平行組，將新生健康的一只大型溞放置于含50 mL暴露液的燒杯中單獨培養(yǎng)，每2 d換水和投喂適量的小球藻。小球藻需用4 000 r·min-1的離心機離心15 min，離心后倒掉上清液，并加入去離子水多次清洗。每天對大型溞進行觀察，并記錄每個大型溞的生長狀況以及大型溞生殖的幼溞個數(shù)和生殖的時間，而且在實驗過程中要將每一次生殖的幼溞與母溞隔開，直到大型溞繁殖第3代或者21 d，分別記錄F1、F2、F3和F4的數(shù)量和各濃度組繁殖一代所需要的時間，并分析顯著差異的濃度，計算內(nèi)稟增長率。

1.3.4 統(tǒng)計分析

采用概率單位統(tǒng)計法求出24 h和48 h的半數(shù)致死濃度，并計算95%的置信區(qū)間；慢性實驗數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析和多重比較(Dunnett’s檢驗)來計算各個試驗濃度組與對照組之間是否存在顯著差異(P=0.05)，再利用非參數(shù)檢驗方法(根據(jù)Holm趨勢檢驗得到的Bonferroni-U檢驗)來確定無觀察效應濃度(NOEC)和最低可觀察效應濃度(LOEC)，并計算95%的置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 鐿對大型溞的急性毒性

隨著溶液中鐿濃度的增加，大型溞的活動越來越受到抑制，最終縮成一團白色下沉在容器底部，直到死亡。如圖1和表1所示，鐿對大型溞24 h-LC50為24.57 mg·L-1，其95%的置信區(qū)間為12.64～66.01 mg·L-1；如圖2和表1所示，48 h-LC50為7.91 mg·L-1，其95%的置信區(qū)間為6.73～10.39 mg·L-1。

圖1 鐿暴露24 h時鐿的對數(shù)濃度與大型溞死亡率之間的關(guān)系Fig. 1 The relationship between logarithmic concentration and mortality of Daphnia magna in ytterbium exposure for 24 h

圖2 鐿暴露48 h時鐿的對數(shù)濃度與大型溞死亡率之間的關(guān)系Fig. 2 The relationship between logarithmic concentration and mortality of Daphnia magna in ytterbium exposure for 48 h

表1 稀土元素鐿對大型溞急性數(shù)據(jù)Table 1 Acute toxicity of rare earth element ytterbium to Daphnia magna

2.2 釹對大型溞的急性毒性

如圖3和表2所示，釹對大型溞的24 h-LC50為37.72 mg·L-1，其95%的置信區(qū)間為30.49～58.57 mg·L-1；如圖4和表2所示，48 h-LC50為12.98 mg·L-1，其95%的置信區(qū)間為10.56～15.84 mg·L-1。

圖3 釹暴露24 h時釹的對數(shù)濃度與大型溞死亡率之間的關(guān)系Fig. 3 The relationship between logarithmic concentration and mortality of Daphnia magna in neodymium exposure for 24 h

圖4 釹暴露48 h時釹的對數(shù)濃度與大型溞死亡率之間的關(guān)系Fig. 4 The relationship between logarithmic concentration and mortality of Daphnia magna in neodymium exposure for 48 h

表2 稀土元素釹對大型溞急性毒性數(shù)據(jù)Table 2 Acute toxicity of rare earth element neodymium to Daphnia magna

2.3 釹對大型溞的慢性毒性

2.3.1 釹暴露液對大型溞存活個數(shù)的影響

統(tǒng)計繁殖3代的數(shù)據(jù)可知，對照組的大型溞在14 d內(nèi)無死亡現(xiàn)象，在21 d后，只有3只死亡，其他均保持正常生長。而在含釹暴露液中的大型溞在不同程度上受到影響，特別是后期出現(xiàn)了大量的死亡現(xiàn)象。0.3 mg·L-1和0.47 mg·L-1濃度組第20天時均只剩1只大型溞，其余均死亡，如圖5所示。這與急性毒性實驗中的48 h-LC50為13.96 mg·L-1的結(jié)果有差異，這在已有的一些研究結(jié)果中亦有發(fā)現(xiàn)。Ellesat等[19]用鹽酸苯海拉明和硫氰酸紅霉素2種藥物對大型溞進行毒性研究，發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，當暴露液的濃度為62 μg·L-1時，大型溞可在15 d左右死亡。

圖5 大型溞在釹暴露液中21 d的死亡個數(shù)注：0組為對照組，1、2、3、4和5組中釹的濃度分別為0.12、0.15、0.22、0.3和0.47 mg·L-1；下同。Fig.5 Number of deaths of Daphnia magna after neodymium exposure for 21 dNote:Group 0 was the control group,and the concentrations of neodymium in group 1,2,3,4 and 5 were 0.12,0.15,0.22,0.3 and 0.47 mg·L-1;similarly hereinafter.

2.3.2 釹暴露液對大型溞首次蛻殼時間的影響

對于大型溞首次蛻殼時間的影響如圖6所示，大多數(shù)大型溞的首次蛻殼時間集中在第2天，但0.3 mg·L-1和0.47 mg·L-1濃度組大型溞蛻殼時間略有延長。

圖6 釹暴露對大型溞的首次蛻殼時間的影響Fig. 6 Effect of neodymium exposure on first molting time of Daphnia magna

2.3.3 釹暴露液對大型溞首次產(chǎn)溞時間的影響

對照組首次產(chǎn)溞時間為8 d左右，而處于不同濃度暴露液中的大型溞首次產(chǎn)溞時間均有延長，0.3 mg·L-1和0.47 mg·L-1濃度組與對照組相比具有顯著差異，如圖7所示。

圖7 釹暴露對大型溞的首次產(chǎn)溞時間的影響注：*表示P<0.05。Fig.7 Effect of neodymium exposure on first birth time of Daphnia magna Note:*indicates P<0.05.

2.3.4 釹暴露液對大型溞每代平均產(chǎn)溞數(shù)量的影響

對單個大型溞的每次產(chǎn)幼溞的數(shù)量進行統(tǒng)計，由圖8可知，隨著暴露液中釹濃度的增加，母代所產(chǎn)小溞數(shù)量明顯下降，并且高濃度釹暴露組母代生殖胎數(shù)減少，出生的幼溞死亡率較高。

圖8 釹暴露對大型溞21 d的每窩平均凈生殖數(shù)量注：不同字母表示不同處理在同代間的差異顯著(P<0.05)。Fig.8 Average net reproductive number per brood of Daphnia magna after neodymium exposure for 21 dNote:Different letters indicate significant differences between different treatments in the same generation.

在0.47 mg·L-1釹暴露濃度下，大型溞的首次產(chǎn)溞時間、產(chǎn)溞個數(shù)和21 d的產(chǎn)溞胎數(shù)均與對照組有顯著差異。

2.3.5 釹暴露液對大型溞產(chǎn)溞胎數(shù)的影響

觀察大型溞的繁殖胎數(shù)，發(fā)現(xiàn)對照組一般可在21 d繁殖4～5代，而0.3 mg·L-1和0.47 mg·L-1濃度組出現(xiàn)顯著差異(P<0.01)，只能繁殖1～2代，母代便會死亡，如圖9所示。

圖9 釹暴露對大型溞繁殖胎數(shù)的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig.9 Effect of neodymium exposure on the reproductive cycle of Daphnia magnaNote:*indicates P<0.05,and **indicates P<0.01.

2.3.6 釹暴露液對大型溞體型的影響

對照組中的大型溞帶有深灰色，活動能力極強，體型很大且能在水中前后翻滾；在釹濃度較高的暴露液中，大型溞個頭較小，體色多為白色，產(chǎn)溞個數(shù)少，活動能力較差，后期實驗中有不少大型溞陸續(xù)死亡。

2.3.7 釹暴露液中大型溞內(nèi)稟增長率的計算

計算了慢性實驗中大型溞的內(nèi)稟增長率，內(nèi)稟增長率是一種生態(tài)指標，不僅可以反映某個種群在環(huán)境中的生長趨勢，還可反映該種群的繁殖能力，其計算公式如下。

R0=∑Lxmx

(1)

T0=∑XLxmx/∑Lxmx

(2)

r=ln(R0/T0)

(3)

式中∶Lx為存活率，mx為大型溞每次產(chǎn)幼溞數(shù)，T0為世代周期(d)，X為時間(d)，R0為大型溞的凈生殖率，r為內(nèi)稟增長率。

由圖10可知，隨著含釹暴露液中的釹濃度增加，大型溞的內(nèi)稟增長率逐漸下降，并當暴露液中釹的濃度≥0.22 mg·L-1時，內(nèi)稟增長率與對照組出現(xiàn)了顯著差異(P<0.01)，特別是在0.47 mg·L-1釹濃度下，內(nèi)稟增長率僅為0.17，可見暴露液對大型溞的生長繁殖影響極大。

3 討論(Discussion)

胡泗才[20]報道硝酸稀土對大型溞的24 h和48 h-LC50為38.67 mg·L-1和32.09 mg·L-1，慢性實驗中并未發(fā)現(xiàn)對大型溞的生存率和生命壽限有明顯的影響。而本研究發(fā)現(xiàn)，重稀土元素鐿的急性毒性比輕稀土元素釹強。釹的24 h-LC50為37.72 mg·L-1，48 h-LC50為12.98 mg·L-1，與Blinova等[21]報道的釹對大型溞的48 h-LC50為(20.8±3.8) mg·L-1的結(jié)果相差不大。鐿對大型溞的24 h-LC50為24.57 mg·L-1，48 h-LC50為7.91 mg·L-1。目前，有關(guān)鐿對大型溞毒性試驗鮮有報道。從慢性毒性角度分析，稀土元素對大型溞的各項繁殖指標均有影響，如每代繁殖幼溞個數(shù)減少、蛻皮次數(shù)減少、個體變小甚至畸變、繁殖時間變長和高濃度組母胎死亡等[22-25]，且表現(xiàn)出劑量-效應關(guān)系[24]。綜合分析得到釹元素對大型溞21 d-LOEC為0.3 mg·L-1，21 d-NOEC為0.12 mg·L-1，95%的置信區(qū)間為0.08～0.14 mg·L-1。此外，隨著時間延長，這種稀土毒性會影響后代，甚至可能隨著食物鏈傳播，危害人體健康和水生生態(tài)系統(tǒng)，所以要關(guān)注各類含稀土元素的廢水對水生生物在不同層次上的毒理效應。

實驗未對F1等后代進行試驗和觀察，稀土元素的毒性是否會通過繁殖影響后代且其影響表現(xiàn)形式如何，這都值得進一步探討；此外實驗未對釹和鐿元素的溶解度進行深入研究。王靖坤[26]指出，稀土元素的溶解度一般與pH、溫度、配體類型及離子濃度等有關(guān)，鑭系元素中的硝酸鹽、磷酸鹽和氯化物等可溶解，而一些碳酸鹽和氫氧化物不可溶。在實驗中，含高濃度稀土元素的暴露液中，確實發(fā)現(xiàn)少許沉淀，實驗中的釹和鐿是否也會在一定條件下發(fā)生水解，進而生成一些水解產(chǎn)物或進一步與水中的小球藻發(fā)生微量絮凝現(xiàn)象，這些是否會影響大型溞的生存值得討論，因此對于不同稀土元素在試驗液中的存在形式，以及對大型溞致毒的形式都值得進一步探究。例如，Das等[27]在研究中發(fā)現(xiàn)，在phosphorous-free培養(yǎng)基中La大部分以無機配合物形式存在，卻觀察到毒性作用，研究表明，少部分的La3+，在有磷的條件下，會形成LaPO4，造成小球藻的沉淀現(xiàn)象，從而間接影響大型溞的正常生活狀況，而這種現(xiàn)象是否同樣對其他稀土元素適用，進而造成實驗誤差，值得思考。不同稀土元素的離子半徑不同，相應的，到鈣結(jié)合位點的時間不同[28]，研究表明，鑭系元素在一定的溫度下可以提高鈣調(diào)蛋白的生物活性，改變細胞膜表面的鈣離子通道[29-31]。相應的稀土元素一旦進入細胞，鈣離子的濃度隨之提高，導致鈣離子在體內(nèi)的代謝發(fā)生絮亂，進而使生物死亡[32]。據(jù)報道，稀土元素在高濃度時具有金屬離子的特性，與Ca2+形成競爭，帶來抑制作用[33]，還會取代Ca2+而與CaM結(jié)合，結(jié)合位點可達10個，其中CaM是生物體內(nèi)一種多功能鈣結(jié)合蛋白，參與體內(nèi)的眾多生理生化反應，對細胞的增殖、運動、轉(zhuǎn)化和死亡都有重要的作用，而過高濃度的稀土元素對CaM的活性具有抑制效果[34-38]。因此稀土元素所帶來的環(huán)境風險應當引起人們的重視。