楊慧婷，谷孝鴻，陳輝輝，曾慶飛，毛志剛，李紅敏，葛優(yōu)，查金苗

1.中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008

2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

3.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境水質(zhì)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100085

近年來(lái)，隨著藥物在農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類醫(yī)療中大量頻繁地使用[1-2]，自然水體中藥物污染物對(duì)非目標(biāo)水生生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)引起社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。卡馬西平(carbamazepine,CBZ)是臨床上治療癲癇、雙向情感障礙和三叉神經(jīng)痛的常用藥物[3]，在我國(guó)的年消費(fèi)量可達(dá)78 t[4]。由于CBZ的大量使用，且在大多數(shù)污水處理廠中的去除率較低(<10%)[5-6]，CBZ在地表水中廣泛被檢出。目前，CBZ在地表水和污水中的濃度水平為ng·L-1～μg·L-1[7-10]，我國(guó)長(zhǎng)江三角洲地區(qū)的蘇州河中CBZ的濃度高達(dá)1.09 μg·L-1[8]，而在希臘圣托里尼島的Kamari污水處理廠入水中CBZ的濃度高達(dá)6.82 μg·L-1[9]。此外，CBZ在水環(huán)境中的半衰期較長(zhǎng)((82±11) d)[11-12]，且能夠持續(xù)不斷地進(jìn)入水體環(huán)境中，具有環(huán)境持久性。

迄今為止，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了CBZ能夠?qū)Ψ悄繕?biāo)水生生物產(chǎn)生不良影響。例如，在0.03～30 μg·L-1CBZ中暴露21 d后，同形溞(Daphniasimilis)的蛻皮受到顯著抑制，生殖力顯著降低[13]。中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)在1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ中暴露40 d后，其蛻皮和生長(zhǎng)受到顯著抑制[14]。河蜆(Corbiculafluminea)在0.5～50 μg·L-1CBZ中暴露30 d后，其鰓和消化腺內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，虹吸行為減弱[6]。斑馬魚(yú)(Daniorerio)胚胎(受精后4 h)暴露在1～5 μg·L-1CBZ中92 h后，其生長(zhǎng)發(fā)育顯著加速[15]。斑馬魚(yú)成魚(yú)在10 μg·L-1CBZ中暴露63 d后，其攝食行為顯著減慢、受精卵的成活率顯著降低，頭部的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性顯著升高，肝臟和腮內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)[16]。此外，CBZ對(duì)魚(yú)類具有類雌激素效應(yīng)，能夠干擾魚(yú)類的內(nèi)分泌系統(tǒng)[11]，然而目前有關(guān)環(huán)境相關(guān)濃度下的CBZ對(duì)魚(yú)類的慢性毒性效應(yīng)十分有限，尤其是發(fā)育階段的魚(yú)類。

本研究選擇斑馬魚(yú)幼魚(yú)為受試生物，研究環(huán)境相關(guān)濃度下CBZ的慢性暴露對(duì)魚(yú)類抗氧化系統(tǒng)和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的影響。將斑馬魚(yú)幼魚(yú)(～2月齡)暴露在2種環(huán)境相關(guān)濃度的CBZ(1 μg·L-1和10 μg·L-1)中28 d，首先對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的體長(zhǎng)和體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，評(píng)估CBZ對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，其次對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織和肝臟中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性和丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)濃度進(jìn)行測(cè)定，評(píng)估CBZ對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)抗氧化系統(tǒng)的影響，最后對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織中的AChE活性、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)濃度和谷氨酸(glutamate,Glu)濃度進(jìn)行測(cè)定，評(píng)估CBZ對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚(yú)幼魚(yú)(野生AB型，～2月齡)購(gòu)自費(fèi)曦生物(上海，中國(guó))，并馴養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)。養(yǎng)殖系統(tǒng)的光/暗周期設(shè)置為14 h∶10 h，養(yǎng)殖用水的溫度為(28±1) ℃，pH為7.2±0.1，電導(dǎo)率為(500±50) μS·cm-1，每天定時(shí)投喂魚(yú)飼料和剛孵化的豐年蝦(Artemianaupli)各一次。暴露實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 d停止喂食。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

所用試劑：CBZ(CAS號(hào)：298-46-4，純度>97%，梯希愛(ài)，日本)、二甲亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO；CAS號(hào)：67-68-5，純度>99%，Sigma，美國(guó))、磷酸緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS；碧云天，中國(guó))、總蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成，中國(guó))、SOD測(cè)定試劑盒(南京建成，中國(guó))、CAT測(cè)定試劑盒(南京建成，中國(guó))、MDA測(cè)定試劑盒(南京建成，中國(guó))、AChE測(cè)定試劑盒(酶免，中國(guó))、GABA測(cè)定試劑盒(酶免，中國(guó))和Glu測(cè)定試劑盒(酶免，中國(guó))。

所用儀器：金屬浴(SCILOGEX HC 110-PRO，SCILOGEX，美國(guó))、勻漿儀(OSE-Y30，TIANGEN，中國(guó))、漩渦混勻儀(SCILOGEX MX-S，SCILOGEX，美國(guó))、離心機(jī)(Eppendorf 5804R，Eppendorf，德國(guó))、恒溫培養(yǎng)箱(JYC-412，HENGZWELL，中國(guó))、酶標(biāo)儀(BioTek Synergy HTX，BioTek，美國(guó))和超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(ACQUITY H-class UPLC，Xevo TQD，Waters，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 暴露液配制

將0.2 g CBZ溶解到0.01 L DMSO中制備20 g·L-1的CBZ母液，隨后將CBZ母液進(jìn)行梯度稀釋配制成0.02 g·L-1和0.2 g·L-1的CBZ儲(chǔ)備液，最后將0.02 g·L-1和0.2 g·L-1CBZ儲(chǔ)備液分別用養(yǎng)殖水稀釋得到1 μg·L-1和10 μg·L-1的CBZ暴露液。實(shí)驗(yàn)以0.005% DMSO(1∶20 000，V/V)為溶劑對(duì)照組。

1.3.2 斑馬魚(yú)暴露

實(shí)驗(yàn)室馴化2周后，隨機(jī)選取180條斑馬魚(yú)幼魚(yú)(體長(zhǎng)為(2.93±0.16) cm，體質(zhì)量為(0.25±0.14) g)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)。暴露容器為3 L燒杯，分別設(shè)置對(duì)照組(0.005% DMSO)和2個(gè)處理組(1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ)，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)放入20條斑馬魚(yú)幼魚(yú)于3 L實(shí)驗(yàn)溶液中。采用半靜態(tài)暴露方法，暴露周期為28 d，每天更換50%實(shí)驗(yàn)溶液，光照條件、溫度和投喂方法等其他條件同馴化條件一致。暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將幼魚(yú)放置在冰水中進(jìn)行麻醉，測(cè)量幼魚(yú)的體長(zhǎng)和體質(zhì)量。在每個(gè)平行中隨機(jī)選取4～5只幼魚(yú)，分別解剖出腦組織和肝臟混合作為一個(gè)樣品放置在1.5 mL離心管里，置于液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 暴露液濃度測(cè)定

暴露液測(cè)定方法參考本課題組之前的研究[6,14]。暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)組中取1.5 mL暴露液，暴露液通過(guò)0.22 μm針筒式過(guò)濾器過(guò)濾后置于2 mL棕色玻璃瓶中收集。收集后的暴露液用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。每個(gè)組測(cè)定的暴露液樣品共3個(gè)(n=3)。色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，美國(guó))溫度為40 ℃，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，進(jìn)樣量為5 μL，流速為0.4 mL·min-1。藥品洗脫程序：0.5 min，5% B；0.5～6 min，5% B升至70% B；6.0～7.0 min，70% B升至95% B，7.1 min降至5% B。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源正離子模式，檢測(cè)方式為多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)，離子源溫度為150 ℃，毛細(xì)管電壓為2.0 kV，脫溶劑溫度為450 ℃，錐孔氣流量為50 L·h-1。采用外標(biāo)法測(cè)定暴露液中的CBZ濃度，準(zhǔn)確配制濃度為0.5、1、5、10、50、100和150 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法檢出限和定量限分別為0.01 ng·L-1和0.02 ng·L-1。每個(gè)組檢測(cè)到的暴露液濃度如表1所示(本文全篇使用CBZ的名義濃度)。

表1 卡馬西平(CBZ)暴露液實(shí)際濃度Table 1 The carbamazepine (CBZ) concentration measured in the exposure solutions

1.3.4 抗氧化系統(tǒng)及神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)相關(guān)物質(zhì)測(cè)定

準(zhǔn)確稱量幼魚(yú)的腦組織或肝臟并放置在新的1.5 mL離心管中，按照質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，將1×PBS添加到不同的幼魚(yú)樣品(腦組織樣品和肝臟樣品)中，隨后將樣品放置在金屬浴(-2 ℃～2 ℃)中進(jìn)行勻漿，最后將勻漿后的樣品進(jìn)行離心(4 ℃，2 500 r·min-1條件下離心10 min)，取上清液備用(根據(jù)所測(cè)定的物質(zhì)對(duì)上清液稀釋不同的倍數(shù))。每個(gè)組測(cè)定的腦組織和肝臟樣品共3個(gè)(n=3)。根據(jù)不同的試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定幼魚(yú)體內(nèi)的總蛋白濃度、SOD活性、CAT活性、MDA濃度、AChE活性、GABA濃度和Glu濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和制圖。采用Kolmogorov-Smirnov和Levene分別檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。處理組和對(duì)照組之間的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Holm-Sidak多重比較檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM)表示。處理組和對(duì)照組之間的顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 CBZ對(duì)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

在暴露28 d后，測(cè)定了斑馬魚(yú)幼魚(yú)的體長(zhǎng)和體質(zhì)量(圖1)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1 μg·L-1CBZ處理組中的幼魚(yú)體長(zhǎng)未出現(xiàn)顯著性變化(圖1(a))，10 μg·L-1CBZ處理組中的幼魚(yú)體長(zhǎng)顯著增加(P=0.0257) (圖1(a))，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ處理組中的幼魚(yú)體質(zhì)量未出現(xiàn)顯著性變化(圖1(b))，表明10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠促進(jìn)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.2 CBZ對(duì)斑馬魚(yú)抗氧化系統(tǒng)的影響

在暴露28 d后，測(cè)定了斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織和肝臟中的SOD活性、CAT活性和MDA濃度(圖2)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1 μg·L-1CBZ暴露下，幼魚(yú)腦內(nèi)的SOD活性(P=0.0129)和CAT活性(P=0.0301)顯著增加(圖2(a)和(b))，肝臟中的SOD活性(P=0.0365)顯著降低，CAT活性(P=0.0026)和MDA濃度(P=0.0009)顯著增加(圖2(d)、(e)和(f))。與對(duì)照組相比，10 μg·L-1CBZ暴露下，幼魚(yú)腦內(nèi)的SOD活性(P=0.0187)顯著增加(圖2(a))，肝臟中的CAT活性(P=0.0184)和MDA濃度(P=0.0004)顯著增加(圖2(e)和(f))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠干擾斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織和肝臟中的抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)幼魚(yú)腦組織和肝臟產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)。

圖2 CBZ暴露對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織和肝臟中抗氧化系統(tǒng)的影響注：斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露在對(duì)照組(Control)、1、10 μg·L-1 CBZ中28 d；SOD表示超氧化物歧化酶，CAT表示過(guò)氧化氫酶，MDA表示丙二醛；數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，星號(hào)表示處理組與對(duì)照組之間有顯著性差異(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。Fig.2 Effects of CBZ exposure on the antioxidation system in the brain and liver of juvenile zebrafishNote:Juvenile zebrafish exposed to Control,1,10 μg·L-1 CBZ for 28 d;SOD stands for superoxide dismutase,CAT stands for catalase,and MDA stands for malonic dialdehyde;the data are expressed as mean±SEM,and asterisk denote significant differences (*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001) between treatments and controls.

2.3 CBZ對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的影響

在暴露28 d后，測(cè)定了斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織中的AChE活性、GABA濃度和Glu濃度(圖3)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10 μg·L-1CBZ暴露能夠顯著抑制幼魚(yú)腦組織中的AChE活性(P=0.033) (圖3(a))，1 μg·L-1(P=0.0001)和10 μg·L-1(P=0.0001)CBZ暴露能夠顯著提高幼魚(yú)腦組織中的GABA濃度(圖3(b))，而幼魚(yú)腦組織中的Glu濃度在1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ暴露后未出現(xiàn)顯著性變化(圖3(c))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠干擾斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織中的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

圖3 CBZ暴露對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的影響注：斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露在對(duì)照組(Control)、1、10 μg·L-1 CBZ中28 d；AChE表示乙酰膽堿酯酶，GABA表示γ-氨基丁酸，Glu表示谷氨酸；數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，星號(hào)表示處理組與對(duì)照組之間有顯著性差異(*P<0.05,***P<0.001)。Fig.3 Effects of CBZ exposure on the neurotransmitter systems in the brain of juvenile zebrafishNote:Juvenile zebrafish exposed to Control,1,10 μg·L-1 CBZ for 28 d;AChE stands for acetylcholinesterase,GABA stands for γ-aminobutyric acid,and Glu stands for glutamate;the data are expressed as mean±SEM,and asterisk denote significant differences (*P<0.05,***P<0.001) between treatments and controls.

3 討論(Discussion)

Qiang等[15]報(bào)道了1～5 μg·L-1CBZ的急性暴露(92 h)能夠?qū)е掳唏R魚(yú)仔魚(yú)的體長(zhǎng)增加、卵黃囊面積減少和魚(yú)鰾發(fā)育迅速，表明CBZ能夠加速斑馬魚(yú)仔魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育。在本研究中，10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠?qū)е掳唏R魚(yú)幼魚(yú)的體長(zhǎng)顯著增加，表明CBZ促進(jìn)了幼魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育。CBZ是對(duì)魚(yú)類能夠產(chǎn)生類雌激素效應(yīng)的藥物[11]。性激素能夠促進(jìn)生物體的食欲和生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，從而促進(jìn)生物體的生長(zhǎng)[17-18]。因此，10 μg·L-1CBZ處理組中斑馬魚(yú)幼魚(yú)體長(zhǎng)的增加可能與CBZ的類雌激素效應(yīng)有關(guān)。作為一種精神類藥物，CBZ能夠提高細(xì)胞外的血清素(serotonin,5-HT)濃度，增強(qiáng)5-HT能系統(tǒng)的神經(jīng)傳遞[19]。5-HT在調(diào)節(jié)魚(yú)類發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用[20-22]。例如，Barreiro-Iglesias等[20]報(bào)道了5-HT能夠促進(jìn)斑馬魚(yú)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育和再生。Bashammakh等[21]研究發(fā)現(xiàn)5-HT在斑馬魚(yú)的咽弓形態(tài)形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Airhart等[22]報(bào)道了5-HT水平的減少能夠?qū)Π唏R魚(yú)早期發(fā)育階段的體長(zhǎng)和脊索形態(tài)等造成不良影響。因此，10 μg·L-1CBZ處理組中斑馬魚(yú)幼魚(yú)體長(zhǎng)的增加可能與其體內(nèi)5-HT能系統(tǒng)神經(jīng)傳遞的異常有關(guān)。由于物種生長(zhǎng)發(fā)育的加速可能會(huì)對(duì)其產(chǎn)生不利的影響，因此今后還需要進(jìn)一步的研究CBZ加速斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的具體機(jī)制。

在正常的生理?xiàng)l件下，生物體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而一旦這種平衡被打破(ROS過(guò)量生成)，就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激[23-24]。生物體抗氧化系統(tǒng)中的抗氧化酶和抗氧化劑在清除ROS方面具有重要作用[25]，而抗氧化酶活性和抗氧化劑含量的改變能夠誘導(dǎo)氧化損傷[26]。其中，SOD和CAT在生物體抗氧化系統(tǒng)防御氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，前者負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)氧自由基(O2-)轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫(H2O2)和分子氧(O2)，后者隨后將H2O2轉(zhuǎn)化為水(H2O)和O2[23-24]。SOD和CAT活性的增加表明這2種酶能夠清除機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)量ROS，而SOD和CAT的活性降低表明機(jī)體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到了損傷[24,27-28]。脂質(zhì)過(guò)氧化是ROS在機(jī)體內(nèi)引起的最常見(jiàn)的細(xì)胞損傷，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的主要生物指標(biāo)之一[23,25-26]。當(dāng)生物體內(nèi)的ROS含量超過(guò)抗氧化酶的清除能力時(shí)，過(guò)量的ROS就會(huì)刺激MDA的產(chǎn)生[6,29]。MDA是生物體內(nèi)O2-與多不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)后形成的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其濃度水平可作為機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)[23,25-26]。

在本研究中，斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦內(nèi)的SOD活性在1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ暴露下均顯著增加，CAT活性僅在1 μg·L-1CBZ暴露下顯著增加，但是2種濃度的CBZ暴露均未引起斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織中MDA水平出現(xiàn)顯著性變化，表明2種CBZ濃度暴露下的斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦組織受到了輕微的氧化損傷，而幼魚(yú)腦組織中的抗氧化系統(tǒng)能夠通過(guò)提高抗氧化酶的活性減弱氧化損傷。另外，斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟中的SOD活性僅在1 μg·L-1CBZ暴露下顯著降低，幼魚(yú)肝臟中CAT活性和MDA含量在1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ暴露下均顯著增加，表明2種CBZ濃度暴露下的斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟均受到了嚴(yán)重的氧化損傷。肝臟是生物體排毒的主要器官，具有高度的代謝活性[30-31]，可能比其他組織暴露在更高水平的藥品中，因此斑馬魚(yú)的肝臟受到的氧化損傷相比于腦組織更加嚴(yán)重。根據(jù)已有報(bào)道，生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的激活與化合物誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的降低有關(guān)[32-33]。因此，本研究中1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ處理組對(duì)斑馬魚(yú)腦組織和肝臟引起的氧化損傷可能與2種濃度的CBZ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性效應(yīng)有關(guān)，這需要進(jìn)一步的研究。由于斑馬魚(yú)幼魚(yú)的肝臟受到了嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，引起ROS在肝臟中積累，可能對(duì)蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子造成損傷，從而影響斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟的正常生理功能[25,34]。此外，已有相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道了環(huán)境相關(guān)濃度的CBZ對(duì)斑馬魚(yú)的氧化應(yīng)激效應(yīng)[16,32]。例如，da Silva Santos等[16]發(fā)現(xiàn)10 μg·L-1CBZ的慢性暴露(63 d)能夠引起斑馬魚(yú)成魚(yú)腮、腸道和肝臟中的抗氧化酶(CAT和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)活性顯著改變[16]。不僅如此，CBZ也能夠引起其他的水生生物產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)[6,35]。例如，Chen等[6]報(bào)道了0.5～50 μg·L-1CBZ的慢性暴露(30 d)能夠引起河蜆(Corbiculafluminea)腮和消化腺中的抗氧化酶(SOD、CAT和谷胱甘肽還原酶)活性和氧化產(chǎn)物(MDA)濃度改變。此外，本研究中10 μg·L-1CBZ的慢性暴露(28 d)能夠顯著誘導(dǎo)斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟內(nèi)的CAT活性，但da Silva Santos等[16]發(fā)現(xiàn)10 μg·L-1CBZ的慢性暴露(63 d)能夠顯著抑制斑馬魚(yú)成魚(yú)肝臟內(nèi)的CAT活性，筆者推測(cè)這可能與較長(zhǎng)時(shí)間的CBZ暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)肝臟內(nèi)氧化損傷(ROS產(chǎn)生過(guò)量所致)的加重有關(guān)，CAT受到損傷(活性降低)無(wú)法發(fā)揮正常的作用。綜上所述，本研究結(jié)果表明，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ的慢性暴露均導(dǎo)致斑馬魚(yú)幼魚(yú)的腦組織和肝臟產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，但是斑馬魚(yú)幼魚(yú)的肝臟產(chǎn)生的氧化應(yīng)激效應(yīng)相比于腦組織更為嚴(yán)重，可能會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)產(chǎn)生一些不利的影響。

AChE能夠降解突觸間隙中的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，在生物體內(nèi)神經(jīng)信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，被廣泛用作神經(jīng)毒性檢測(cè)的生化標(biāo)記物[36-37]。在本研究中10 μg·L-1CBZ的慢性暴露能夠顯著抑制斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦內(nèi)的AChE活性，表明10 μg·L-1CBZ能夠干擾幼魚(yú)腦內(nèi)的膽堿能系統(tǒng)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)。另外，已有相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道了環(huán)境相關(guān)濃度的CBZ暴露(急性暴露)對(duì)水生生物體內(nèi)AChE活性的抑制作用[38-39]。例如Juhel等[39]發(fā)現(xiàn)0.096 μg·L-1CBZ的急性暴露(7 d)能夠顯著抑制貽貝(Pernaviridis)無(wú)細(xì)胞血淋巴中的AChE活性。然而，da Silva Santos等[16]報(bào)道了10 μg·L-1CBZ的慢性暴露(63 d)能夠引起斑馬魚(yú)成魚(yú)頭部的AChE活性增加。筆者推測(cè)da Silva Santos等的結(jié)果與本文研究結(jié)果不一致的原因可能與不同時(shí)長(zhǎng)CBZ暴露下對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的毒性效應(yīng)有關(guān)，即不同時(shí)長(zhǎng)的CBZ暴露在斑馬魚(yú)體內(nèi)的毒性作用可能存在差異。例如，Rhee等[40]將朝鮮臂尾輪蟲(chóng)(Brachionuskoreanus)暴露在100 μg·L-1和1 000 μg·L-1CBZ中12 h和24 h，發(fā)現(xiàn)2種濃度的CBZ僅在暴露24 h后對(duì)輪蟲(chóng)體內(nèi)的AChE活性具有抑制效應(yīng)。在本研究中，10 μg·L-1CBZ引起斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦內(nèi)AChE活性降低，可能導(dǎo)致乙酰膽堿在腦內(nèi)的積累和膽堿能受體的過(guò)度刺激[41]。由于乙酰膽堿在調(diào)節(jié)生物體的運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)和記憶等方面發(fā)揮著重要作用[41-43]，因此10 μg·L-1CBZ可能對(duì)幼魚(yú)產(chǎn)生不利的影響。

Glu和GABA分別是脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，前者能夠介導(dǎo)生物體內(nèi)興奮性突觸傳遞，后者能夠介導(dǎo)生物體內(nèi)抑制性突觸傳遞[44-46]。興奮性(Glu)和抑制性(GABA)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡對(duì)生物體運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)和生物體內(nèi)外周信號(hào)的整合具有重要作用[45,47]。目前，CBZ的作用機(jī)制仍不清楚，可能與電子門(mén)控鈉離子通道相互作用，增強(qiáng)GABA的抑制作用，從而引起神經(jīng)細(xì)胞的興奮性降低[48-49]。在本研究中，1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ均引起斑馬魚(yú)幼魚(yú)腦內(nèi)的GABA濃度顯著增加，但腦內(nèi)的Glu濃度未出現(xiàn)顯著性變化，能夠?qū)е掠佐~(yú)腦內(nèi)興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞的不平衡，這可能與CBZ的作用機(jī)制有關(guān)。本研究結(jié)果表明，環(huán)境相關(guān)濃度下CBZ的慢性暴露能夠干擾幼魚(yú)腦內(nèi)的GABA能系統(tǒng)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。類似地，Chen等[50]發(fā)現(xiàn)0.5～50 μg·L-1CBZ的慢性暴露(30 d)能夠干擾河蜆(Corbiculafluminea)體內(nèi)(外套膜組織、腮、性腺和消化腺)的GABA能系統(tǒng)。由于GABA在調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物的生殖[51-52]和運(yùn)動(dòng)[45-46]方面發(fā)揮著重要作用，因此1 μg·L-1和10 μg·L-1CBZ可能會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)產(chǎn)生不利的影響。

綜上所述，環(huán)境相關(guān)濃度(1 μg·L-1和10 μg·L-1)CBZ的慢性暴露能夠促進(jìn)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育，誘導(dǎo)幼魚(yú)的腦組織和肝臟產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，且肝臟產(chǎn)生的氧化應(yīng)激效應(yīng)相比于腦組織更為顯著，同時(shí)CBZ暴露能夠干擾幼魚(yú)腦組織的膽堿能系統(tǒng)和GABA能系統(tǒng)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)。