楊淳翔，劉春生,*

1.湖北洪山實驗室，武漢 430070

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070

五氯苯酚(pentachlorophenol,PCP)由于具有良好的抑菌特性，廣泛用作除草劑、殺菌劑、防腐劑和防霉劑等，其生產(chǎn)和使用過程中不可避免地會釋放到環(huán)境中，在各種環(huán)境介質(zhì)中被高頻檢出[1]。水環(huán)境是污染物的最終歸宿地，PCP主要是通過農(nóng)業(yè)污水、生活污水以及徑流方式排放到水體中。有研究對中國七大流域水體中PCP進行全面調(diào)查，在600多個采樣點地表水中有85.4%檢測出PCP，濃度中位數(shù)為50 ng·L-1，其中洞庭湖水體PCP的濃度最高，為103.7 μg·L-1；與此同時水體沉積物中檢測出PCP濃度范圍為0.01～178.19 ng·g-1(以干質(zhì)量計)[2]。在美國的一個木材加工廠附近地表水和地下水中檢測出PCP濃度可達0.07～31.9 μg·L-1和3～23 μg·L-1[3]。所以PCP對于水生生物的危害不可忽視。先前的研究主要關(guān)注PCP對于魚類的富集和毒性效應(yīng)，例如Li等[4]在底特律河附近的多種遠洋魚類血漿中檢出PCP，其濃度范圍為0.21～1.62 ng·g-1(以濕質(zhì)量計)。有研究發(fā)現(xiàn)在0.1～1 000 μg·L-1PCP暴露下，斑馬魚(Daniorerio)的突觸素Ⅰ (synaptophysin,SYN)、碘甲腺原氨酸脫碘酶Ⅲ型(recombinant deiodinase,iodothyronine,type Ⅲ,DIO3)、甲狀腺激素受體α(thyroid hormone receptorα,Thr-α)和甲狀腺激素受體β(thyroid hormone receptorβ,Thr-β)的相對mRNA表達量增加，這表明，PCP暴露可能會影響魚類中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的時間和協(xié)調(diào)性，并通過干擾甲狀腺激素調(diào)節(jié)途徑改變甲狀腺激素水平[5]。魚類處于水生食物網(wǎng)的頂端，屬于高級消費者，然而現(xiàn)有研究鮮有關(guān)注PCP對于水生態(tài)系統(tǒng)初級消費者的影響。并且，目前PCP在全球自然水體中的濃度通常從幾ng·L-1到幾十μg·L-1不等[6-7]，而現(xiàn)有關(guān)于PCP對水生生物毒理學(xué)的研究大都采用高濃度暴露，環(huán)境濃度毒理學(xué)研究相對匱乏。因此，急需開展環(huán)境相關(guān)濃度PCP對低營養(yǎng)級水生生物的毒性評估研究。

大型溞(Daphniamagna)是一種典型的浮游甲殼動物，在水生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布，作為初級消費者，其在水生食物網(wǎng)中占據(jù)重要位置，并且擁有重要的生態(tài)位，由于其對環(huán)境污染物比較敏感，已被用作生態(tài)毒理學(xué)研究中的模式生物[8-13]。先前有學(xué)者開展了PCP對于大型溞的毒性研究，發(fā)現(xiàn)0.0002～0.02 μmol·L-1PCP暴露大型溞21 d后，其可以顯著影響大型溞的母代和子代體長，說明其對大型溞可能具有發(fā)育毒性及生殖毒性[14]。但是水生生物終生生活在水中，所以其應(yīng)該一直處于暴露當(dāng)中，但是部分生命周期的暴露實驗，無法更加真實、準確、全面地反映污染物對水生生物的毒性效應(yīng)，以至于在污染物評價中由于暴露時間不夠而忽視了污染物的生態(tài)風(fēng)險。基于大型溞壽命較短(50～80 d)的特點，本研究嘗試開展大型溞的全生命周期PCP暴露實驗，最終探究環(huán)境相關(guān)濃度PCP對于大型溞的影響。

綜上所述，本研究以模式生物大型溞為受試物種，在環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露條件下，探尋對大型溞存活、生長、生殖、心率、行為和基因表達的影響，并比較大型溞部分生命周期暴露和全生命周期暴露的毒性效應(yīng)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗試劑

五氯酚鈉(sodium pentachlorophenol,PCP-Na)購自Ehrenstorfer公司(德國)，純度99.9%。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自Sigma-Aldrich公司(美國)，純度99.9%。TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑盒購自Takara公司(中國)。本研究中使用的其他試劑均為分析純級。

1.2 PCP暴露液的配制

用萬分之一天平準確稱取一定量的PCP于玻璃瓶內(nèi)，記錄質(zhì)量，溶于DMSO，配制成母液，隨后使用DMSO將母液按照梯度稀釋的方法，依次稀釋得到1 500、150、15和1.5 mg·L-1的母液。分別取10 μL母液加入到100 mL的暴露液中，即可分別得到PCP暴露濃度為150、15、1.5和0.15 μg·L-1的暴露體系，對照組中加入等體積的DMSO作溶劑對照，每個濃度設(shè)置3個平行暴露裝置。DMSO在暴露液中體積占比為0.01%。

1.3 大型溞的實驗室培養(yǎng)

大型溞的培養(yǎng)方法基于先前文獻報道[15]。簡言之，大型溞在溫度(22±1) ℃，光照周期為16 h光照∶8 h黑暗的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。大型溞養(yǎng)殖水為連續(xù)曝氣48 h以上的過濾自來水。自來水的過濾系統(tǒng)使用安吉爾J1205-ROB12型凈水器(中國)。用小球藻(Chlorellavulgaris)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)混合飼喂大型溞。大型溞開始生殖前的喂食密度為2.5×106cells·mL-1(培養(yǎng)液)，開始生殖后喂食密度增加至5.0×106cells·mL-1(培養(yǎng)液)。在本實驗的培養(yǎng)條件下，大型溞只營孤雌生殖。細胞密度的統(tǒng)計采用的是Nexcelom Cellometer全自動細胞計數(shù)儀(美國)。大型溞每天飼喂1次，每隔1 d更換1次養(yǎng)殖水。

1.4 PCP全生命周期暴露及取樣

本研究使用環(huán)境濃度的PCP開展暴露實驗，濃度分別為0、0.15、1.5、15和150 μg·L-1，以溶劑對照作為空白對照，每個濃度設(shè)置3個平行暴露裝置。每個平行50只出生時間<12 h的幼溞，養(yǎng)殖密度為50 個·L-1。每天上午喂食新鮮的小球藻與斜生柵藻的混合液，每次換水完成后在培養(yǎng)箱內(nèi)隨機擺放燒杯的位置，以排除光照不勻等因素對實驗造成的誤差。每天記錄每個燒杯幼溞的存活個體數(shù)，計算累積產(chǎn)溞數(shù)和存活率。由于PCP的暴露導(dǎo)致了大型溞的死亡，累積產(chǎn)溞數(shù)用大型溞的存活個體數(shù)進行修正?；谙惹按笮蜏腥芷诘幕瘜W(xué)品發(fā)育生殖毒性評估方法[16]，將其全生命周期分為出生、生長、生殖和衰亡4個生命階段，由于第62天時其種群基本消亡，而第46天時大型溞的存活率開始下降，因此選擇在大型溞的生長階段(第21天)、生殖階段(第32天)和衰亡階段(第46天)測量其體長、心率和平均游泳速度，并在暴露的第32天和第46天時收集大型溞樣品，并加入TRIzol試劑，然后勻漿，并置于-80 ℃下保存以用于基因表達的分析。用Leica DMIRB型顯微鏡(德國)測量體長。將Camtasia Studio與Leica DMIRB連接，通過錄制視頻(50 fps)來測定大型溞的心率，通過用慢速度播放視頻，統(tǒng)計60 s內(nèi)大型溞的心率。平均游泳速度參數(shù)使用NOLDUS公司的Ethovision XT 13軟件(荷蘭)測量，監(jiān)測大型溞1 h內(nèi)的游泳活動，并對其平均速度進行分析。

1.5 水樣中PCP含量的測定

在暴露實驗的中間階段采集水樣，以確定PCP的暴露濃度。在換水前后的每個暴露組和對照組中收集暴露液。前處理方法為：將1 mL水樣與10 μL甲酸混合，加入二氯甲烷萃取，然后將收集的有機層溶液轉(zhuǎn)移到2 mL棕色進樣瓶中。重復(fù)上述操作，將收集的有機層溶液合并，并使用氮氣將其吹干。最后將樣品重新溶解在200 μL色譜純甲醇中[17]。使用Waters公司的超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Acquity UPLC I-Class Plus/Xevo TQ-XS MS) (美國)進行定量分析。色譜柱為ACQUITY UPLC?C18 (粒徑1.8 μm，2.1 mm×100 mm) (美國)，流動相為10 mmol·L-1醋酸銨(A)和甲醇(B)，流速為0.3 mL·min-1。負極模式下ESI源如下：離子噴霧(ion spray,IS)電壓為-4 500 V，氣簾氣體(curtain gas,CUR)為137 895 Pa，氮氣碰撞氣體(nitrogen collision gas,CAD)為55 158 Pa，霧化氣體(nebulizer gas,GS1)為275 790 Pa，輔助氣體(auxiliary gas,GS2)為275 790 Pa，離子源溫度為400 ℃，PCP的檢出限為1.92 μg·L-1，信噪比為3。

1.6 基因表達檢測

根據(jù)先前建立的大型溞階段特異性PCR array，探究可能的致毒機制，其中包含調(diào)控大型溞生殖的5條關(guān)鍵代謝通路的24個基因，調(diào)控大型溞衰亡的5條關(guān)鍵代謝通路的17個基因[16]。本研究分別用PCP暴露第32天和第46天所取得的樣品來探究PCP對大型溞生殖階段和衰亡階段關(guān)鍵代謝通路中基因表達的影響。這10條代謝通路名稱及包含的基因如表1所示。

表1 大型溞的階段特異性PCR array包含的代謝通路和基因Table 1 List of genes and corresponding pathways in the stage-specific PCR array of D. magna

使用Takara公司的TRIzol試劑盒，并按照使用說明分離樣品的總RNA。檢測RNA的純度和濃度，提取總RNA 500 ng，使用Takara公司的Prime Script RT試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA合成后，使用Takara公司的SYBR Green PreMix Ex TaqII試劑盒進行實時定量PCR。用熔解曲線和標準曲線分別評價PCR反應(yīng)的質(zhì)量保證(quantity assurance,QA)和質(zhì)量控制(quality control,QC)。基因bal2 (蛋白DAPPUDRAFT2_311135)在大型溞不同發(fā)育階段和不同暴露組中表達穩(wěn)定，因此作為內(nèi)參基因使用[16]。使用Primer Premier 6軟件(加拿大)設(shè)計基因的引物序列。本研究中使用的所有引物的擴增效率為95%～103%[16]。RT-qPCR反應(yīng)擴增程序為：95 ℃，2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共擴增40個循環(huán)；60 ℃、10 min。目的基因的表達分析采用2-ΔΔCT法進行相對表達量的分析[18]。每個濃度設(shè)置3個平行組。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用的軟件是SPSS 25.0(美國，紐約，阿蒙克)，數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和同質(zhì)性分別使用Kolmogorov-Smirnov和Levene’s檢驗，在必要時將數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。暴露組與對照組之間差異性的檢驗使用的是單因素方差分析法(one-way analysis of variance,ANOVA)，相關(guān)性分析采用Spearman分析法。在本實驗中所有分析的顯著性水平設(shè)置為P<0.05。使用GraphPad Prism 8.0(美國，加利福尼亞，圣地亞哥)繪制統(tǒng)計圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 暴露液中PCP的含量測定

PCP的名義濃度分別為0、0.15、1.5、15和150 μg·L-1。實測中，換水前不同暴露組PCP濃度分別為(0.01±0.01)、(0.17±0.02)、(1.75±0.01)、(17.39±0.78)和(166.22±8.47) μg·L-1，換水后不同暴露組PCP濃度分別為(0.01±0.01)、(0.17±0.01)、(1.72±0.07)、(16.29±1.30)和(165.95±14.66) μg·L-1。在換水前后沒有觀察到PCP的嚴重損失，PCP的平均濃度分別是(0.01±0.01)、(0.17±0.02)、(1.74±0.05)、(16.84±1.13)和(166.11±9.47) μg·L-1(圖1)。

圖1 換水前后暴露體系中五氯苯酚(PCP)的名義濃度和實測濃度注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標準差，每個濃度有3個平行組。Fig.1 Nominal and measured concentrations of pentachlorophenol (PCP) in the exposure medium before and after water renewingNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks.

2.2 PCP全生命周期暴露對大型溞存活、生長和生殖的影響

PCP暴露對大型溞存活的影響如圖2所示。(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露后第42天，大型溞的存活率顯著下降，第63天時大型溞種群消亡，而對照組和其他暴露組在第70天時大型溞才出現(xiàn)全部死亡的情況。該結(jié)果表明隨著暴露時間的延長，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露使大型溞的壽命顯著縮短。

圖2 不同濃度PCP全生命周期暴露對大型溞存活率的影響注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標準差，每個濃度有3個平行組；*代表P<0.05，表示與對照組相比有顯著差異。Fig.2 Effects of different concentrations of PCP on survival rate of D. magna after the whole-life-stage exposureNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

環(huán)境相關(guān)濃度PCP全生命周期暴露顯著抑制了大型溞的生長。在第32天和第46天，大型溞的體長在(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露組與對照組相比出現(xiàn)顯著降低，分別降低至(2.845±0.042) mm和(2.985±0.032) mm。而(1.74±0.05) μg·L-1和(0.17±0.02) μg·L-1的PCP暴露對其第21天的體長沒有顯著影響。PCP暴露對大型溞生長的LOEC在第

32天和第46天均為(166.11±9.47) μg·L-1(圖3)。本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對大型溞具有一定的發(fā)育毒性。

圖3 不同濃度PCP全生命周期暴露對大型溞體長的影響注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標準差，每個濃度有3個平行組；*代表P<0.05，表示與對照組相比有顯著差異。Fig.3 Effects of different concentrations of PCP on body length of D. magna after the whole-life-stage exposureNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

環(huán)境相關(guān)濃度的PCP暴露除了對大型溞的存活和生長具有抑制作用外，同時也能顯著抑制其生殖。暴露于不同濃度的PCP并沒有顯著改變大型溞的累積產(chǎn)溞數(shù)(圖4(a))，但(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露顯著降低大型溞子代的體長，在暴露的第21天，大型溞子代體長從對照組的(0.828±0.006) mm降至(0.733±0.019) mm；在第32天，其子代體長從對照組的(0.839±0.033) mm降至(0.771±0.018) mm；在第46天，其子代體長從對照組的(0.844±0.013) mm降至(0.780±0.014) mm (圖4(b))。此外，PCP暴露對幼溞體長的LOEC由第21天和第32天的(166.11±9.47) μg·L-1降至第46天的(16.84±1.13) μg·L-1。該結(jié)果說明環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露能對大型溞造成一定生殖毒性。

圖4 PCP全生命周期暴露對大型溞生殖的影響:大型溞全生命周期的累積產(chǎn)溞數(shù)(a)和子代體長(b)注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標準差，每個濃度有3個平行組；*代表P<0.05，表示與對照組相比有顯著差異。Fig.4 Effects of PCP on reproduction of D. magna after the whole-life-stage exposure:The accumulated offspring number (a) and neonate body length (b)Note:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

2.3 PCP全生命周期暴露對大型溞心率和游泳行為的影響

在心率方面，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對不同生命階段大型溞的心率影響不同。在生長階段(第21天)和生殖階段(第32天)，不同濃度的PCP暴露均能顯著促進其心率上升；而在衰亡階段(第46天)，對照組的心率為(312.31±7.416) beat·min-1，(16.84±1.13) μg·L-1和(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露對其心率產(chǎn)生顯著的抑制效應(yīng)，心率分別為(290.07±5.882) beat·min-1和(276.91±6.000) beat·min-1(圖5)。

圖5 不同濃度PCP全生命周期暴露對大型溞心率的影響注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標準差，每個濃度有3個平行組；*代表P<0.05，表示與對照組相比有顯著差異。Fig.5 Effects of different concentrations of PCP on heart rate of D. magna after the whole-life-stage exposureNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

對于大型溞的游泳行為，(1.74±0.05) μg·L-1和(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露顯著降低了大型溞各取樣時間點的平均游泳速度，而暴露于(16.84±1.13) μg·L-1PCP組的大型溞的平均游泳速度僅在第21天和第46天出現(xiàn)顯著降低。各取樣時間點的LOEC均為(1.74±0.05) μg·L-1(圖6)。本研究的結(jié)果表明，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露能夠?qū)Υ笮蜏械挠斡拘袨樵斐梢欢ǖ囊种谱饔谩?/p>

圖6 不同濃度PCP全生命周期暴露對大型溞平均游泳速度的影響注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標準差，每個濃度有3個平行組；*代表P<0.05，表示與對照組相比有顯著差異。Fig.6 Effects of different concentrations of PCP on average swim speed of D. magna after the whole-life-stage exposure Note:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

2.4 PCP全生命周期暴露對大型溞基因表達的影響

調(diào)控大型溞生殖階段的5條關(guān)鍵代謝通路包含的24個基因，在PCP暴露的第32天，并沒有引起大型溞相關(guān)基因的表達量發(fā)生顯著性變化(圖7)。調(diào)控大型溞衰亡階段的5條關(guān)鍵代謝通路包含的17個基因，在暴露的第46天，(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露引起大型溞衰亡階段的13個基因表達量顯著上調(diào)，其中基因主要富集在γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能突觸、擴張型心肌病、神經(jīng)活性配體-受體相互作用和血清素能突觸4條通路上。較低濃度組(16.84±1.13)、(1.74±0.05)和(0.17±0.02) μg·L-1的PCP暴露并沒有引起大型溞衰亡階段相關(guān)基因的表達量發(fā)生顯著性變化(圖8)。

圖7 不同濃度的PCP暴露32 d后，大型溞生殖階段關(guān)鍵代謝通路中基因的表達量注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標準差，每個濃度有3個平行組；*代表P<0.05，表示與對照組相比有顯著差異。Fig.7 Effects of different concentrations of PCP on the expression of genes selected at the reproduction stage of D. magna after exposure for 32 dNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

圖8 不同濃度的PCP暴露46 d后，大型溞衰亡階段關(guān)鍵代謝通路中基因的表達量注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標準差，每個濃度有3個平行組。Fig.8 Effects of different concentrations of PCP on the expression of genes selected at the death stage of D. magna after exposure for 46 dNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks.

2.5 相關(guān)分析

通過分析大型溞衰亡階段的心率、平均游泳速度和基因表達量的相關(guān)性(表2)，發(fā)現(xiàn)與大型溞衰亡階段有關(guān)的13個顯著上調(diào)的基因中有8個與心率和平均游泳速度顯著相關(guān)(P<0.05)。并且，平均游泳速度與心率呈顯著相關(guān)(P<0.01)。

表2 大型溞衰亡階段心率、平均游泳速度和基因表達量的Spearman相關(guān)分析Table 2 Spearman correlation analysis of heart rate,average swimming speed and gene expression in the stage of death of Daphnia magna

3 討論(Discussion)

本研究中，采用的PCP暴露濃度均為環(huán)境相關(guān)濃度，在換水前后PCP的暴露濃度沒有發(fā)生顯著變化，說明PCP基本沒有發(fā)生降解，暴露體系是可靠的。環(huán)境相關(guān)濃度的PCP暴露導(dǎo)致了大型溞群體的過早死亡。相比之下，一項研究表明，暴露于746 μg·L-1的PCP也顯著降低了大型溞的存活率，使其壽命縮短[19]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露顯著抑制了大型溞的體長。先前有研究報道PCP的發(fā)育毒性，Chen等[20]發(fā)現(xiàn)532.66 μg·L-1或更高濃度的PCP 21 d暴露顯著降低了大型溞的體長。值得注意的是，在本研究中PCP在第21天的暴露后才對大型溞的生長造成了抑制，而不是在快速生長階段(0～12 d)產(chǎn)生抑制，這可能是由于PCP對大型溞蛻皮過程的抑制所致，蛻皮是控制大型溞生長發(fā)育的重要生理過程，發(fā)生在其全生命周期中[21]。另外，最近的研究表明，PCP可以顯著下調(diào)土壤跳蟲白符跳(Folsomiacandida)蛻皮相關(guān)基因的表達量[22]，但PCP對大型溞生長的抑制作用是否與其蛻皮過程有關(guān)，有待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境相關(guān)濃度PCP的暴露顯著抑制了大型溞的子代體長，而沒有顯著改變子代的數(shù)量，推測可能是大型溞在抵御PCP暴露的壓力上投入了更多的能量，而分配給生殖的能量較少，從而產(chǎn)生了較小的幼溞。這一假設(shè)得到了前人研究的支持[23-25]。例如，由于能量資源重新分配帶來的負反饋適應(yīng)結(jié)果，在長期鎘(Cd)暴露后，大型溞的子代數(shù)量顯著下降。同時，上述結(jié)果也表明，在大型溞的生殖指標中，生殖質(zhì)量可能比生殖數(shù)量更加敏感，這與先前的研究結(jié)果相一致[15]。綜上所述，環(huán)境相關(guān)濃度的PCP暴露對大型溞的生長和存活率有顯著抑制作用，且隨著暴露時間的延長，PCP暴露對大型溞造成發(fā)育毒性、生殖毒性和存活率的LOEC出現(xiàn)降低，與部分生命周期暴露相比，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對其全生命周期生長、生殖和存活率影響更加明顯，這與先前關(guān)于環(huán)境相關(guān)濃度磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCIPP)對大型溞生長、生殖和存活率影響的結(jié)果相一致[15-16]，以上結(jié)果說明了天然水域中PCP可能會對壽命短并且全生命周期生活于自然水體中的浮游動物造成潛在風(fēng)險。

據(jù)報道，大型溞的肌源性心臟結(jié)構(gòu)與人類心臟較為相似，對外源化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)與人類心臟也有相似之處，在一些研究中，大型溞的心率常被用作生理效應(yīng)的指標[26-28]。有研究發(fā)現(xiàn)，大量的外源化學(xué)物質(zhì)會對大型溞的心率產(chǎn)生顯著影響[29-31]。心率的變化可能反映了污染物對水生動物能量代謝和血液循環(huán)系統(tǒng)的影響[29]。而化學(xué)物質(zhì)對大型溞心率的影響并不總是一致的。例如，在20 mg·L-1甲醛和25 mg·L-1四氫嘧啶的混合暴露體系中，隨著暴露時間的增加，大型溞的心率顯著降低[32]。而暴露于0.1 mmol·L-1尼古丁會導(dǎo)致其心率顯著增加[33]。在本研究中，心率是一個相對敏感的參數(shù)，PCP暴露對大型溞心率的LOEC為(0.17±0.02) μg·L-1，這表明暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的PCP對大型溞的心率具有顯著影響，因此，推測大型溞的心率可能對PCP較為敏感。游泳速度在浮游動物中是一個重要的行為參數(shù)。先前的研究表明，PCP能夠改變浮游動物的游泳行為[34-36]。最近的一項研究表明，暴露于0.8 mg·L-1的PCP 3 h可劑量依賴性地抑制大型溞的趨光行為[34]，而暴露于190 mg·L-1的PCP 48 h可導(dǎo)致淡水輪蟲的游泳速度受到抑制[35]。此外，在污染物PCP的脅迫下，蚤狀溞(Daphniapulex)的游動速度也有所下降[36]。這些結(jié)果與本研究結(jié)果是一致的。此外，有研究發(fā)現(xiàn)大型溞的游泳速度隨體型的不同而不同，任何影響其體型的因素都會對游泳速度產(chǎn)生影響[13,37]。這與本研究中PCP暴露影響大型溞平均游泳速度與體長的關(guān)系結(jié)果一致，證實了其體型與游泳速度的直接關(guān)系。同時，大型溞的游動行為改變也影響著其捕食行為，從而可能增加其一定的饑餓死亡風(fēng)險[38]。綜上所述，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對大型溞的心率和游泳行為產(chǎn)生顯著影響，雖然與部分生命周期暴露相比，隨著暴露時間的延長，LOEC沒有出現(xiàn)降低的趨勢，但相較于生長和生殖指標LOEC顯示出更低的趨勢，這表明，大型溞的心率和游泳行為指標可能相比生長和生殖指標更為敏感。

在本研究中，(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露沒有顯著改變大型溞生殖階段多條關(guān)鍵信號通路中相關(guān)基因的表達，但是使大型溞衰亡階段多條關(guān)鍵信號通路中相關(guān)基因的表達量顯著上調(diào)，說明PCP可能會顯著影響大型溞死亡的基因調(diào)控，而對其生殖的調(diào)控較弱。與上述宏觀指標對比后也發(fā)現(xiàn)大型溞不同生命階段對PCP的敏感性有所不同，可能對其衰亡階段的影響更大。有研究顯示，擴張型心肌病是引起肌源性心臟功能紊亂導(dǎo)致心力衰竭的最常見原因，并能造成大型溞群體的過早死亡[39-41]，本研究中PCP的暴露顯著上調(diào)了大型溞擴張型心臟病通路相關(guān)基因的表達，進而可能造成其心臟功能紊亂，心率下降，最終導(dǎo)致其群體死亡時間提前，這也與大型溞存活率指標的結(jié)果相一致，但與其存活率下降的具體聯(lián)系仍需進一步研究。GABA是動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[35]。在無脊椎動物中，GABA介導(dǎo)的神經(jīng)控制周圍肌肉，而且總GABA的增加會導(dǎo)致心血管活動的減少，造成無脊椎動物的運動能力下降甚至死亡[36,42]。同形溞(Daphniasimilis)暴露于阿維菌素可導(dǎo)致其與GABA受體結(jié)合，激活突觸后膜上的氯離子通道，導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的超極化，從而抑制神經(jīng)沖動的傳遞[43]。血清素(serotonin)水平過高與動物心臟和肺部疾病有關(guān)，血清素能突觸在動物感知疼痛、運動和內(nèi)分泌等生理功能中發(fā)揮重要作用[37]。在甲殼類動物中，血清素能神經(jīng)元(serotonergic neuron)參與控制行為和代謝，有研究指出，通過增加大型溞體內(nèi)血清素水平，會導(dǎo)致其耐低氧能力降低、更加強烈的趨光行為以及基礎(chǔ)運動能力的減退，這不利于大型溞的捕食[44-45]。本研究中，PCP暴露導(dǎo)致大型溞GABA能突觸和血清素能突觸通路相關(guān)基因上調(diào)，可能干擾兩者突觸的功能，進而使大型溞GABA和血清素體內(nèi)水平上升，抑制了與其運動相關(guān)的神經(jīng)元活動，最終導(dǎo)致大型溞游泳距離的下降，但具體機制有待進一步研究。本研究將大型溞衰亡階段顯著上調(diào)的基因與心率、平均游泳速度進行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)呈彼此呈顯著負相關(guān)關(guān)系，說明與大型溞心臟病和神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的通路在衰亡階段確實與心率下降和游泳速度下降有關(guān)，但具體關(guān)聯(lián)機制需要進一步研究。因此，本實驗推測由于環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露導(dǎo)致與大型溞擴張型心肌病、血清素能突觸和GABA通路相關(guān)基因的表達量顯著上調(diào)，大型溞在衰亡階段心率下降可能與心臟功能障礙有關(guān)，引發(fā)其心力衰竭，加速其過早死亡；并且大型溞游泳運動能力下降可能與其神經(jīng)活動抑制有關(guān)，造成其捕食效率和躲避天敵的能力下降，最終兩者可能共同導(dǎo)致其種群發(fā)生過早消亡的情況。此外，神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中相關(guān)基因表達量也出現(xiàn)顯著上調(diào)，仍需要進一步研究其與大型溞存活率下降的關(guān)系。

綜上所述，本研究利用先前建立的基于大型溞全生命周期的化學(xué)品毒性評估方法[16]，研究PCP對大型溞暴露的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對大型溞的生殖、生長、存活、心率和游泳行為產(chǎn)生了負面影響，并且對大型溞心率和游泳行為負面影響更為明顯，這可能會導(dǎo)致大型溞引發(fā)心臟疾病，并且抑制運動相關(guān)的神經(jīng)元，造成其平均壽命的縮短以及基礎(chǔ)活動的減弱，使其群體過早死亡，致使大型溞種群衰退，最終對淡水生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性造成一定影響，推測可能的原因是大型溞衰亡階段關(guān)鍵通路的相關(guān)基因上調(diào)致使其心臟功能障礙并抑制了其神經(jīng)活動。此外，隨著暴露時間的延長，上述部分生理指標的LOEC呈下降趨勢，這表明，全生命周期暴露相較部分生命周期暴露顯示出更顯著的毒性效應(yīng)，因此全生命周期的毒性評估方法具有更好的環(huán)境風(fēng)險評價優(yōu)勢。