楊淳翔，劉春生,*

1.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070

五氯苯酚(pentachlorophenol,PCP)由于具有良好的抑菌特性，廣泛用作除草劑、殺菌劑、防腐劑和防霉劑等，其生產(chǎn)和使用過(guò)程中不可避免地會(huì)釋放到環(huán)境中，在各種環(huán)境介質(zhì)中被高頻檢出[1]。水環(huán)境是污染物的最終歸宿地，PCP主要是通過(guò)農(nóng)業(yè)污水、生活污水以及徑流方式排放到水體中。有研究對(duì)中國(guó)七大流域水體中PCP進(jìn)行全面調(diào)查，在600多個(gè)采樣點(diǎn)地表水中有85.4%檢測(cè)出PCP，濃度中位數(shù)為50 ng·L-1，其中洞庭湖水體PCP的濃度最高，為103.7 μg·L-1；與此同時(shí)水體沉積物中檢測(cè)出PCP濃度范圍為0.01～178.19 ng·g-1(以干質(zhì)量計(jì))[2]。在美國(guó)的一個(gè)木材加工廠附近地表水和地下水中檢測(cè)出PCP濃度可達(dá)0.07～31.9 μg·L-1和3～23 μg·L-1[3]。所以PCP對(duì)于水生生物的危害不可忽視。先前的研究主要關(guān)注PCP對(duì)于魚(yú)類的富集和毒性效應(yīng)，例如Li等[4]在底特律河附近的多種遠(yuǎn)洋魚(yú)類血漿中檢出PCP，其濃度范圍為0.21～1.62 ng·g-1(以濕質(zhì)量計(jì))。有研究發(fā)現(xiàn)在0.1～1 000 μg·L-1PCP暴露下，斑馬魚(yú)(Daniorerio)的突觸素Ⅰ (synaptophysin,SYN)、碘甲腺原氨酸脫碘酶Ⅲ型(recombinant deiodinase,iodothyronine,type Ⅲ,DIO3)、甲狀腺激素受體α(thyroid hormone receptorα,Thr-α)和甲狀腺激素受體β(thyroid hormone receptorβ,Thr-β)的相對(duì)mRNA表達(dá)量增加，這表明，PCP暴露可能會(huì)影響魚(yú)類中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的時(shí)間和協(xié)調(diào)性，并通過(guò)干擾甲狀腺激素調(diào)節(jié)途徑改變甲狀腺激素水平[5]。魚(yú)類處于水生食物網(wǎng)的頂端，屬于高級(jí)消費(fèi)者，然而現(xiàn)有研究鮮有關(guān)注PCP對(duì)于水生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)消費(fèi)者的影響。并且，目前PCP在全球自然水體中的濃度通常從幾ng·L-1到幾十μg·L-1不等[6-7]，而現(xiàn)有關(guān)于PCP對(duì)水生生物毒理學(xué)的研究大都采用高濃度暴露，環(huán)境濃度毒理學(xué)研究相對(duì)匱乏。因此，急需開(kāi)展環(huán)境相關(guān)濃度PCP對(duì)低營(yíng)養(yǎng)級(jí)水生生物的毒性評(píng)估研究。

大型溞(Daphniamagna)是一種典型的浮游甲殼動(dòng)物，在水生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布，作為初級(jí)消費(fèi)者，其在水生食物網(wǎng)中占據(jù)重要位置，并且擁有重要的生態(tài)位，由于其對(duì)環(huán)境污染物比較敏感，已被用作生態(tài)毒理學(xué)研究中的模式生物[8-13]。先前有學(xué)者開(kāi)展了PCP對(duì)于大型溞的毒性研究，發(fā)現(xiàn)0.0002～0.02 μmol·L-1PCP暴露大型溞21 d后，其可以顯著影響大型溞的母代和子代體長(zhǎng)，說(shuō)明其對(duì)大型溞可能具有發(fā)育毒性及生殖毒性[14]。但是水生生物終生生活在水中，所以其應(yīng)該一直處于暴露當(dāng)中，但是部分生命周期的暴露實(shí)驗(yàn)，無(wú)法更加真實(shí)、準(zhǔn)確、全面地反映污染物對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，以至于在污染物評(píng)價(jià)中由于暴露時(shí)間不夠而忽視了污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)?；诖笮蜏袎勖^短(50～80 d)的特點(diǎn)，本研究嘗試開(kāi)展大型溞的全生命周期PCP暴露實(shí)驗(yàn)，最終探究環(huán)境相關(guān)濃度PCP對(duì)于大型溞的影響。

綜上所述，本研究以模式生物大型溞為受試物種，在環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露條件下，探尋對(duì)大型溞存活、生長(zhǎng)、生殖、心率、行為和基因表達(dá)的影響，并比較大型溞部分生命周期暴露和全生命周期暴露的毒性效應(yīng)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

五氯酚鈉(sodium pentachlorophenol,PCP-Na)購(gòu)自Ehrenstorfer公司(德國(guó))，純度99.9%。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó))，純度99.9%。TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑盒購(gòu)自Takara公司(中國(guó))。本研究中使用的其他試劑均為分析純級(jí)。

1.2 PCP暴露液的配制

用萬(wàn)分之一天平準(zhǔn)確稱取一定量的PCP于玻璃瓶?jī)?nèi)，記錄質(zhì)量，溶于DMSO，配制成母液，隨后使用DMSO將母液按照梯度稀釋的方法，依次稀釋得到1 500、150、15和1.5 mg·L-1的母液。分別取10 μL母液加入到100 mL的暴露液中，即可分別得到PCP暴露濃度為150、15、1.5和0.15 μg·L-1的暴露體系，對(duì)照組中加入等體積的DMSO作溶劑對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行暴露裝置。DMSO在暴露液中體積占比為0.01%。

1.3 大型溞的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

大型溞的培養(yǎng)方法基于先前文獻(xiàn)報(bào)道[15]。簡(jiǎn)言之，大型溞在溫度(22±1) ℃，光照周期為16 h光照∶8 h黑暗的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。大型溞養(yǎng)殖水為連續(xù)曝氣48 h以上的過(guò)濾自來(lái)水。自來(lái)水的過(guò)濾系統(tǒng)使用安吉爾J1205-ROB12型凈水器(中國(guó))。用小球藻(Chlorellavulgaris)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)混合飼喂大型溞。大型溞開(kāi)始生殖前的喂食密度為2.5×106cells·mL-1(培養(yǎng)液)，開(kāi)始生殖后喂食密度增加至5.0×106cells·mL-1(培養(yǎng)液)。在本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件下，大型溞只營(yíng)孤雌生殖。細(xì)胞密度的統(tǒng)計(jì)采用的是Nexcelom Cellometer全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó))。大型溞每天飼喂1次，每隔1 d更換1次養(yǎng)殖水。

1.4 PCP全生命周期暴露及取樣

本研究使用環(huán)境濃度的PCP開(kāi)展暴露實(shí)驗(yàn)，濃度分別為0、0.15、1.5、15和150 μg·L-1，以溶劑對(duì)照作為空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行暴露裝置。每個(gè)平行50只出生時(shí)間<12 h的幼溞，養(yǎng)殖密度為50 個(gè)·L-1。每天上午喂食新鮮的小球藻與斜生柵藻的混合液，每次換水完成后在培養(yǎng)箱內(nèi)隨機(jī)擺放燒杯的位置，以排除光照不勻等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的誤差。每天記錄每個(gè)燒杯幼溞的存活個(gè)體數(shù)，計(jì)算累積產(chǎn)溞數(shù)和存活率。由于PCP的暴露導(dǎo)致了大型溞的死亡，累積產(chǎn)溞數(shù)用大型溞的存活個(gè)體數(shù)進(jìn)行修正。基于先前大型溞全生命周期的化學(xué)品發(fā)育生殖毒性評(píng)估方法[16]，將其全生命周期分為出生、生長(zhǎng)、生殖和衰亡4個(gè)生命階段，由于第62天時(shí)其種群基本消亡，而第46天時(shí)大型溞的存活率開(kāi)始下降，因此選擇在大型溞的生長(zhǎng)階段(第21天)、生殖階段(第32天)和衰亡階段(第46天)測(cè)量其體長(zhǎng)、心率和平均游泳速度，并在暴露的第32天和第46天時(shí)收集大型溞樣品，并加入TRIzol試劑，然后勻漿，并置于-80 ℃下保存以用于基因表達(dá)的分析。用Leica DMIRB型顯微鏡(德國(guó))測(cè)量體長(zhǎng)。將Camtasia Studio與Leica DMIRB連接，通過(guò)錄制視頻(50 fps)來(lái)測(cè)定大型溞的心率，通過(guò)用慢速度播放視頻，統(tǒng)計(jì)60 s內(nèi)大型溞的心率。平均游泳速度參數(shù)使用NOLDUS公司的Ethovision XT 13軟件(荷蘭)測(cè)量，監(jiān)測(cè)大型溞1 h內(nèi)的游泳活動(dòng)，并對(duì)其平均速度進(jìn)行分析。

1.5 水樣中PCP含量的測(cè)定

在暴露實(shí)驗(yàn)的中間階段采集水樣，以確定PCP的暴露濃度。在換水前后的每個(gè)暴露組和對(duì)照組中收集暴露液。前處理方法為：將1 mL水樣與10 μL甲酸混合，加入二氯甲烷萃取，然后將收集的有機(jī)層溶液轉(zhuǎn)移到2 mL棕色進(jìn)樣瓶中。重復(fù)上述操作，將收集的有機(jī)層溶液合并，并使用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞Ｗ詈髮悠分匦氯芙庠?00 μL色譜純甲醇中[17]。使用Waters公司的超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Acquity UPLC I-Class Plus/Xevo TQ-XS MS) (美國(guó))進(jìn)行定量分析。色譜柱為ACQUITY UPLC?C18 (粒徑1.8 μm，2.1 mm×100 mm) (美國(guó))，流動(dòng)相為10 mmol·L-1醋酸銨(A)和甲醇(B)，流速為0.3 mL·min-1。負(fù)極模式下ESI源如下：離子噴霧(ion spray,IS)電壓為-4 500 V，氣簾氣體(curtain gas,CUR)為137 895 Pa，氮?dú)馀鲎矚怏w(nitrogen collision gas,CAD)為55 158 Pa，霧化氣體(nebulizer gas,GS1)為275 790 Pa，輔助氣體(auxiliary gas,GS2)為275 790 Pa，離子源溫度為400 ℃，PCP的檢出限為1.92 μg·L-1，信噪比為3。

1.6 基因表達(dá)檢測(cè)

根據(jù)先前建立的大型溞階段特異性PCR array，探究可能的致毒機(jī)制，其中包含調(diào)控大型溞生殖的5條關(guān)鍵代謝通路的24個(gè)基因，調(diào)控大型溞衰亡的5條關(guān)鍵代謝通路的17個(gè)基因[16]。本研究分別用PCP暴露第32天和第46天所取得的樣品來(lái)探究PCP對(duì)大型溞生殖階段和衰亡階段關(guān)鍵代謝通路中基因表達(dá)的影響。這10條代謝通路名稱及包含的基因如表1所示。

表1 大型溞的階段特異性PCR array包含的代謝通路和基因Table 1 List of genes and corresponding pathways in the stage-specific PCR array of D. magna

使用Takara公司的TRIzol試劑盒，并按照使用說(shuō)明分離樣品的總RNA。檢測(cè)RNA的純度和濃度，提取總RNA 500 ng，使用Takara公司的Prime Script RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA合成后，使用Takara公司的SYBR Green PreMix Ex TaqII試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。用熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別評(píng)價(jià)PCR反應(yīng)的質(zhì)量保證(quantity assurance,QA)和質(zhì)量控制(quality control,QC)?；騜al2 (蛋白DAPPUDRAFT2_311135)在大型溞不同發(fā)育階段和不同暴露組中表達(dá)穩(wěn)定，因此作為內(nèi)參基因使用[16]。使用Primer Premier 6軟件(加拿大)設(shè)計(jì)基因的引物序列。本研究中使用的所有引物的擴(kuò)增效率為95%～103%[16]。RT-qPCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；60 ℃、10 min。目的基因的表達(dá)分析采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的分析[18]。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用的軟件是SPSS 25.0(美國(guó)，紐約，阿蒙克)，數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和同質(zhì)性分別使用Kolmogorov-Smirnov和Levene’s檢驗(yàn)，在必要時(shí)將數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。暴露組與對(duì)照組之間差異性的檢驗(yàn)使用的是單因素方差分析法(one-way analysis of variance,ANOVA)，相關(guān)性分析采用Spearman分析法。在本實(shí)驗(yàn)中所有分析的顯著性水平設(shè)置為P<0.05。使用GraphPad Prism 8.0(美國(guó)，加利福尼亞，圣地亞哥)繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 暴露液中PCP的含量測(cè)定

PCP的名義濃度分別為0、0.15、1.5、15和150 μg·L-1。實(shí)測(cè)中，換水前不同暴露組PCP濃度分別為(0.01±0.01)、(0.17±0.02)、(1.75±0.01)、(17.39±0.78)和(166.22±8.47) μg·L-1，換水后不同暴露組PCP濃度分別為(0.01±0.01)、(0.17±0.01)、(1.72±0.07)、(16.29±1.30)和(165.95±14.66) μg·L-1。在換水前后沒(méi)有觀察到PCP的嚴(yán)重?fù)p失，PCP的平均濃度分別是(0.01±0.01)、(0.17±0.02)、(1.74±0.05)、(16.84±1.13)和(166.11±9.47) μg·L-1(圖1)。

圖1 換水前后暴露體系中五氯苯酚(PCP)的名義濃度和實(shí)測(cè)濃度注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)濃度有3個(gè)平行組。Fig.1 Nominal and measured concentrations of pentachlorophenol (PCP) in the exposure medium before and after water renewingNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks.

2.2 PCP全生命周期暴露對(duì)大型溞存活、生長(zhǎng)和生殖的影響

PCP暴露對(duì)大型溞存活的影響如圖2所示。(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露后第42天，大型溞的存活率顯著下降，第63天時(shí)大型溞種群消亡，而對(duì)照組和其他暴露組在第70天時(shí)大型溞才出現(xiàn)全部死亡的情況。該結(jié)果表明隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露使大型溞的壽命顯著縮短。

圖2 不同濃度PCP全生命周期暴露對(duì)大型溞存活率的影響注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)濃度有3個(gè)平行組；*代表P<0.05，表示與對(duì)照組相比有顯著差異。Fig.2 Effects of different concentrations of PCP on survival rate of D. magna after the whole-life-stage exposureNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

環(huán)境相關(guān)濃度PCP全生命周期暴露顯著抑制了大型溞的生長(zhǎng)。在第32天和第46天，大型溞的體長(zhǎng)在(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露組與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著降低，分別降低至(2.845±0.042) mm和(2.985±0.032) mm。而(1.74±0.05) μg·L-1和(0.17±0.02) μg·L-1的PCP暴露對(duì)其第21天的體長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。PCP暴露對(duì)大型溞生長(zhǎng)的LOEC在第

32天和第46天均為(166.11±9.47) μg·L-1(圖3)。本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對(duì)大型溞具有一定的發(fā)育毒性。

圖3 不同濃度PCP全生命周期暴露對(duì)大型溞體長(zhǎng)的影響注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)濃度有3個(gè)平行組；*代表P<0.05，表示與對(duì)照組相比有顯著差異。Fig.3 Effects of different concentrations of PCP on body length of D. magna after the whole-life-stage exposureNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

環(huán)境相關(guān)濃度的PCP暴露除了對(duì)大型溞的存活和生長(zhǎng)具有抑制作用外，同時(shí)也能顯著抑制其生殖。暴露于不同濃度的PCP并沒(méi)有顯著改變大型溞的累積產(chǎn)溞數(shù)(圖4(a))，但(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露顯著降低大型溞子代的體長(zhǎng)，在暴露的第21天，大型溞子代體長(zhǎng)從對(duì)照組的(0.828±0.006) mm降至(0.733±0.019) mm；在第32天，其子代體長(zhǎng)從對(duì)照組的(0.839±0.033) mm降至(0.771±0.018) mm；在第46天，其子代體長(zhǎng)從對(duì)照組的(0.844±0.013) mm降至(0.780±0.014) mm (圖4(b))。此外，PCP暴露對(duì)幼溞體長(zhǎng)的LOEC由第21天和第32天的(166.11±9.47) μg·L-1降至第46天的(16.84±1.13) μg·L-1。該結(jié)果說(shuō)明環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露能對(duì)大型溞造成一定生殖毒性。

圖4 PCP全生命周期暴露對(duì)大型溞生殖的影響:大型溞全生命周期的累積產(chǎn)溞數(shù)(a)和子代體長(zhǎng)(b)注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)濃度有3個(gè)平行組；*代表P<0.05，表示與對(duì)照組相比有顯著差異。Fig.4 Effects of PCP on reproduction of D. magna after the whole-life-stage exposure:The accumulated offspring number (a) and neonate body length (b)Note:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

2.3 PCP全生命周期暴露對(duì)大型溞心率和游泳行為的影響

在心率方面，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對(duì)不同生命階段大型溞的心率影響不同。在生長(zhǎng)階段(第21天)和生殖階段(第32天)，不同濃度的PCP暴露均能顯著促進(jìn)其心率上升；而在衰亡階段(第46天)，對(duì)照組的心率為(312.31±7.416) beat·min-1，(16.84±1.13) μg·L-1和(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露對(duì)其心率產(chǎn)生顯著的抑制效應(yīng)，心率分別為(290.07±5.882) beat·min-1和(276.91±6.000) beat·min-1(圖5)。

圖5 不同濃度PCP全生命周期暴露對(duì)大型溞心率的影響注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)濃度有3個(gè)平行組；*代表P<0.05，表示與對(duì)照組相比有顯著差異。Fig.5 Effects of different concentrations of PCP on heart rate of D. magna after the whole-life-stage exposureNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

對(duì)于大型溞的游泳行為，(1.74±0.05) μg·L-1和(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露顯著降低了大型溞各取樣時(shí)間點(diǎn)的平均游泳速度，而暴露于(16.84±1.13) μg·L-1PCP組的大型溞的平均游泳速度僅在第21天和第46天出現(xiàn)顯著降低。各取樣時(shí)間點(diǎn)的LOEC均為(1.74±0.05) μg·L-1(圖6)。本研究的結(jié)果表明，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露能夠?qū)Υ笮蜏械挠斡拘袨樵斐梢欢ǖ囊种谱饔谩?/p>

圖6 不同濃度PCP全生命周期暴露對(duì)大型溞平均游泳速度的影響注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)濃度有3個(gè)平行組；*代表P<0.05，表示與對(duì)照組相比有顯著差異。Fig.6 Effects of different concentrations of PCP on average swim speed of D. magna after the whole-life-stage exposure Note:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

2.4 PCP全生命周期暴露對(duì)大型溞基因表達(dá)的影響

調(diào)控大型溞生殖階段的5條關(guān)鍵代謝通路包含的24個(gè)基因，在PCP暴露的第32天，并沒(méi)有引起大型溞相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著性變化(圖7)。調(diào)控大型溞衰亡階段的5條關(guān)鍵代謝通路包含的17個(gè)基因，在暴露的第46天，(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露引起大型溞衰亡階段的13個(gè)基因表達(dá)量顯著上調(diào)，其中基因主要富集在γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能突觸、擴(kuò)張型心肌病、神經(jīng)活性配體-受體相互作用和血清素能突觸4條通路上。較低濃度組(16.84±1.13)、(1.74±0.05)和(0.17±0.02) μg·L-1的PCP暴露并沒(méi)有引起大型溞衰亡階段相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著性變化(圖8)。

圖7 不同濃度的PCP暴露32 d后，大型溞生殖階段關(guān)鍵代謝通路中基因的表達(dá)量注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)濃度有3個(gè)平行組；*代表P<0.05，表示與對(duì)照組相比有顯著差異。Fig.7 Effects of different concentrations of PCP on the expression of genes selected at the reproduction stage of D. magna after exposure for 32 dNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks;* represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

圖8 不同濃度的PCP暴露46 d后，大型溞衰亡階段關(guān)鍵代謝通路中基因的表達(dá)量注：所有數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)濃度有3個(gè)平行組。Fig.8 Effects of different concentrations of PCP on the expression of genes selected at the death stage of D. magna after exposure for 46 dNote:Values are expressed as mean±SD,and each concentration group had three replicate tanks.

2.5 相關(guān)分析

通過(guò)分析大型溞衰亡階段的心率、平均游泳速度和基因表達(dá)量的相關(guān)性(表2)，發(fā)現(xiàn)與大型溞衰亡階段有關(guān)的13個(gè)顯著上調(diào)的基因中有8個(gè)與心率和平均游泳速度顯著相關(guān)(P<0.05)。并且，平均游泳速度與心率呈顯著相關(guān)(P<0.01)。

表2 大型溞衰亡階段心率、平均游泳速度和基因表達(dá)量的Spearman相關(guān)分析Table 2 Spearman correlation analysis of heart rate,average swimming speed and gene expression in the stage of death of Daphnia magna

3 討論(Discussion)

本研究中，采用的PCP暴露濃度均為環(huán)境相關(guān)濃度，在換水前后PCP的暴露濃度沒(méi)有發(fā)生顯著變化，說(shuō)明PCP基本沒(méi)有發(fā)生降解，暴露體系是可靠的。環(huán)境相關(guān)濃度的PCP暴露導(dǎo)致了大型溞群體的過(guò)早死亡。相比之下，一項(xiàng)研究表明，暴露于746 μg·L-1的PCP也顯著降低了大型溞的存活率，使其壽命縮短[19]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露顯著抑制了大型溞的體長(zhǎng)。先前有研究報(bào)道PCP的發(fā)育毒性，Chen等[20]發(fā)現(xiàn)532.66 μg·L-1或更高濃度的PCP 21 d暴露顯著降低了大型溞的體長(zhǎng)。值得注意的是，在本研究中PCP在第21天的暴露后才對(duì)大型溞的生長(zhǎng)造成了抑制，而不是在快速生長(zhǎng)階段(0～12 d)產(chǎn)生抑制，這可能是由于PCP對(duì)大型溞蛻皮過(guò)程的抑制所致，蛻皮是控制大型溞生長(zhǎng)發(fā)育的重要生理過(guò)程，發(fā)生在其全生命周期中[21]。另外，最近的研究表明，PCP可以顯著下調(diào)土壤跳蟲(chóng)白符跳(Folsomiacandida)蛻皮相關(guān)基因的表達(dá)量[22]，但PCP對(duì)大型溞生長(zhǎng)的抑制作用是否與其蛻皮過(guò)程有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境相關(guān)濃度PCP的暴露顯著抑制了大型溞的子代體長(zhǎng)，而沒(méi)有顯著改變子代的數(shù)量，推測(cè)可能是大型溞在抵御PCP暴露的壓力上投入了更多的能量，而分配給生殖的能量較少，從而產(chǎn)生了較小的幼溞。這一假設(shè)得到了前人研究的支持[23-25]。例如，由于能量資源重新分配帶來(lái)的負(fù)反饋適應(yīng)結(jié)果，在長(zhǎng)期鎘(Cd)暴露后，大型溞的子代數(shù)量顯著下降。同時(shí)，上述結(jié)果也表明，在大型溞的生殖指標(biāo)中，生殖質(zhì)量可能比生殖數(shù)量更加敏感，這與先前的研究結(jié)果相一致[15]。綜上所述，環(huán)境相關(guān)濃度的PCP暴露對(duì)大型溞的生長(zhǎng)和存活率有顯著抑制作用，且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，PCP暴露對(duì)大型溞造成發(fā)育毒性、生殖毒性和存活率的LOEC出現(xiàn)降低，與部分生命周期暴露相比，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對(duì)其全生命周期生長(zhǎng)、生殖和存活率影響更加明顯，這與先前關(guān)于環(huán)境相關(guān)濃度磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCIPP)對(duì)大型溞生長(zhǎng)、生殖和存活率影響的結(jié)果相一致[15-16]，以上結(jié)果說(shuō)明了天然水域中PCP可能會(huì)對(duì)壽命短并且全生命周期生活于自然水體中的浮游動(dòng)物造成潛在風(fēng)險(xiǎn)。

據(jù)報(bào)道，大型溞的肌源性心臟結(jié)構(gòu)與人類心臟較為相似，對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)與人類心臟也有相似之處，在一些研究中，大型溞的心率常被用作生理效應(yīng)的指標(biāo)[26-28]。有研究發(fā)現(xiàn)，大量的外源化學(xué)物質(zhì)會(huì)對(duì)大型溞的心率產(chǎn)生顯著影響[29-31]。心率的變化可能反映了污染物對(duì)水生動(dòng)物能量代謝和血液循環(huán)系統(tǒng)的影響[29]。而化學(xué)物質(zhì)對(duì)大型溞心率的影響并不總是一致的。例如，在20 mg·L-1甲醛和25 mg·L-1四氫嘧啶的混合暴露體系中，隨著暴露時(shí)間的增加，大型溞的心率顯著降低[32]。而暴露于0.1 mmol·L-1尼古丁會(huì)導(dǎo)致其心率顯著增加[33]。在本研究中，心率是一個(gè)相對(duì)敏感的參數(shù)，PCP暴露對(duì)大型溞心率的LOEC為(0.17±0.02) μg·L-1，這表明暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的PCP對(duì)大型溞的心率具有顯著影響，因此，推測(cè)大型溞的心率可能對(duì)PCP較為敏感。游泳速度在浮游動(dòng)物中是一個(gè)重要的行為參數(shù)。先前的研究表明，PCP能夠改變浮游動(dòng)物的游泳行為[34-36]。最近的一項(xiàng)研究表明，暴露于0.8 mg·L-1的PCP 3 h可劑量依賴性地抑制大型溞的趨光行為[34]，而暴露于190 mg·L-1的PCP 48 h可導(dǎo)致淡水輪蟲(chóng)的游泳速度受到抑制[35]。此外，在污染物PCP的脅迫下，蚤狀溞(Daphniapulex)的游動(dòng)速度也有所下降[36]。這些結(jié)果與本研究結(jié)果是一致的。此外，有研究發(fā)現(xiàn)大型溞的游泳速度隨體型的不同而不同，任何影響其體型的因素都會(huì)對(duì)游泳速度產(chǎn)生影響[13,37]。這與本研究中PCP暴露影響大型溞平均游泳速度與體長(zhǎng)的關(guān)系結(jié)果一致，證實(shí)了其體型與游泳速度的直接關(guān)系。同時(shí)，大型溞的游動(dòng)行為改變也影響著其捕食行為，從而可能增加其一定的饑餓死亡風(fēng)險(xiǎn)[38]。綜上所述，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對(duì)大型溞的心率和游泳行為產(chǎn)生顯著影響，雖然與部分生命周期暴露相比，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，LOEC沒(méi)有出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，但相較于生長(zhǎng)和生殖指標(biāo)LOEC顯示出更低的趨勢(shì)，這表明，大型溞的心率和游泳行為指標(biāo)可能相比生長(zhǎng)和生殖指標(biāo)更為敏感。

在本研究中，(166.11±9.47) μg·L-1的PCP暴露沒(méi)有顯著改變大型溞生殖階段多條關(guān)鍵信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)，但是使大型溞衰亡階段多條關(guān)鍵信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，說(shuō)明PCP可能會(huì)顯著影響大型溞死亡的基因調(diào)控，而對(duì)其生殖的調(diào)控較弱。與上述宏觀指標(biāo)對(duì)比后也發(fā)現(xiàn)大型溞不同生命階段對(duì)PCP的敏感性有所不同，可能對(duì)其衰亡階段的影響更大。有研究顯示，擴(kuò)張型心肌病是引起肌源性心臟功能紊亂導(dǎo)致心力衰竭的最常見(jiàn)原因，并能造成大型溞群體的過(guò)早死亡[39-41]，本研究中PCP的暴露顯著上調(diào)了大型溞擴(kuò)張型心臟病通路相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而可能造成其心臟功能紊亂，心率下降，最終導(dǎo)致其群體死亡時(shí)間提前，這也與大型溞存活率指標(biāo)的結(jié)果相一致，但與其存活率下降的具體聯(lián)系仍需進(jìn)一步研究。GABA是動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[35]。在無(wú)脊椎動(dòng)物中，GABA介導(dǎo)的神經(jīng)控制周圍肌肉，而且總GABA的增加會(huì)導(dǎo)致心血管活動(dòng)的減少，造成無(wú)脊椎動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力下降甚至死亡[36,42]。同形溞(Daphniasimilis)暴露于阿維菌素可導(dǎo)致其與GABA受體結(jié)合，激活突觸后膜上的氯離子通道，導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的超極化，從而抑制神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞[43]。血清素(serotonin)水平過(guò)高與動(dòng)物心臟和肺部疾病有關(guān)，血清素能突觸在動(dòng)物感知疼痛、運(yùn)動(dòng)和內(nèi)分泌等生理功能中發(fā)揮重要作用[37]。在甲殼類動(dòng)物中，血清素能神經(jīng)元(serotonergic neuron)參與控制行為和代謝，有研究指出，通過(guò)增加大型溞體內(nèi)血清素水平，會(huì)導(dǎo)致其耐低氧能力降低、更加強(qiáng)烈的趨光行為以及基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)能力的減退，這不利于大型溞的捕食[44-45]。本研究中，PCP暴露導(dǎo)致大型溞GABA能突觸和血清素能突觸通路相關(guān)基因上調(diào)，可能干擾兩者突觸的功能，進(jìn)而使大型溞GABA和血清素體內(nèi)水平上升，抑制了與其運(yùn)動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)元活動(dòng)，最終導(dǎo)致大型溞游泳距離的下降，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究將大型溞衰亡階段顯著上調(diào)的基因與心率、平均游泳速度進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)呈彼此呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明與大型溞心臟病和神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的通路在衰亡階段確實(shí)與心率下降和游泳速度下降有關(guān)，但具體關(guān)聯(lián)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)由于環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露導(dǎo)致與大型溞擴(kuò)張型心肌病、血清素能突觸和GABA通路相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，大型溞在衰亡階段心率下降可能與心臟功能障礙有關(guān)，引發(fā)其心力衰竭，加速其過(guò)早死亡；并且大型溞游泳運(yùn)動(dòng)能力下降可能與其神經(jīng)活動(dòng)抑制有關(guān)，造成其捕食效率和躲避天敵的能力下降，最終兩者可能共同導(dǎo)致其種群發(fā)生過(guò)早消亡的情況。此外，神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中相關(guān)基因表達(dá)量也出現(xiàn)顯著上調(diào)，仍需要進(jìn)一步研究其與大型溞存活率下降的關(guān)系。

綜上所述，本研究利用先前建立的基于大型溞全生命周期的化學(xué)品毒性評(píng)估方法[16]，研究PCP對(duì)大型溞暴露的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，環(huán)境相關(guān)濃度PCP暴露對(duì)大型溞的生殖、生長(zhǎng)、存活、心率和游泳行為產(chǎn)生了負(fù)面影響，并且對(duì)大型溞心率和游泳行為負(fù)面影響更為明顯，這可能會(huì)導(dǎo)致大型溞引發(fā)心臟疾病，并且抑制運(yùn)動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)元，造成其平均壽命的縮短以及基礎(chǔ)活動(dòng)的減弱，使其群體過(guò)早死亡，致使大型溞種群衰退，最終對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性造成一定影響，推測(cè)可能的原因是大型溞衰亡階段關(guān)鍵通路的相關(guān)基因上調(diào)致使其心臟功能障礙并抑制了其神經(jīng)活動(dòng)。此外，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，上述部分生理指標(biāo)的LOEC呈下降趨勢(shì)，這表明，全生命周期暴露相較部分生命周期暴露顯示出更顯著的毒性效應(yīng)，因此全生命周期的毒性評(píng)估方法具有更好的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)優(yōu)勢(shì)。