高宇,許霞,*,施昕瀾,張玲,郭俊,張秋亞,彭明國,薛銀剛,#
1.常州大學環(huán)境與安全工程學院,常州 213164
2.江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中心,常州 213001
食品接觸材料(food contact material,FCMs),也稱食品包裝材料,指在食品生產(chǎn)、加工、運輸和使用過程中可能直接或間接接觸食品的所有材料[1-3]。常見的FCMs包括塑料、玻璃、陶瓷和金屬等[4]。塑料制品因為成本低廉、輕便耐用占據(jù)了FCMs市場的“半壁江山”[5]。據(jù)統(tǒng)計,在2015年全球生產(chǎn)的3.8億t塑料中,塑料包裝獨占1.52億t,其中60%的塑料包裝被用于食品和飲料[6-7]。我國食品包裝材料尤其是塑料包裝的用量持續(xù)增長,塑料包裝用量已經(jīng)超過總用量的50%[8]。
塑料包裝為人類生活提供了極大的便利,但也對環(huán)境和生物健康帶來了挑戰(zhàn)。一方面,大量塑料包裝材料不當?shù)幕厥张c處置加劇了環(huán)境負擔,并被認為是環(huán)境中微塑料(<5 mm的塑料)污染的主要來源[9-11]。近些年來,在塑料包裝中也發(fā)現(xiàn)了微塑料的存在。例如,瓶裝飲料被發(fā)現(xiàn)含有來自瓶子本身的微塑料[12],食鹽和茶包中發(fā)現(xiàn)了來自包裝的微塑料[13-14]。現(xiàn)有研究表明,微塑料可以被不同層級的生物攝食,生物體在攝入微塑料后,消化系統(tǒng)會出現(xiàn)堵塞和磨損痕跡,導致食欲下降[15-16]。與生物體接觸后,微塑料引起的氧化應激可能導致代謝紊亂和神經(jīng)毒性[17]。
另一方面,除了微塑料污染外,F(xiàn)CMs中所含添加劑通過食品接觸遷移到食品中也引起了廣泛關注[18-21]。由于難以與聚合物形成牢固的化學鍵,它們很容易在與食品接觸過程中遷移出來[22]。值得注意的是,從包裝材料中遷移出的化學物質(zhì)可能是食品污染的最大來源,浸出量可能比農(nóng)藥殘留高2~3個數(shù)量級[23]。鄰苯二甲酸酯(phthalic acid ester,PAEs)作為最具代表性的塑化劑,普遍用于保鮮膜的制造[24]。它們的存在可以幫助塑料分子分散更均勻,使保鮮膜具有足夠的柔韌性[25]。PAEs被認為是內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)[26],可導致細胞毒性以及生殖和發(fā)育缺陷[27]。以往的研究主要集中在塑料食品接觸材料中PAEs遷移量的測定[28-29],有關浸提液中微塑料和PAEs的浸出及其對斑馬魚胚胎毒性效應的研究卻鮮見報道。
目前市售產(chǎn)品大多宣稱在耐溫范圍內(nèi)使用不會產(chǎn)生危害,本研究以聚乙烯(polyethene,PE)和聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)保鮮膜為測試對象,選取3種食品模擬物(水、50%乙醇和正己烷)進行遷移實驗,以早期發(fā)育敏感階段的斑馬魚胚胎(Daniorerio)作為毒性受試生物,通過歸納浸出液中微塑料和PAEs的浸出行為,并探究浸出的PAEs對斑馬魚胚胎的發(fā)育影響,為塑料食品接觸材料的風險評估和健康安全評價提供科學支撐。
購買PE和PVC這2種材質(zhì)的保鮮膜;受試魚種為中國科學院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心培育的AB系斑馬魚,實驗室條件下馴化2周。飼養(yǎng)期間嚴格控制養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質(zhì)衛(wèi)生條件及光照時間,每天用實驗室人工孵化的鹽水蝦(豐年蝦)作為活飼料定時投喂2次,后期用于暴露試驗的胚胎均為其后代。
試劑:遷移試驗用水采用全玻璃裝置重蒸餾的超純水,標準稀釋水(5.5 mg·L-1KCl,63.0 mg·L-1·NaHCO3,123.3 mg·L-1MgSO4·7H2O,294.0 mg·L-1CaCl2·2H2O)用于斑馬魚的相關試驗,鄰苯二甲酸酯類標準配品純度為99%(德國Dr.Ehrenstorfer公司),其余試劑均為色譜純(上海阿拉丁,中國)。
儀器:傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR,Nicolet IS5,美國);氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890B/5977B,美國);超高清測量顯微鏡(SGO-KK203,深圳光谷,中國);循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(定制,上海海圣,中國);生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z,上海博迅,中國);循環(huán)水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ),上海邦西,中國);離心機(TDL-60C,上海安亭,中國);渦旋振蕩器(UMV-1,北京優(yōu)晟,中國);油浴鍋(DF-101S,上海力辰,中國);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)皿(RE-52AA,上海亞榮,中國);回流冷凝裝置(四川蜀玻,中國)。
1.3.1 遷移試驗
浸出液的制備參考《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品遷移試驗通則》(GB 31604.1—2015)[30]。不同類別食品對應的食品模擬物如表1所示。PE和PVC保鮮膜的試驗溫度分別為110 ℃和80 ℃,試驗時間均為0.5 h。接觸面積與食品模擬物體積比(S/V)采用0.06 m2對應1 L食品模擬物。采用全浸沒法,由于試樣厚度≤0.5 mm,實驗中浸沒面積均取單面計算。實驗中取0.006 m2保鮮膜樣品,100 mL食品模擬物加入接收瓶,于油浴鍋中加熱回流冷凝。
表1 不同食品類別下的食品模擬物及遷移試驗條件Table 1 Simulants and migration test conditions used for different food categories
1.3.2 微塑料的分離與鑒別
浸出液在真空泵下通過纖維素濾膜(直徑47 mm,孔徑1 μm)進行抽濾,過程中用超純水反復沖洗容器內(nèi)壁。濾膜放入潔凈的培養(yǎng)皿中,待干燥后置于顯微鏡下觀察。每組樣品包括3個平行和1個空白對照(玻璃器皿)。記錄可疑微粒的個數(shù)、粒徑和形貌特征(形狀、顏色),用FTIR進行官能團分析。FTIR采用衰減全反射模式,采集時間為3 s,光譜范圍為4 000~500 cm-1,測試結(jié)果與標準光譜庫對比,匹配度≥70%方可被接受[31]。
1.3.3 暴露試驗
斑馬魚胚胎實驗參考《水質(zhì) 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)[32]。選取二甲亞砜(DMSO)作為助溶劑,用標準稀釋水稀釋至0.05%(V/V)。浸出液按本文1.4.1節(jié)的前處理方法揮干后,加入助溶劑。對照組和實驗組的試驗布局如圖1所示,陰性對照即為空白對照,溶劑對照中的溶液為0.05%(V/V) DMSO。取各組溶液加入石英玻璃微孔,每孔2 mL。受精卵在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置45 min,顯微鏡下挑選64-細胞期~128-細胞期的胚胎放入石英玻璃微孔中進行暴露,每孔1個胚胎。每種浸出液設置3個平行,每個平行包含10個胚胎。暴露完的胚胎轉(zhuǎn)入生化箱,26 ℃下培養(yǎng),記錄48 hpf、72 hpf(hours post fertilization,受精后小時數(shù))胚胎相關形態(tài)學指標[33-34]。
圖1 斑馬魚胚胎試驗微孔板布局圖 注:DMSO表示二甲基亞砜。Fig.1 Layout of the microplate for the zebrafish embryo testNote:DMSO stands for dimethyl sulfoxide.
1.4.1 浸出液的前處理
準確量取(10 mL±0.01 mL)各類模擬物浸出液,對于油性模擬物浸出液,45 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后揮干,加入1 mL正己烷,振蕩3 min,4 000 r·min-1離心5 min;對于水性和含醇模擬物浸出液,先加入4 mL正己烷,振蕩10 min,4 000 r·min-1離心5 min,取上層正己烷層,重復提取2次,合并提取液,再按照油性模擬物浸出液的操作方法進行處理。全部完成后,收集上層清液待氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。
1.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀參數(shù)
色譜條件:色譜柱選取5%苯基-甲基聚硅氧烷石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);不分流進樣1 μL;進樣口溫度260 ℃;初始柱溫60 ℃,保持1 min,20 ℃·min-1升溫至220 ℃,持續(xù)1 min,5 ℃·min-1升溫至250 ℃,維持1 min,20 ℃·min-1升溫至290 ℃,保持7.5 min;載氣氦氣流速1 mL·min-1。
質(zhì)譜條件:EI電離源,電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃,傳輸線溫度280 ℃;溶劑延遲7 min。
實驗過程中嚴格執(zhí)行品質(zhì)控制措施,包括使用通風櫥、棉衣和乳膠手套以防止外來微粒對結(jié)果產(chǎn)生干擾。所有容器未使用時用鋁箔覆蓋。微塑料過濾前,在顯微鏡下檢查濾膜和培養(yǎng)皿的清潔度。用于暴露的斑馬魚胚胎在培養(yǎng)48 h后,對照組的試驗結(jié)果應滿足以下要求:板對照中無胚胎死亡;陰性對照中胚胎存活率≥90%;陽性對照胚胎存活率<10%,否則重新試驗。
實驗結(jié)果以平均值±標準偏差的形式呈現(xiàn),微塑料豐度單位為“個·(100 mL)-1”;使用Origin Pro 2017進行正態(tài)檢驗和單因素方差分析(ANOVA);*表示P<0.05,**表示P<0.01。
2.1.1 微塑料的類型與豐度
通過FTIR對可疑微粒進行表征(圖2),并與標準譜圖比對以確定樣品的類型。共有79個疑似顆粒被檢測,其中包含一些類似塑料的非塑料顆粒。一些微粒的聚合物成分與保鮮膜相同且顏色也為透明,因此,它們被認為是從保鮮膜中剝落的微塑料。在PE和PVC保鮮膜中,自身剝落微塑料分別占總體豐度的21.0%和17.7%。在PE和PVC保鮮膜中也發(fā)現(xiàn)了其他類型的聚合物,PE保鮮膜中其他類型的聚合物占比分別為聚對苯二甲酸乙二醇酯(26.3%)、聚酯(21.1%)、丙烯酸(5.3%)、尼龍(15.8%)和人造絲(31.5%),PVC保鮮膜中其分別為聚對苯二甲酸乙二醇酯(28.6%)、聚酯(17.9%)、丙烯酸(7.1%)、尼龍(21.4%)和人造絲(25.0%)。
圖2 保鮮膜中微塑料的紅外光譜圖注:PE表示聚乙烯;PVC表示聚氯乙烯;PET表示聚對苯二甲酸乙二醇酯;PES表示聚酯。Fig.2 Infrared spectrum of microplastics in plastic wrapNote:PE stands for polyethylene;PVC stands for polyvinyl chloride;PET stands for polyethylene terephthalate;PES stands for polyester.
由圖3(a)可知,不同模擬物下2種保鮮膜中微塑料的總體豐度,箱線圖中的晶須、中線和小方塊分別代表豐度的最值、中值和平均值。3種模擬環(huán)境下PE保鮮膜中微塑料的豐度在(2.33±0.47) 個·(100 mL)-1到(3.33±0.47) 個·(100 mL)-1之間,平均豐度為(2.67±0.82) 個·(100 mL)-1。PVC保鮮膜中微塑料豐度最高值為(4.33±0.47) 個·(100 mL)-1,最低值為(3.00±0.82) 個·(100 mL)-1,平均為(3.78±0.92) 個·(100 mL)-1。外來源微塑料(非自身剝落)豐度如圖3(b)所示,PE保鮮膜中外來源微塑料的平均豐度為(2.11±0.74) 個·(100 mL)-1,占總體豐度的79.0%,PVC中外來源微塑料的平均豐度(3.11±0.57) 個·(100 mL)-1,占總體豐度的82.3%。
圖3 不同模擬物下2種保鮮膜中微塑料的豐度注:(a) 總體微塑料豐度;(b) 表面附著微塑料豐度(非自身剝落)。Fig.3 Abundance of microplastics in two kinds of plastic wrap under different simulantsNote:(a) Total microplastic abundance;(b) Surface-attached microplastic abundance (non-self flaking).
2.1.2 微塑料的形狀和粒徑
不同模擬物下2種材質(zhì)保鮮膜中檢出的微塑料形狀包括2種:薄膜和纖維,且纖維所占比例遠遠大于薄膜。在水性、含醇和油脂食品模擬物中,PE保鮮膜中纖維狀塑料百分比分別是86%、71%和80%,薄膜狀為14%、29%和20%(圖4(a))。在PVC保鮮膜中,纖維類分別占比89%、83%和77%,薄膜類比例為11%、17%和23%(圖4(b))。微塑料根據(jù)粒徑分為3組:分別為<500 μm、500~1 000 μm和>1 000 μm。如圖4(c)所示,PE保鮮膜中<500 μm粒徑的微塑料最多(74.1%),其次是粒徑在500~1 000 μm的微塑料(22.2%),粒徑>1 000 μm的微塑料最少(3.7%)。由圖4(d)可知PVC保鮮膜中微塑料的粒徑分布情況,500~1 000 μm的微塑料最多(55.9%),粒徑<500 μm的微塑料次之(29.4%),>1 000 μm的微塑料依然最少(14.7%)。
圖4 不同模擬物下2種保鮮膜中微塑料的形狀和粒徑注:(a)表示PE保鮮膜中微塑料的形狀分布;(b)表示PVC保鮮膜中微塑料的形狀分布;(c)表示PE保鮮膜中微塑料的粒徑;(d)表示PVC保鮮膜中微塑料的粒徑。Fig.4 Shape and size of microplastics in two kinds of plastic wrap under different simulantsNote:(a) Represents shape distribution of microplastics in PE;(b) Represents shape distribution of microplastics in PVC;(c) Represents size of microplastics in PE;(d) Represents size of microplastics in PVC.
2.2.1 各組別對胚胎心率的影響
顯著性分析結(jié)果表明空白對照組和溶劑對照組之間不存在明顯差異。PE保鮮膜中各試驗組均未發(fā)現(xiàn)20 s內(nèi)斑馬魚胚胎心跳次數(shù)有明顯變比。PVC水性環(huán)境實驗組毒性最弱,對斑馬魚胚胎的心率幾乎沒有抑制作用。相比之下,含醇和油脂條件實驗組對斑馬魚胚胎20 s內(nèi)心跳次數(shù)均有很強的抑制作用,其中油脂環(huán)境實驗組對胚胎影響最顯著。48 hpf時,含醇試驗組和油脂試驗組中斑馬魚胚胎20 s心跳次數(shù)分別相當于溶劑對照組的92.6%和85.9%;72 hpf時,2個試驗組暴露下的胚胎20 s心跳次數(shù)分別為對照組的87.2%和80.4%(圖5)。
圖5 不同模擬物下保鮮膜浸提物對胚胎心率的影響Fig. 5 Effects of the extracts from plastic wrap using different food simulants on the heart rate of embryos
2.2.2 各組別對胚胎的致畸作用
如圖6所示,PVC保鮮膜含醇實驗組和油脂實驗組中暴露的斑馬魚胚胎均出現(xiàn)了脊柱彎曲和心包囊腫。其中脊柱彎曲率分別為6.7%(P<0.01)和13.3%(P<0.01)。心包囊腫率相對較低,分別為3.3%(P<0.01)和6.7%(P<0.01)。相對于48 hpf正常發(fā)育的胚胎(圖7(a)),在實驗組中出現(xiàn)了如心包囊腫(圖7(b))和卵黃腫大(圖7(c))等畸形癥狀;72 hpf暴露后,相比正常發(fā)育的仔魚(圖7(d)),實驗組中發(fā)現(xiàn)了心包囊腫(圖7(e))和脊柱彎曲(圖7(f))的仔魚。
圖6 不同模擬物下保鮮膜浸提物對胚胎的致畸作用Fig. 6 Teratogenic effects of the extracts from plastic wrap using different food simulants on embryos
圖7 異常胚胎顯微照片注:(a) 48 hpf發(fā)育正常的胚胎;(b) 48 hpf心包囊腫的胚胎;(c) 48 hpf卵黃腫大的胚胎;(d) 72 hpf發(fā)育正常的仔魚;(e) 72 hpf心包囊腫的仔魚;(f) 72 hpf脊柱彎曲的仔魚。Fig.7 Micrographs of abnormal embryosNote:(a) Normally developing embryo at 48 hpf;(b) Embryo with pericardial cyst at 48 hpf;(c) Embryo with yolk deformation at 48 hpf;(d) Normally developing larva at 72 hpf;(e) Larva with pericardial cyst at 72 hpf ;(f) Larva with spine curvature at 72 hpf.
通過GC-MS對浸出液中的成分進行分析,結(jié)果如表2所示。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)在PVC保鮮膜含醇和油脂模擬物的浸出液中被檢測出,PE保鮮膜3種食品模擬物的浸出液中都未發(fā)現(xiàn)PAEs的浸出。同時,PVC保鮮膜在油脂環(huán)境下的遷移量最大,其次是含醇環(huán)境,2種保鮮膜在水性環(huán)境下都未檢出PAEs。
表2 不同模擬物下2種保鮮膜中鄰苯二甲酸酯濃度Table 2 Phthalate concentrations of two kinds of plastic wrap under different simulants (mg·L-1)
PE和PVC保鮮膜中都發(fā)現(xiàn)了微塑料的存在,其中有一部分來源于保鮮膜本身。微塑料可能在塑料制品制造、運輸和日常使用過程中從接觸材料表面脫落。Du等[35]發(fā)現(xiàn)微塑料會在輕微沖洗后從不同類型的外賣容器表面剝落,每人每周通過容器攝入的微塑料可能高達203個。Fadare等[36]對用于食品配送的圓形、矩形塑料容器和日常飲用的一次性塑料杯浸出的微塑料進行了檢測,確定了剝落微塑料的平均質(zhì)量分別為(12±5.12) mg、(38±5.29) mg 和(3±1.13) mg。除了自身剝落的內(nèi)源污染外,包裝材料中也發(fā)現(xiàn)了外來源污染,且以纖維狀的微塑料比例最高。5種外來源微塑料按比例從高到低分別為人造絲、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、尼龍和丙烯酸。衣物上的塑料纖維可能是外來污染的重要來源。研究表明,纖維狀的微塑料主要由服裝纖維的斷裂產(chǎn)生,其主要成分是人造絲和聚對苯二甲酸乙二醇酯,這2種材質(zhì)的聚合物在合成紡織纖維中被大量使用[37]。在與食品接觸材料加工和包裝的過程中,衣物上的塑料纖維可能通過靜電作用沾染到保鮮膜表面。除了衣物來源,大氣中的微塑料污染也可能通過沉降作用進入到接觸材料。大氣微塑料污染普遍存在于室內(nèi)外環(huán)境中[38-39]。Cai等[40]對中國東莞市大氣沉降物中微塑料的污染特征進行了歸納,發(fā)現(xiàn)每天沉降物中微塑料濃度的范圍為175~313 個·m-3,且纖維是主要的形狀。室內(nèi)環(huán)境的污染更嚴重,Dris等[41]的研究表明,每天沉降的塑料纖維濃度介于523~3 673 個·m-3之間。本文檢出的外來源塑料微粒以纖維形狀最為豐富,這與Cai等[40]和Dris等[41]的研究結(jié)果相一致。制品在生產(chǎn)、儲存、運輸和使用過程中不可避免地會接觸到空氣,大氣中的微塑料可能通過這些環(huán)節(jié)中進入塑料制品中。有研究表明,與攝入大氣微塑料沉降物引起的暴露水平相比,通過貝類攝入微塑料對人類健康的影響甚至可以忽略不計[42]。從豐度上看,PVC保鮮膜中的外來顆粒個數(shù)大于PE保鮮膜;從粒徑分布上看,PVC保鮮膜中含有微塑料的粒徑也是大于PE保鮮膜的,這可能因為PVC保鮮膜具有更大的黏性,更有利于大粒徑的外來微塑料粘附在表面。相關研究表明,微塑料的存在可能會加劇浸提液的毒性[43-44],具體的毒性機制目前尚不明確。除了塑料制品本身遷移添加劑的毒性,剝落的微塑料也有可能對斑馬魚胚胎產(chǎn)生毒性。
由于PAEs未與聚合物共價結(jié)合,而是通過氫鍵或范德華力與樹脂相連,因此這些化合物很容易從塑料食品接觸材料中遷出[45]。Han等[46]對中國外賣食品容器中的PAEs進行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)DEHP的浸出率最高,達到51.2%。趙電波等[47]發(fā)現(xiàn)聚乙烯包裝袋在包裹完高溫油炸的油條后,包裝材料中檢測到了DBP和DOP的浸出,最大浸出濃度分別為0.79 mg·L-1和0.24 mg·L-1。不同食品模擬物中PAEs的浸出量也呈現(xiàn)出差異性,相比于水性模擬物,有機模擬物中PAEs有著明顯的浸出,這可能與用來抽提的溶劑極性有關[48]。塑料食品接觸材料中的添加劑多為非極性化合物,因此難以在極性很強的水溶液中發(fā)生遷移,而與水相比,醇和烷烴的極性要小得多,根據(jù)相似相溶原理,在這類模擬環(huán)境下遷移促進了同樣極性較弱的PAEs浸出。PAEs在油脂模擬物中的遷移量大于在含醇環(huán)境下的遷移量,這種差異可能歸因于正己烷和PAEs相似的C—C長鏈結(jié)構(gòu)[49],此外,遷移量差異也和溶液體系中有機組分的含量有關,油脂模擬物中高聚物的溶劑化作用更為明顯,進而導致更多的PAEs遷移。
PVC保鮮實驗組中的受試胚胎受到不同程度的毒害作用,浸提液中檢測到DEHP、DBP和DOP這3種PAEs類化合物的浸出。Staples等[50]研究發(fā)現(xiàn)DBP、DEHP和DOP可對魚類胚胎產(chǎn)生毒性效應,且其毒性的強弱與烷基鏈長度成正相關。何秀婷等[51]研究了4種不同濃度的PAEs對斑馬魚胚胎發(fā)育的聯(lián)合毒性,計算出DBP和DEHP對斑馬魚胚胎48 h半數(shù)致死濃度(LC50-48 h)分別為0.20 mg·L-1和0.77 mg·L-1,且DBP和DEHP交互暴露時,可能產(chǎn)生的協(xié)同作用會導致毒性加強,對斑馬魚胚胎發(fā)育造成更大影響。含醇和油脂實驗組中部分斑馬魚胚胎表現(xiàn)出心率異常并伴有特征性的心臟缺陷,這些癥狀的產(chǎn)生很可能歸因于浸出的PAEs。Singh和Li[52]借助比較毒理學數(shù)據(jù)庫對16種PAEs與基因/蛋白質(zhì)之間的相互作用進行了探究,發(fā)現(xiàn)心臟毒性是PAEs毒性排名最高的類別,其次是肝毒性和腎毒性。相關研究表明,PAEs對心臟產(chǎn)生毒性的作用機制可能與Nkx2.5和Tbx5這2種基因的表達變化有關。作為重要的心臟轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎心臟發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵作用[53-54]。Nkx2.5和Tbx5協(xié)同參與心肌細胞分化,促進心臟發(fā)育[55],其在胚胎中的表達改變可導致嚴重的心臟分化缺陷和心臟缺陷[56-57]。Sun和Liu[58]證實了鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)會損害斑馬魚胚胎的心臟結(jié)構(gòu)和功能,并通過實時定量PCR技術深入探究了BBP對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育產(chǎn)生不利影響的機理。Nkx2.5和Tbx5的基因表達伴隨BBP暴露劑量的上升呈現(xiàn)依賴性下降,這2種基因的改變可能是引起心臟毒性的主要原因。穆希巖等[59]證明了DBP和DEHP可導致胚胎中Nkx2.5蛋白含量降低,這種蛋白含量的減少可能造成胚胎心臟發(fā)育缺陷,引起胚胎心率異常[56-57]。Pfuderer和Francis[60]證明了PAEs對心率有影響,其中DBP和BBP可顯著降低金魚的心率,這些結(jié)果表明心臟缺陷與酞酸酯類化合物之間存在密切的關聯(lián)。
暴露于含醇和油脂浸提液的斑馬魚胚胎出現(xiàn)脊柱彎曲,這可能和胚胎中與脊索發(fā)育和骨骼發(fā)育的相關基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變有關。之前的研究表明,PAEs類化合物易對骨骼和脊柱的發(fā)育造成影響[61-62]。Qian等[63]發(fā)現(xiàn)參與脊索發(fā)育的col8a1a基因以及參與骨骼發(fā)育的BMP-2因子的轉(zhuǎn)錄水平在50 μg·L-1DEHP和DBP中顯著下調(diào),這可能是導致斑馬魚脊柱缺陷的關鍵原因。Col8a1a被認為是斑馬魚脊索發(fā)育過程中的必要因素,該基因功能的缺失或抑制會影響胚胎脊柱和骨骼系統(tǒng)正常發(fā)育,進而造成斑馬魚胚胎脊椎畸形[64]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)作為骨形成的誘導劑和胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)劑,直接參與脊椎動物胚胎背腹的早期形成,BMP-2的轉(zhuǎn)錄減少可能對骨骼發(fā)育產(chǎn)生負面影響并進一步誘導脊柱變形[65]。既往的研究也有相似的發(fā)現(xiàn),當暴露于多氯聯(lián)苯(PCBs)和三唑類化合物時,伴隨著BMP-2轉(zhuǎn)錄的減少,斑馬魚胚胎脊柱彎曲率上升[66-67]。斑馬魚胚胎相關毒性癥狀的產(chǎn)生可能是一系列復雜毒性機制綜合作用的結(jié)果,一方面浸提過程中遷移出的塑料添加劑可能通過改變與發(fā)育有關基因的表達,誘導斑馬魚胚胎出現(xiàn)毒性效應,另一方面浸提液中的微塑料可能會對浸提液的毒性起到促進作用,共同影響斑馬魚胚胎發(fā)育。