陳耀忠 劉雁軍 陳建明 劉根娣

根管治療失敗，無法或難以進行根管再治療時，根尖手術是保存患牙最重要的治療方法[1-2]。根尖手術中，根尖充填目的是嚴密封閉根管末端，防止致病微生物或其產物從根管系統(tǒng)進入根尖周組織，并促進其病變愈合。因此，根尖充填材料(root-end filling material, RFM)的性能是影響根尖手術成功的重要因素之一。

理想的RFM不僅要具有良好的理化性能、封閉性能及生物相容性，還應具備一定的抑菌性能[2-4]。目前，臨床上使用的RFM種類眾多，性能各異，但大多數材料的抗菌性能并不理想[3-5]。研究表明：在RFM(如MTA)中添加納米銀等抗菌制劑能有效提高其抗菌性能[5]。納米銀雖具有強效、廣譜抗菌作用，但也存在極易團聚、不易存放等缺點[6]。氧化鋅/銀納米復合物(zinc oxide/silver nanocomposite，ZnO/Ag)是指氧化鋅微球表面吸附一定數量的納米銀顆粒，具有抗菌持久、不易團聚等顯著優(yōu)點[7-9]。本課題前期研制的新型根尖充填材料(novel root-end filling material,NRFM)具備良好的理化性能及細胞相容性，但抗菌性能有待提高[10-13]。為此，本文擬通過在NRFM中添加0.5%～2%的ZnO/Ag，制備出新型載氧化鋅/銀納米復合物根尖充填材料(novel root-end filling material containing zinc oxide/silver nanocomposite，NRFM-ZnO/Ag)，并對其理化性能、細胞相容性及抗菌性能等進行檢測，評價其對NRFM性能的影響。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

自制NRFM粉劑(按質量比，分別取34.8%磷酸四鈣、34.8%羥基磷灰石、20%氧化鋯、7%聚丙烯酸、1.7%檸檬酸鈉及1.7%檸檬酸等材料混合，研磨，過200 目篩)[10]，ZnO/Ag(氧化鋅微球的直徑為：2～5 μm，圖1)由東南大學徐春祥教授惠贈[7-9]。L929細胞(中科院上海細胞研究所)；糞腸球菌ATCC 29212及白色念珠菌ATCC 10231(東南大學附屬中大醫(yī)院檢驗科)；掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi公司，日本)；場發(fā)射SEM(Carl Zeiss公司，德國)；X-射線衍射儀(X-ray diffraction，XRD，Bruker公司,德國)等。

圖1 ZnO/Ag的掃描電鏡圖片

1.2 方法

1.2.1 NRFM-ZnO/Ag制備 按表1稱取不同質量比的NRFM粉劑與ZnO/Ag混合、研磨，制備出4 種粉劑；蒸餾水為液劑。將上述材料按固液相質量比(g/mL)5∶1進行混合、調拌，使其成面團狀。

表1 NRFM-ZnO/Ag粉體組成

1.2.2 X射線衍射(XRD)表征 分別將固化1 周的樣品材料研磨成粉體，采用XRD對其測試，CuKα輻射，掃描范圍(2θ)為20°～50°[11]。

1.2.3 固化時間及壓縮強度 采用維卡氏針(直徑為1 mm、質量為300 g)法測定樣品材料的固化時間；采用萬能材料試驗機檢測固化1周樣品材料(Φ 6 mm×4 mm)的壓縮強度[12]。

1.2.4 細胞相容性檢測 取固化24 h的材料樣品(Φ 5 mm×2 mm)高溫、高壓滅菌30 min后，按ISO 10993-12(2007)標準[13](樣品表面積/浸提介質=1.25 cm2/mL)，37 ℃、5%CO2下浸提72 h，制備浸提液。取對數生長期L929細胞接種于96 孔培養(yǎng)板(6×103細胞/孔)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，棄培養(yǎng)液，添加不同實驗材料組浸提液、陰性、陽性對照組(含0.7%丙烯酰胺單體的培養(yǎng)液)各200 μL。常規(guī)條件下分別培養(yǎng)24 h，48 h及72 h后，采用MTT比色法測定其細胞相容性。酶標儀(492 nm)測定其吸光度值(A值)，細胞相對增值率(relative growth rate，RGR)計算公式為：RGR(%)=A實驗組/A陰性對照組×100%，采用6 級毒性分級法評定細胞相容性[14]。

1.2.5 抗菌實驗

1.2.5.1 SEM觀察 分別取糞腸球菌ATCC 29212及白色念珠菌ATCC 10231菌株(菌液濃度為1.5×108CFU/mL)，采用Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基將細菌稀釋至1.5×106CFU/mL，備用。在無菌96 孔板中置入樣品材料(Φ 5 mm×1 mm)，每孔加入200 μL懸浮菌液，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，取出樣品材料，磷酸緩沖鹽溶液潤洗，立即放入4%戊二醛液中4 ℃下固定24 h，依次使用30%、50%、70%、80%、90%、95%及100%乙醇梯度脫水，干燥、噴金，SEM觀察致病微生物在樣品材料表面黏附情況[15]。

1.2.5.2 直接接觸法 取消毒樣品材料粉體各50 μg置于96 孔板，取50 μL、0.5 個麥氏單位的菌懸液滴加于樣品材料粉體表面及空白陰性對照組，使兩者充分接觸、共培養(yǎng)24 h，添加肉湯培養(yǎng)液450 μL，取樣品液體10 μL在培養(yǎng)板上接種，1 d后計算其回收菌落數?？咕视嬎愎綖椋簉(%)=(b-c)÷b×100%；r為抗菌率(%)；b為陰性對照組平均回收菌落數；c為實驗各組的平均回收菌落數[16]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 XRD表征

圖2顯示：與NRFM一致，載0.5%～2%ZnO/Ag的樣品材料主要出現羥基磷灰石(hydroxyapatite，H)、磷酸四鈣(tetracalcium phosphate,T)及氧化鋯(zirconium dioxide,Z)的特征峰；但NRFM-2%ZnO/Ag的磷酸四鈣特征峰較其他材料組顯著增強。

圖2 NRFM及NRFM-ZnO/Ag的XRD表征

2.2 固化時間及壓縮強度

表2顯示NRFM與NRFM-ZnO/Ag的固化時間介于11.6～14.1 min，各組材料間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；壓縮強度介于39.7～57.8 MPa，而NRFM-2%ZnO/Ag的壓縮強度(39.7±8.9)MPa顯著低于NRFM組(P<0.05)。

表2 NRFM-ZnO/Ag固化時間及壓縮強度

2.3 細胞相容性

48 h及72 h組NRFM-2%ZnO/Ag浸提液的RGR顯著低于陰性對照組(P<0.05)，其余各實驗組與陰性對照組差別無顯著性意義(P>0.05)，細胞毒性為0～Ⅰ級；陽性對照組RGR均顯著低于陰性對照組(P<0.01)，細胞毒性為Ⅲ～Ⅳ級(表3)。

表3 MTT比色法檢測NRFM-ZnO/Ag的RGR及毒性級別

2.4 抗菌性能

2.4.1 SEM觀察 圖3顯示在NRFM-1.5%ZnO/Ag及NRFM-2%ZnO/Ag樣品材料表面黏附的糞腸球菌顯著少于其他組。載1%～2% ZnO/Ag的3 組NRFM樣品材料表面黏附的白色念珠菌也顯著少于其他組(圖4)。

圖3 糞腸球菌在NRFM-ZnO/Ag材料表面生長(SEM，×5 000)

圖4 白色念珠菌在NRFM-ZnO/Ag材料表面生長(SEM，×2 500)

2.4.2 直接接觸法 表4及圖5可見NRFM及NRFM-0.5%ZnO/Ag的抑制糞腸球菌的性能與陰性對照組相似(P>0.05)，顯著小于載1%～2%ZnO/Ag的NRFM樣品材料(P<0.05)。NRFM及NRFM-ZnO/Ag對白色念珠菌均有一定抑制作用(P<0.05)，其中2%NRFM-ZnO/Ag抗菌作用最強(P<0.05，表4及圖6)。

表4 NRFM-ZnO/Ag的抗菌率

圖5 NRFM-ZnO/Ag抗菌性能測定的糞腸球菌菌落生長情況

圖6 NRFM-ZnO/Ag抗菌性能測定的白色念珠菌菌落生長情況

3 討 論

根管充填后，殘留在根管系統(tǒng)內或根尖周組織的致病微生物感染是導致根管治療失敗的主要原因。鑒于糞腸球菌及白色念珠菌可能是造成根管治療失敗的主要致病微生物[17-19]，本文將其作為NRFM-ZnO/Ag抗菌作用的受試致病微生物。

NRFM不含抗菌成分，對糞腸球菌無明顯抑制作用，這與本研究結果相一致[10]。為此，本文首次在NRFM粉劑內添加0.5%～2%的ZnO/Ag，并評價其對NRFM性能的影響。SEM檢測結果顯示NRFM-1.5%ZnO/Ag及NRFM-2%ZnO/Ag表面黏附的糞腸球菌及白色念珠菌數量明顯少于NRFM組，且生長狀態(tài)差，說明該材料不利于這兩種微生物的黏附及其生物膜的形成。直接接觸實驗進一步驗證了這兩種材料的抗菌作用。因此，在NRFM內添加0.5%～2%的ZnO/Ag能改善其抗菌性能，且與劑量相關。梁蓓蕾等[16]研究顯示在復合樹脂添加抗菌劑(納米氧化鋅)能改善其抑制變形鏈球菌生長的能力，并與劑量相關，這與本研究結果相一致。

在NRFM內添加ZnO/Ag能有效提高其抗菌性能，但對其理化性能的影響未知。XRD表征顯示在NRFM內添加0.5%～1.5%的ZnO/Ag的譜圖與NRFM與相似，說明在NRFM中添加少量的ZnO/Ag不會顯著影響其水化固化反應及其主要反應產物的生成；但NRFM-2%ZnO/Ag譜圖中磷酸四鈣特征峰明顯增強，提示2%ZnO/Ag可能影響磷酸四鈣水化固化反應生成羥基磷灰石[11-13]。另外，在XRD譜圖中并未出現氧化鋅及銀的特征峰，這可能與檢測材料中ZnO/Ag含量較低相關。材料的壓縮強度結果顯示僅NRFM-2%ZnO/Ag的壓縮強度(39.7±8.9)MPa顯著小于NRFM組(54.7±6.9)MPa(P<0.05)，說明隨著ZnO/Ag劑量的增加，可能會導致其壓縮強度降低。

ZnO/Ag是利用氧化鋅微球比表面積大且穩(wěn)定的特性為銀的附著提供良好的載體[7-9]，但釋出的Ag+可在細胞內累積，產生一定的細胞毒性，因此必須探討NRFM-ZnO/Ag的細胞相容性[20]。本文結果顯示載0.5%～1.5%ZnO/Ag的NRFM的RGR介于89.77%～94.98%，細胞毒性為Ⅰ級，符合GB/T16886.5-2003標準[11]，且與陰性對照組差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明其具有較好的細胞相容性。但48 h及72 h組的NRFM-2%ZnO/Ag的RGR顯著小于陰性對照組，說明其細胞毒性隨著ZnO/Ag含量增加而增強。

綜上，在NRFM中添加ZnO/Ag能改善其抗菌性能，并對其理化性能及細胞相容性產生一定影響。NRFM-1.5%ZnO/Ag理化性能、細胞相容性及抗菌性能均俱佳，臨床應用前景良好，但該材料的分子生物相容性及抗菌機制還有待于進一步探討。