周躍華，高 宏，殷東風(fēng)

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽110032

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一［1］。乳腺癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放化療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等。對于激素受體陽性的乳腺癌患者，內(nèi)分泌治療為其重要手段，可延長患者無病生存期（disease free survival，DFS）及總生存期（overall survival，OS），降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險。對于絕經(jīng)后乳腺癌指南推薦芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitor，AI）療效優(yōu)于他莫昔芬（tamoxifen，TAM），對于絕經(jīng)前乳腺癌患者合并高危因素，推薦卵巢去勢（ovarianfunction suppression，OFS）聯(lián)合AI 治療，奠定了AI 內(nèi)分泌治療的地位。HIGGINS MJ［2］研究證實將AI 術(shù)后輔助治療延長至10年，可降低乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險。依西美坦為一種不可逆性甾體芳香酶滅活劑，是常用的AI類藥物。但是內(nèi)分泌治療帶來的副作用如類更年期綜合征癥狀、骨質(zhì)疏松、血脂異常、關(guān)節(jié)痛等嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致放棄內(nèi)分泌治療。而中藥乳巖寧從“調(diào)暢氣機”［3］入手，能改善內(nèi)分泌治療的副作用［4］及治療依從性，延長OS［5］。本研究探討中藥復(fù)方乳巖寧聯(lián)合依西美坦對MCF-7(michigan cancer foundation-7，MCF-7)乳腺癌細(xì)胞周期及ERα（estrogen receptor α，ERα）、p-Akt(phosphorylated-protein kinase B，p-Akt)蛋白表達的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株雌激素受體(estrogen receptor，ER）陽性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 實驗動物SPF級雌性BALB/C裸鼠43只，5～6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物實驗合格證號：SCXK（滬）2007-0005。

1.3 實驗藥品及制備乳巖寧的制備：乳巖寧方由柴胡10 g，法半夏10 g，人參15 g，浙貝母15 g，黃芩15 g，炙甘草10 g，生龍骨30 g，生牡蠣30 g，白花蛇舌草15 g，薏苡仁15 g，半枝蓮15 g，莪術(shù)15 g等14味中藥組成，購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，水煎濃縮至生藥濃度為3.3 g/mL 溶液，無菌實驗陰性，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ牢髅捞蛊ò⒅Z新，輝瑞制藥，批號：H20120399，規(guī)格：25 mg/片）將25 mg 依西美坦片加入62.5 mL 蒸餾水中充分溶解，調(diào)節(jié)生藥濃度至0.4 mg/mL備用。

1.4 主要試劑與儀器細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（PI，碧云天生物，貨號：C1062）；兔抗ERα多克隆抗體（北京博奧森生物，批號：909086W）；兔抗p-Akt多克隆抗體（北京中杉金橋，貨號：ZA-0105）；OLYMPUS BX41 型數(shù)碼顯微鏡（日本OLYMPUS）；FACS CaliburTM 型流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；DYY-6C 電泳儀、DYYm40B 型水浴式轉(zhuǎn)印電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗動物飼養(yǎng) 實驗動物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物室，動物實驗許可證號：SYXK（遼）2013-0009，專人飼養(yǎng)。

1.5.2 去勢裸鼠模型制備 采用10%水合氯醛按4 mL/kg 腹腔注射麻醉后將裸鼠四肢固定，俯臥于手術(shù)臺，背部碘伏消毒，切開皮膚，于脊柱旁開0.5 cm，距肋弓下緣0.5 cm 處切開皮膚、肌肉，剪開腹膜進入腹腔，可見乳白色組織，輕輕提出，即可見粉紅色“桑椹樣”卵巢，分離后鉗夾、結(jié)扎，剪去卵巢，檢查無滲血后分層縫合皮膚。同樣方法切除對側(cè)卵巢，保溫20 ℃左右待麻醉蘇醒。術(shù)后肌肉注射青霉素抗炎，碘伏切口消毒，每日1次，連續(xù)3天。

1.5.3 荷瘤裸鼠動物造模 將呈對數(shù)生長期的MCF-7 乳腺癌細(xì)胞配置成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×107/mL，取0.2 mL在切除卵巢裸鼠的右腋窩脂肪墊下接種，注射完畢后夾閉針孔片刻，共接種3只，接種后10天左右接種部位處出現(xiàn)白色腫瘤結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，逐漸增大，越長越快。當(dāng)原代腫瘤長至0.8 cm3大小時手術(shù)取下腫瘤，使用骨髓穿刺針原位移植至剩余40只裸小鼠乳墊下，接種后飼養(yǎng)于SPF 級動物實驗室，移植第4～5 天后乳墊處即可見腫瘤生長，成瘤率100%，形狀、大小較整齊［6］。

1.5.4 動物分組及給藥 將40 只造模成功的絕經(jīng)后荷瘤裸鼠隨機分為4 組各10 只，根據(jù)人和鼠給藥劑量換算公式［7］計算各組給藥劑量。模型組：生理鹽水每日0.2 mL 灌胃；依西美坦組：依西美坦按4 mg/kg（體質(zhì)量）給藥（相當(dāng)于臨床人用量的10倍），每日0.2 mL 灌胃；乳巖寧組：乳巖寧按33.3 g/kg（體質(zhì)量）給藥（相當(dāng)于臨床人用量的12倍），每日0.2 mL灌胃；結(jié)合組（乳巖寧+依西美坦），乳巖寧33.3 g/kg（體質(zhì)量）+依西美坦4 mg/kg（體質(zhì)量）每日0.2 mL，連續(xù)給藥21天。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 流式細(xì)胞儀檢測乳腺癌細(xì)胞周期 將瘤組織用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm 小塊，越小越好，0.25%胰酶消化，400 目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，收集單細(xì)胞懸液，碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染法37 ℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀上樣檢測細(xì)胞周期，激發(fā)波長488 nm，同時采用Multicycle DNA content and cell cycle analysis軟件對測量值進行細(xì)胞DNA含量分析。

1.6.2 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測瘤組織中ERα、p-Akt 蛋白表達 -20 ℃冰箱中取出腫瘤組織，取標(biāo)本100 mg，加入500 μL 冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，組織勻漿，采用酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量。根據(jù)所測蛋白分子量選擇相應(yīng)濃度的SDS聚丙烯酰胺凝膠，灌制12%分離膠與4%濃縮膠，凝膠后上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，標(biāo)記目的條帶，封閉，加入特異性一抗，4 ℃雜交過夜；洗液洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，作用1 h，洗滌，堿性磷酸酶法顯色，暗室曝光、顯影、定影、掃描照相，用Scion Image 軟件對蛋白電泳帶進行灰度值檢測，定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，采用單因素方差分（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀態(tài)用藥第3、5、9 天，結(jié)合組、模型組及依西美坦組分別有1 只荷瘤裸鼠出現(xiàn)頭部偏向一側(cè)類“中風(fēng)偏癱”癥狀而剔除實驗，其余荷瘤裸鼠狀態(tài)良好，正常自由活動、進食，給藥10天后依西美坦組與結(jié)合組荷瘤裸鼠皮膚色澤晦暗，進食量減少，精神萎靡，喜蜷臥，依西美坦組最明顯；給藥第18 天結(jié)合組1 只裸鼠因腫瘤消耗死亡，死亡極度消瘦，體質(zhì)量15 g。乳巖寧組荷瘤裸鼠狀態(tài)較好，直至實驗結(jié)束無死亡。

2.2 乳腺癌細(xì)胞周期各用藥組G0/G1期細(xì)胞比例增多，S 期比例減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)合組G0/G1期細(xì)胞比例最多，S 期細(xì)胞比例最少，與依西美坦組及乳巖寧組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。乳巖寧組與依西美坦組比較，G0/G1期、S 期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1及圖1—4。

表1 各組裸鼠移植瘤細(xì)胞周期分布情況（）%

表1 各組裸鼠移植瘤細(xì)胞周期分布情況（）%

注：☆表示與模型組比較，P＜0.01；★表示與結(jié)合組比較，P＜0.01；◆表示與乳巖寧組比較，P＞0.05

圖1 模型組乳腺癌細(xì)胞周期

圖2 依西美坦組乳腺癌細(xì)胞周期

圖3 乳巖寧組乳腺癌細(xì)胞周期

圖4 結(jié)合組乳腺癌細(xì)胞周期

2.3 瘤組織中ERα、p-Akt 蛋白表達模型組中ERα 及p-Akt 蛋白低表達，與3 個用藥組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；各用藥組均可下調(diào)ERα及p-Akt 蛋白表達，其中結(jié)合組作用更顯著，與乳巖寧組、依西美坦組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），乳巖寧組與依西美坦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、表2。

表2 各組乳腺癌組織ERα、p-Akt蛋白表達灰度值（）

表2 各組乳腺癌組織ERα、p-Akt蛋白表達灰度值（）

注：☆表示與模型組比較，P＜0.01；★表示與結(jié)合組比較，P＜0.01；◆表示與乳巖寧組比較，P＞0.05

圖5 各組乳腺癌組織ERα、p-Akt蛋白表達電泳圖

3 討論

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，細(xì)胞的增殖、凋亡和衰老均依賴于細(xì)胞周期的調(diào)控。細(xì)胞周期調(diào)控機制的失活，特別是G1/S 期和G2/M期，在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用［8］。細(xì)胞周期主要有G0/G1期-DNA 合成前期、S期-DNA 合成期、G2/M 期-DNA 合成后期及分裂期。Akt 作為PI3K/Akt 信號通路的下游分子，磷酸化后的AKT 具有多種生物學(xué)活性，可促進腫瘤細(xì)胞的增殖，促進侵襲和轉(zhuǎn)移，調(diào)控腫瘤血管形成，抑制凋亡，產(chǎn)生耐藥等［9］。陳子涵等［10］研究表明蒲公英根水提物可通過抑制Akt 活化，激活細(xì)胞線粒體凋亡途徑，使凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-9）表達增加，從而促進人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231（Human breast cancer cell line，MDA-MB-231）細(xì)胞的凋亡。

乳腺癌為激素依賴型腫瘤，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇）關(guān)系密切［11］。而雌激素主要與ER 結(jié)合后作用于靶組織發(fā)揮作用，我們通常認(rèn)為，ER 陽性患者預(yù)后優(yōu)于ER 陰性患者，雌激素受體的情況是判斷預(yù)后的指標(biāo)。同時ER 表達狀況可作為乳腺癌化療敏感程度的一個指標(biāo)。匡忠生等［12］研究新輔助化療方案敏感性與ER、孕激素受體(progesterone receptor，PR)及人類表皮生長因子受體2(Human epithelial growth factor receptor 2，HER-2）表達情況，發(fā)現(xiàn)ER、PR 陰性或弱表達乳腺癌對CAF(環(huán)磷酰胺CTX+阿霉素ADM+氟尿嘧啶5-FU)、CAT(環(huán)磷酰胺CTX+阿霉素ADM+多西他賽TXT）方案更敏感。ERα與PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密切，Martin 等研究證實活化的Akt使ERα 中AF-1 區(qū)的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而實現(xiàn)表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1）對ERα的調(diào)節(jié)［13］。PI3K/Akt 信號通路也可能磷酸化ER，誘導(dǎo)ER 靶點的雌激素非依賴性激活和表達，導(dǎo)致內(nèi)分泌治療耐藥［14］。本實驗發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方乳巖寧聯(lián)合依西美坦可使p-Akt 及ERα蛋白表達水平下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)合組作用更顯著，與乳巖寧組、依西美坦組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明乳巖寧聯(lián)合依西美坦可能是通過下調(diào)癌組織中p-Akt、ERα蛋白表達抑制PI3K-Akt 信號通路的活性來抑制MCF-7乳腺癌增殖，也說明ERα與p-Akt 有密切聯(lián)系。與前期實驗研究結(jié)果一致，中藥乳巖寧聯(lián)合TAM可以使ERα蛋白表達減少，從而抑制乳腺癌生長［15］。

中醫(yī)認(rèn)為乳腺癌的病因病機與抑郁、憂思惱怒等情志因素及沖任失調(diào)有關(guān)。馮兆張《馮氏錦囊秘錄》中曰：“婦人有憂怒抑郁，朝夕積累，脾氣消阻，肝氣橫逆，氣血虧損，筋失營養(yǎng)，郁滯與痰結(jié)成隱核……積之漸大，數(shù)年而發(fā)，內(nèi)潰深爛，名曰乳巖。”乳巖寧方是我科協(xié)定處方，從肝入手，將調(diào)暢氣機理論應(yīng)用于乳腺癌治療，從《金匱要略》柴胡加龍骨牡蠣湯加減化裁而來。關(guān)于乳巖寧方我們進行了大量實驗研究［15-19］。本研究結(jié)果顯示，各干預(yù)措施能延緩MCF-7 乳腺癌細(xì)胞的周期進程，結(jié)合組效果最明顯。乳巖寧組與依西美坦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明中藥乳巖寧與依西美坦合用有協(xié)同抗腫瘤的作用。

綜上所述，乳巖寧聯(lián)合依西美坦抑制乳腺癌細(xì)胞增殖可能通過改變組織細(xì)胞周期進程，下調(diào)癌組織中ERα、p-Akt 蛋白表達來抑制PI3K-Akt信號通路的活性來實現(xiàn)，同時乳巖寧與依西美坦有協(xié)同作用。本研究未對ERα進行分型研究，今后需對PI3K-Akt下游基因進行深入研究。