傅永旺，張玉，武艷芳

急性一氧化碳（carbon monoxide，CO）中毒后3%～30%的患者經過2～3周的“假愈期”后出現(xiàn)記憶力下降、精神行為異常、運動障礙及尿便障礙等一系列臨床表現(xiàn)，稱為一氧化碳中毒遲發(fā)性腦?。╠elayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）［1-2］。目前，DEACMP的發(fā)病機制尚不清楚，而促凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific proteinase，Caspase）-3和抗凋亡因子B細胞淋巴瘤蛋白2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）是目前發(fā)現(xiàn)的非常重要的凋亡因子，二者在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用［3-4］。同時，CO中毒誘導的腦損傷與典型的缺血再灌注損傷極相似，但在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要凋亡作用的Caspase-3、細胞色素C（cytochrome C，CytC）、Bcl-2在DEACMP發(fā)病中的作用尚不清楚。本研究擬構建DEACMP大鼠模型，旨在分析其海馬神經元凋亡情況及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗時間為2021年3月。選取6周齡雄性SD大鼠30只，SPF級，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0014。實驗動物飼養(yǎng)條件：溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，所有實驗按照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南進行。

1.2 主要儀器和試劑 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，C1088），活性氧檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,E-BC-K138-F），辣根酶標記山羊抗鼠IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB-2305），兔抗Caspase-3（江蘇親科生物研究中心有限公司，AF6311），兔抗Bcl-2（江蘇親科生物研究中心有限公司，AF6139），兔抗CytC（proteintch Group.Inc，10993-1-ap，1/500），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB-2301），水迷宮（上海玉研科學儀器有限公司，JLBehv-MWMG），熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，CKX53），電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東博科科學儀器有限公司，DHP-9054），SuPerMax 3100型多功能酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組和模型制備 所有大鼠適應性飼養(yǎng)1周，將其隨機分為對照組（n=6）和模型組（n=24），然后進行6 d Morris水迷宮實驗，淘汰不合格大鼠，并隨機補充。模型組大鼠于Morris水迷宮實驗后第2天采用自然吸入CO中毒方法制備DEACMP模型，具體如下：在染毒箱內按照1∶5的比例通入O2和N2的混合氣體，然后通入CO，當CO達到3 000 ppm后開始靜態(tài)吸入CO染毒，染毒40 min后將大鼠置于空調房自然復蘇。染毒后模型組正常存活16只大鼠。對照組大鼠僅進行空氣暴露。

1.3.2 Morris水迷宮實驗 對照組和模型組大鼠均于中毒后1 d開始進行Morris水迷宮實驗，具體如下：將大鼠面向水迷宮池壁，在4個象限中點位置將其依次放入水中，自動記錄大鼠巡游軌跡及爬上安全島的過程。大鼠每次找到安全島后讓其休息30 s，然后再次放入水中進行下一次巡游。于中毒后7、14 d的相同時間點撤除水迷宮平臺，讓大鼠在某象限的中點面壁式入水，觀察120 s內其正確穿越平臺的次數(shù)，若＜3次則判定為DEACMP。模型組16只大鼠中發(fā)生DEACMP 7只（DEACMP組），未發(fā)生DEACMP 9只（無DEACMP組）。

1.3.3 TUNEL法檢測海馬組織神經元凋亡情況 采用TUNEL法檢測大鼠海馬組織神經元凋亡情況，具體如下：染毒14 d后，在對照組、DEACMP組、無DEACMP組中各選取6只大鼠進行麻醉，心臟采血，打開胸腔，剪去右心耳，采用20 ml注射器抽取20 ml冰生理鹽水，從左心室注入至右心耳不再流出血液為止，顱頂開口，取出大腦并置于冰上，4 ℃環(huán)境下分離大鼠雙側海馬區(qū)，將其置于液氮中保存。將左側海馬組織進行冰凍切片，采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒染色。綠色熒光標記的為凋亡細胞核，記為TUNEL陽性細胞，在400倍熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況，每張切片隨機選取6個圖像，并計算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.3.4 超氧化物陰離子熒光染色法檢測海馬組織活性氧表達情況 采用超氧化物陰離子熒光染色法檢測海馬組織活性氧表達情況。取各組大鼠左側海馬組織并置于滅菌離心管中，加入3 ml清理液（試劑一）浸泡15 s，采用鑷子取出組織，采用無菌綿紙吸干，即刻冰凍切片（厚度6 μm）。將冰凍切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圓圈，圈內滴加活性氧染液，避光，恒溫箱（37 ℃）孵育30 min。將載玻片置于PBS（pH值為7.4）中，在脫色搖床上晃動洗滌3次以充分混勻（5 min/次）。將切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光，室溫孵育3 min。將切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。DAPI染染液出來的細胞核在紫外光激發(fā)下為藍色，陽性表達為異硫氰酸呈綠色熒光。

1.3.5 Western blot法檢測海馬組織線粒體相關凋亡因子表達情況 采用Western blot法檢測海馬組織線粒體相關凋亡因子表達情況，具體如下：將右側海馬組織勻漿后提取總蛋白，于-20 ℃環(huán)境下保存。采用BCA試劑盒檢測細胞上清液中蛋白質濃度，繪制標準曲線。制作SDS-PAGE膠，上樣，開始跑膠，60 V電壓壓縮蛋白，80 V電壓分離蛋白（120 min），切好含有目標條帶或內參條帶的膠，將海綿、濾紙、膠、膜、濾紙、海綿等依次鋪好。采用遇冷的1×轉膜液浸沒目標膠帶復合物，使用300 mA恒流轉膜。使用1×TBST配置3%脫脂牛奶作為封閉液，封閉1 h。采用PVDF膜孵育一抗過夜。洗膜后采用1×TBST浸泡10 min（重復3次）。采用PVDF膜孵育二抗2 h。洗膜后用1×TBST浸泡10 min（重復3次）。采用發(fā)光液浸濕PVDF膜并置于超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影成像，檢測Caspase-3、CytC、Bcl-2表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件包進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DEACMP發(fā)生情況 Morris水迷宮實驗結果顯示，16只大鼠中發(fā)生DEACMP 7只，DEACMP發(fā)生于急性CO中毒后的7～14 d，見圖1。

圖1 對照組和DEACMP組大鼠Morris水迷宮實驗結果Figure 1 Morris water maze test results of rats in control group and DEACMP group

2.2 海馬組織神經元凋亡指數(shù) 對照組大鼠海馬組織神經元凋亡指數(shù)為（2.95±2.00）、無DEACMP組為（3.67±3.42）、DEACMP組為（5.89±4.12）。對照組、無DEACMP組、DEACMP組大鼠海馬組織神經元凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=3.653，P=0.033）。其中DEACMP組大鼠海馬組織神經元凋亡指數(shù)高于無DEACMP組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；無DEACMP組和對照組大鼠海馬組織神經元凋亡指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 對照組、無DEACMP組、DEACMP組大鼠海馬組織神經元凋亡情況（TUNEL染色，×400）Figure 2 Neuronal apoptosis in hippocampus of the among the control group，no DEACMP group and DEACMP group of rats

2.3 海馬組織活性氧表達情況 超氧化物陰離子熒光染色結果顯示，三組大鼠海馬組織均未檢測到活性氧，見圖3。

圖3 對照組、無DEACMP組、DEACMP組大鼠海馬組織活性氧表達情況（超氧化物陰離子熒光染色，×400）Figure 3 Expression of reactive oxygen species in hippocampus of the control group，no DEACMP group and DEACMP group of rats

2.4 海馬組織線粒體相關凋亡因子表達情況 三組大鼠海馬組織Caspase-3、CytC、Bcl-2表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中DEACMP組和無DEACMP組大鼠海馬組織Caspase-3、CytC表達水平高于對照組，DEACMP組大鼠海馬組織Caspase-3、CytC表達水平高于無DEACMP組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；DEACMP組和無DEACMP組大鼠海馬組織Bcl-2表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖4。

圖4 對照組、無DEACMP組、DEACMP組大鼠海馬組織線粒體相關凋亡因子的SDS-PAGE圖Figure 4 SDS-PAGE electrophoretogram of mitochondrial related apoptosis factors in hippocampus among the control group，no DEACMP group and DEACMP group of rats

表1 對照組、無DEACMP組、DEACMP組大鼠海馬組織線粒體相關凋亡因子表達情況比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of expression of mitochondrial related apoptosis factors in hippocampus among the control group，no DEACMP group and DEACMP group of rats

表1 對照組、無DEACMP組、DEACMP組大鼠海馬組織線粒體相關凋亡因子表達情況比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of expression of mitochondrial related apoptosis factors in hippocampus among the control group，no DEACMP group and DEACMP group of rats

注：Caspase=半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，CytC=細胞色素C，Bcl-2=B細胞淋巴瘤蛋白2；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與無DEACMP組比較，P＜0.05

組別 Caspase-3 CytC Bcl-2對照組 0.682±0.228 0.383±0.083 0.716±0.297無DEACMP組 1.046±0.145a 1.259±0.012a 0.284±0.083a DEACMP組 1.367±0.172ab 1.329±0.178ab 0.247±0.075a F值 12.893 64.578 6.061 P值 0.007 ＜0.05 0.036

3 討論

目前，DEACMP的發(fā)病機制尚不明確，而構建簡單、可靠的DEACMP動物模型是研究其發(fā)病機制的基礎。DEACMP的建模方法有腹腔注射CO中毒和自然吸入CO中毒兩種方式，其中自然吸入CO中毒與患者中毒過程相似，故本研究采用自然吸入CO中毒的DEACMP造模方法。判斷大鼠中毒后記憶力下降較常用的實驗是Morris水迷宮實驗，其結果可靠，且對動物的損傷較小。海馬區(qū)與學習、記憶功能有關，其損傷后會導致記憶力下降。而在臨床上DEACMP患者以認知障礙、記憶力下降為主要特征，提示可能與海馬區(qū)損傷有關。本研究結果顯示，DEACMP組大鼠海馬組織神經元凋亡指數(shù)高于無DEACMP組和對照組，提示DEACMP的發(fā)生可能與海馬組織神經元凋亡有關。

活性氧是自由基中最重要的一類活性分子。機體缺氧時，神經元能量代謝異常，腦內神經元出現(xiàn)大量鈣內流，線粒體呼吸功能受到抑制而產生氧自由基，這種線粒體途徑產生的氧自由基在神經元凋亡過程中發(fā)揮著重要作用［5-6］。線粒體（特別是損傷的線粒體）活性氧產生增加時可造成線粒體內氧化損傷，故檢測活性氧可以間接推測線粒體損傷的可能。但本研究結果顯示，三組大鼠海馬組織均未檢測到活性氧，分析其原因可能如下：由酶促抗氧化劑組成的抗氧化系統(tǒng)中和了額外的活性氧［7］，胞質中產生的大量CytC抑制了活性氧的產生［8］。

本研究結果顯示，DEACMP組和無DEACMP組大鼠海馬組織Caspase-3、CytC表達水平高于對照組，DEACMP組大鼠海馬組織Caspase-3、CytC表達水平高于無DEACMP組；DEACMP組和無DEACMP組大鼠海馬組織Bcl-2表達水平低于對照組，提示急性CO中毒后大鼠的海馬組織神經元就已經出現(xiàn)凋亡，且發(fā)生DEACMP的大鼠海馬組織神經元凋亡更明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺氧時線粒體功能會發(fā)生障礙，這使胞質中的ATP含量降低、鈣內流、自由基增加，促使CytC從線粒體內膜結合位點釋放入細胞質，激活Caspase-9，進而激活Caspase-3，最終引起神經元凋亡［9-10］。據(jù)此，研究者推測急性CO中毒患者的主要病因為缺氧，而缺氧可導致線粒體功能障礙，可能啟動線粒體途徑的細胞凋亡，引起促細胞凋亡因子水平升高和抗細胞凋亡因子水平下降。無DEACMP組和對照組大鼠海馬組織神經元凋亡指數(shù)比較無統(tǒng)計學差異，推測CO中毒后神經元凋亡過程可能是漸進性的，而未發(fā)生DEACMP的大鼠CO中毒后海馬組織神經元凋亡程序可能被某種機制抑制，這是否與凋亡抑制因子有關目前尚不清楚。Bcl-2家族是目前發(fā)現(xiàn)的非常重要的抗凋亡相關蛋白家族，包括抗凋亡的Bcl-2亞族和促凋亡的Bax亞族。Bcl-2家族各成員之間的相互作用可控制線粒體外膜透化作用（mitochondrial membrane permeation，MOMP），且細胞凋亡的線粒體途徑表現(xiàn)為MOMP和CytC的活化［11］，進而抑制CytC的釋放及Caspase的激活，從而發(fā)揮抗凋亡作用［12］。

綜上所述，DEACMP大鼠存在海馬組織神經元凋亡，其機制可能與Caspase-3、CytC表達水平升高及Bcl-2表達水平降低有關。但凋亡因子Caspase-3、CytC、Bcl-2參與DEACMP的具體機制仍有待進一步研究證實。

作者貢獻：傅永旺進行文章的構思與設計、實施與可行性分析，負責撰寫、修訂論文，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理；傅永旺、張玉、武艷芳進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析，結果分析與解釋。

本文無利益沖突。