王 璐，楊濱銀，王小琴，孫路明，庹見偉

（阿克蘇地區(qū)疾病預(yù)防控制中心，新疆阿克蘇 843000）

紅棗富含紅棗多糖、維生素、氨基酸、環(huán)磷酸腺苷、黃酮類化合物等生理活性物質(zhì)[1-2]，其中重要的是黃酮類物質(zhì)[3]，研究結(jié)果表明，生物類黃酮具有多種生物活性，因此紅棗有“百果之王”的美稱[4]。

蘆丁是紅棗中重要的活性成分之一，具有較高的醫(yī)用和藥用價值[5]，能降低毛細(xì)血管通透性和脆性，促進(jìn)細(xì)胞增殖和防止血細(xì)胞凝聚，以及發(fā)揮抗炎、抗過敏、利尿、解痙、鎮(zhèn)咳、降血脂等作用[6]。目前紅棗是新疆林果類產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)項(xiàng)目之一，紅棗果實(shí)在成熟期落果率達(dá)到25%，紅棗的加工過程中也會產(chǎn)生部分級外果品[7]。級外紅棗絕大多數(shù)以廢物的形式丟棄或作為燃料被燃燒掉，未能實(shí)現(xiàn)更高附加值的資源利用。紅棗蘆丁的提取實(shí)現(xiàn)了級外果的有效利用和價值提升。

目前，紅棗蘆丁的測定主要有分光光度法和高效液相色譜法[8-13]，高效液相色譜對于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性化合物的分離分析有較大的優(yōu)勢；微波萃取無需干燥等預(yù)處理，簡化了工藝，對天然產(chǎn)物的提取具有選擇性高、操作時間短、溶劑用量少、有效成分得率高、浸出過程材料細(xì)粉不凝聚、不糊化等優(yōu)點(diǎn)；二者結(jié)合能夠優(yōu)勢互補(bǔ)、相輔相成。目前采用微波萃取技術(shù)提取級外紅棗中蘆丁含量的高效液相色譜法分析的報(bào)道較少。本文通過微波萃取前處理方法提取紅棗蘆丁，采用高效液相色譜儀測定紅棗中的蘆丁，并優(yōu)化工藝條件，為充分利用紅棗落棗及級外棗中的蘆丁提供依據(jù)，從而充分發(fā)揮紅棗的醫(yī)用價值，解決紅棗落棗及級外棗銷售不暢的難題，同時提高了紅棗收益和農(nóng)民收入。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用紅棗為級外灰棗干品，產(chǎn)地為新疆阿克蘇市。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98.0%，CAS#153-18-4；無水乙醇，純度99.7%，分析純，萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；磷酸，分析純，85wt%，西亞化工技術(shù)公司（山東）；甲醇，色譜純，99.99%，美國Fisher 公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q 凈化制得。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC 液相色譜儀，ACQuity Arc，美國Waters 公司；202 型電熱恒溫干燥箱，上海申光儀器儀表有限公司；BSA224S-CW 分析天平，賽多利斯科儀器有限公司；AS10200BDT 超聲儀，天津奧特賽斯儀器有限公司；TGL-18MS 離心機(jī)，上海盧湘儀儀器有限公司；MARS 全自動固相萃取儀，美國GEM公司。

1.3 方法

1.3.1 紅棗中蘆丁的提取與分析

原料→干燥→磨粉→過篩→加乙醇浸提→在微波下萃取→過濾→氮吹濃縮→蘆丁提取液→HPLC 分析

1.3.2 操作要點(diǎn)

將紅棗樣品切成細(xì)條，去核，放入50 ℃烘箱中烘干，然后粉碎過80 目篩，備用。準(zhǔn)確稱取0.300 0 g（精確至0.000 1 g）于50 mL 離心管中，加入一定量30%乙醇水溶液，微波萃取2 min，冷卻至室溫后用水定容至50 mL。在4 000 r/min 下離心10 min，取上清液，過0.22 μm 濾膜，HPLC 上機(jī)測定。

1.3.3 微波萃取輔助乙醇浸提技術(shù)參數(shù)優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取紅棗粉0.300 0 g，萃取時間2 min，料液比1∶15 條件下，分別加入不同濃度（50%、60%、70%、80%、90%、100%）的乙醇4.5 mL，微波功率分別按功率300、350、400、450、500 W 提取，采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察乙醇濃度和微波功率。

1.3.4 HPLC 條件優(yōu)化方法

影響HPLC 檢測效果的因素主要有檢測波長、流動相、柱溫和流速，分別考察對蘆丁峰面積的影響。采用二極管陣列檢測器對波長進(jìn)行考察，選擇247～358 nm 波長范圍進(jìn)行全波長掃描；分別以甲醇-水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液和乙醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相，設(shè)置不同配比（30∶70、35∶65、40∶60、45∶55）；柱溫采用30、40、50 ℃三個水平，流速采用0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 四個水平，對標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測定。

1.4 測定指標(biāo)與方法

參照中國藥典和其他文獻(xiàn)[14-15]，精密吸取對照品溶液與紅棗提取液注入高效液相色譜儀中，采用外標(biāo)法測定蘆丁含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算紅棗樣品液中蘆丁的質(zhì)量濃度，并根據(jù)公式（1）計(jì)算其蘆丁的得率Y。

式中，Y為蘆丁的得率,%；M為樣品溶液中蘆丁的質(zhì)量，mg；m為用于提取的棗粉質(zhì)量，mg。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3 次，取平均值。蘆丁含量采用的外標(biāo)法，通過液相色譜儀相配套的Empower 3 色譜數(shù)據(jù)處理軟件完成相關(guān)成數(shù)據(jù)采集與處理，采用Excel 97-2003 數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助乙醇提取條件的選擇

2.1.1 乙醇濃度的選擇

如圖1 所示，隨著乙醇濃度的增加，蘆丁提取量先增加后減少，當(dāng)乙醇濃度為70%時，蘆丁提取量最大，為0.262 g/100 g。因此，乙醇濃度選擇70%。

圖1 乙醇濃度對蘆丁含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on rutin content

2.1.2 微波功率的選擇

如圖2 所示，隨著微波功率的增大，蘆丁含量先增加后減少，當(dāng)微波功率為400 W 時，蘆丁含量最高，為0.264 g/100 g。因此，微波提取功率選擇400 W。

圖2 微波功率對蘆丁含量的影響Fig.2 Effect of microwave power on rutin content

2.2 HPLC 條件的選擇

2.2.1 檢測波長的選擇試驗(yàn)測得最佳吸收波長為274 nm，峰面積最高為124 238，靈敏度最高。因此檢測波長選擇274 nm。

2.2.2 流動相的選擇

由色譜峰出峰時間結(jié)果顯示，單標(biāo)蘆丁溶液的保留時間隨流動相組成變化有較大變化，流動相中甲醇比例從45%降到30%時，蘆丁保留時間從6.04 min 延長至21.25 min，說明流動相中甲醇比例降低，流動相極性增強(qiáng)，延長了蘆丁的出峰時間。陳靜等[16]在研究甲醇流動相比例對蘆丁出峰影響時得出，當(dāng)甲醇比例從60%降至30%時，蘆丁組分的保留時間延長了21 min，與試驗(yàn)結(jié)果變化趨勢相似?？紤]到紅棗中含有色素較多以及組分的復(fù)雜性，蘆丁的保留時間以12 min 左右較宜，故選擇流動相組成為甲醇-0.5%磷酸水溶液=40∶60。

2.2.3 色譜柱柱溫的選擇

在柱溫為30、40、50 ℃條件下，對紅棗蘆丁提取液進(jìn)行分析得出，隨著柱溫的增加，柱壓下降，洗脫效率增強(qiáng)，蘆丁出峰時間提前，柱溫過高影響儀器和色譜柱的壽命。因此柱溫選擇40 ℃。

2.2.4 流速的選擇

流速過高，不但不利于儀器和色譜柱的保護(hù)，同時造成流動相的浪費(fèi)；流速過低，蘆丁的出峰時間延長。本實(shí)驗(yàn)在流速0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 條件下測得在流速為0.8 mL/min 時，得到的色譜峰出峰時間和靈敏度最好，故流速選擇0.8 mL/min。

2.3 樣品的測定

精確稱取同一批次級外紅棗樣品6 份，按最佳的色譜條件，即色譜柱為Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）；在檢測波長為274 nm，用甲醇-0.5%磷酸水溶液（40∶60）為流動相，流速為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃，分別制備供試樣品溶液，進(jìn)樣量1 μL，測定各樣品溶液蘆丁峰面積，蘆丁提取量最高為0.264 g/100 g，計(jì)算蘆丁含量間的RSD 為2.6%，表明該方法可以作為提取紅棗中蘆丁的色譜方法且重復(fù)性良好。

3 方法學(xué)考察

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品于105 ℃下干燥至恒質(zhì)量，并于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用甲醇溶液分3 次洗滌燒杯，并移入10 mL 容量瓶中，配制成1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

表1 蘆丁加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recovery and relative standard deviation of rutin

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、50、100、150、200、300、400 μL，用甲醇定容至1 mL，混勻進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以蘆丁進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=-6.35×10-2X+2.32×10-3，R2=0.9992；蘆丁對照品濃度在50～400μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.2 精密度

用空白樣品配制濃度范圍為50 μg/mL 的基質(zhì)溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，蘆丁相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為0.633%，小于5%（n=5），表明儀器精密性良好。

3.3 加標(biāo)回收率

用空白樣品配制濃度范圍為0～400 μg/mL 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別進(jìn)行20、50、100 mg/kg 的添加回收試驗(yàn)（n=6）。利用添加水平50 mg/kg 的測量結(jié)果計(jì)算檢出限和定量限，以信噪比S/N=3 確定方法檢出限為1～5 mg/kg；以信噪比S/N=10 確定方法定量限為20～50 mg/kg。蘆丁在3 個不同添加水平下，回收率介于90.1%～98.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于20%。

4 結(jié)論

此次試驗(yàn)建立了高效液相色譜法測定紅棗中蘆丁的方法，通過優(yōu)化微波強(qiáng)化提取條件，建立了經(jīng)濟(jì)、快捷的微波強(qiáng)化前處理方法，建立色譜條件為以甲醇-0.5%磷酸（40∶60）為流動相，在柱溫為40 ℃、用70%的乙醇1∶15 的料液比、400 W 的萃取條件下，紅棗中的蘆丁提取量最高為0.264 g/100 g，比趙志勇等[9]在響應(yīng)面法優(yōu)化新疆紅棗總黃酮乙醇提取工藝中提取得到蘆丁含量稍高，說明微波強(qiáng)化前處理比傳統(tǒng)的前處理更為快速簡單、穩(wěn)定高效。試驗(yàn)結(jié)果表明HPLC 方法測得蘆丁濃度為50～400 μg/mL，蘆丁濃度與峰面積線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性良好，樣品回收率介于90.1%～98.5%之間，蘆丁在3 個添加水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于20%（n=6）?？傮w上該方法簡單、快速、準(zhǔn)確度高、精密度好，完全能夠滿足紅棗中蘆丁成分測定的需求，可以為新疆級外紅棗的綜合利用及其深加工技術(shù)的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。