康兆廣，武笑穎，周莉莉，孫勝敏，王一村，侯廣月，王蘋(píng)蘋(píng)，袁 雪，姜 鑫，李梓源，李延臻，欒文惠

（山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（山東），山東濟(jì)南 250102）

環(huán)酰菌胺是一種新型酰胺類(lèi)內(nèi)吸性殺菌劑，可以有效防治農(nóng)作物灰霉病、菌核病等腐爛病害，對(duì)其他種類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的菌群也有效，該農(nóng)藥主要用于防治蔬菜、水果等各類(lèi)農(nóng)作物的病害[1-3]。由于其不易產(chǎn)生交互抗性，對(duì)各類(lèi)作物安全性高、對(duì)環(huán)境友好性強(qiáng)，環(huán)酰菌胺是一種應(yīng)用前景較好的新型殺菌劑[4-6]?；谏锇踩紤]，CAC、歐盟和日本等國(guó)家和地區(qū)所制定的環(huán)酰菌胺在各類(lèi)食品中最高殘留限量為0.02～30 mg/kg[7-9]。國(guó)內(nèi)外對(duì)該化合物殘留檢測(cè)方法的報(bào)道較少[10-15]，而且國(guó)內(nèi)殘留分析前處理方法較繁瑣[16-19]，如《JAP-068 環(huán)酰菌胺檢測(cè)方法》，前處理過(guò)程所用試劑較多，且重復(fù)多次提取，最終凈化上機(jī)過(guò)程相當(dāng)繁瑣。因此，研究易腐果蔬中環(huán)酰菌胺快速準(zhǔn)確的分析方法極為必要。

本研究參照QuEChERS 前處理技術(shù)的分散固相萃取技術(shù)[20-21]，采用混合吸附劑凈化，擬建立一種用氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS）法測(cè)定果蔬中的環(huán)酰菌胺。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 種基質(zhì)（桑葚、草莓、葡萄、菠菜、小白菜）均為市售，2022 年3 月10 日于濟(jì)南市七里堡綜合批發(fā)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，每種各3 kg。

乙腈、丙酮，均為色譜純，德國(guó)Merke 公司；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用前在450 ℃烘5 h，冷卻至200 ℃時(shí)取出置于干燥器內(nèi)備用；Cleanert PSA 凈化劑、Cleanert ODS C18-N 凈化劑、Cleanert Pesti Carb 凈化劑，天津博納艾杰爾科技有限公司；環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，CAS 號(hào)：126833-17-8，分子式：C14H17Cl2NO2，純度≥99.5%，德國(guó)Dr Ehrenstorfer GmbH 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 8890-7010B 氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent 公司；T25 高速分散機(jī)，德國(guó)IKA 公司；Sigma 3-30K 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；Al204 分析天平，感量0.01 mg，瑞士Mettler 公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品10.05 mg置于50 mL 小燒杯中，用丙酮溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，然后多次洗滌小燒杯并將其轉(zhuǎn)移至容量瓶中，最后用丙酮定容至刻度，分別配成500 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確吸取環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL 于50 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配成10 μg/mL 環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)中間液。然后準(zhǔn)確吸取1 mL、10 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于10 mL 容量瓶中，用丙酮定容，配成1.0 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要使用前用空白樣品基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 測(cè)定條件

（1）色譜條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：100 ℃保持3 min，然后以30 ℃/min 程序升溫至280 ℃保持2 min，再以20 ℃/min 升溫至330 ℃保持4.5 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL/min；碰撞氣：氮?dú)?，純度?9.999%，流速1.5 mL/min；淬滅氣：氦氣，純度≥99.999%，流速2.25 mL/min；進(jìn)樣口溫度：330 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：280℃；MS傳輸線(xiàn)溫度：330℃；溶劑延遲：4min。

（2）質(zhì)譜條件

多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）：環(huán)酰菌胺選擇一對(duì)定量離子。兩對(duì)定性離子。環(huán)酰菌胺的保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和碰撞電壓等參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 環(huán)酰菌胺質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Instrumental parameter setting for MS-MS detection of fenhexamid

1.3.3 樣品前處理

將所購(gòu)樣品用四分法取出500 g，用破壁機(jī)粉碎。稱(chēng)取10.00 g 粉碎后的均勻樣品置于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL 乙腈溶液、5.0 g 氯化鈉、4 g 無(wú)水硫酸鎂，渦旋提取。以5 000 r/min 離心5 min。吸取2.0 mL 上層有機(jī)相，轉(zhuǎn)移至裝有100 mg Cleanert ODS C18-N、50 mg Cleanert PSA 粉末的離心管中，渦旋2 min，5 000 r/min 離心5 min。取上清液1.0 mL，水浴45 ℃氮吹至近干，用1.0 mL 丙酮復(fù)溶，過(guò)0.22 μm 濾膜后，供氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定使用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Agilent 8890-7010B 氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀自帶的定量分析軟件Agilent MassHunter Workstation 10.1 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入數(shù)據(jù)處理軟件，使用標(biāo)液建立校正曲線(xiàn)，根據(jù)定量離子對(duì)、定性離子對(duì)以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出峰時(shí)間對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行定量、定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇

環(huán)酰菌胺沸點(diǎn)為320 ℃，進(jìn)樣口溫度選擇330 ℃，柱箱升溫程序初始溫度選擇100 ℃保持3 min，使目標(biāo)物在初始時(shí)在色譜柱前端凝結(jié)匯聚，目標(biāo)物半峰寬更小，峰形更為對(duì)稱(chēng)。以30 ℃/min 程序升溫至280 ℃保持2 min，以較高的升溫速率使目標(biāo)物快速氣化。再以20 ℃/min 升溫至330 ℃，保持4.5 min，除去高沸點(diǎn)雜質(zhì)。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)環(huán)酰菌胺質(zhì)譜圖（圖1）及其斷裂機(jī)理，選擇豐度高、質(zhì)荷比大的97、177 和179 作為特征離子，通過(guò)Q2進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞，通過(guò)Q3 掃描得到一系列碎片離子圖，選擇豐度高碎片離子用來(lái)定量，另一個(gè)用來(lái)輔助定性，從而建立經(jīng)典的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描。

圖1 環(huán)酰菌胺質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrogram of fenhexamid

最 終 選 定5 對(duì) 離 子 對(duì)：97.1-55.1（10 eV）、177.1-113.0（15 eV）、177.1-78.0（25 eV）、179.0-115.0（15 eV）、179.0-78.0（25 eV）進(jìn)行測(cè)試優(yōu)化。

環(huán)酰菌胺總離子流圖及5 對(duì)離子對(duì)譜MRM圖分別見(jiàn)圖2、3。其中97.1-55.1（10 eV）、179.0-115.0（15 eV）兩對(duì)離子對(duì)干擾較大，97.1-55.1（10 eV）離子對(duì)的周?chē)s峰較多，179.0-115.0（15 eV）離子對(duì)響應(yīng)值較低且基線(xiàn)漂移嚴(yán)重，對(duì)目標(biāo)物的定性定量干擾嚴(yán)重?？墒褂昧硗馊龑?duì)離子對(duì)進(jìn)行定量、定性，這三對(duì)離子對(duì)響應(yīng)值高、干擾小，有利于對(duì)目標(biāo)物的定量定性。選取響應(yīng)值較大的177.1-78.0（25 eV）作為定量離子對(duì)。

圖2 環(huán)酰菌胺的TIC 圖Fig.2 TIC of fenhexamid

圖3 環(huán)酰菌胺的MRM 色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of fenhexamid

圖4 環(huán)酰菌胺的TIC 圖Fig.4 TIC of fenhexamid

圖5 環(huán)酰菌胺的MRM 色譜圖Fig.5 MRM chromatogram of fenhexamid

圖6 離子對(duì)177.1-78.0、177.1-113.0、179.0-78.0 的MRMFig.6 MRM chromatogram of 177.1-78.0、177.1-113.0、179.0-78.0

由圖4、5、6（見(jiàn)上頁(yè)）可以看出，使用所選定的三對(duì)離子對(duì)后，TIC、MRM圖在目標(biāo)峰位置周?chē)鸁o(wú)雜峰干擾、響應(yīng)值高。選取這三對(duì)離子對(duì)進(jìn)行定量、定性分析較為可行。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 定量限與線(xiàn)性關(guān)系

配制環(huán)酰菌胺農(nóng)藥混標(biāo)溶液，稀釋成一定梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最佳的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。逐步稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10 倍信噪比所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法定量限，最終確定定量限為0.01 mg/kg。線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 環(huán)酰菌胺線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equation and correlation coefficient of fenhexamid

2.3.2 回收率與精密度

在陰性桑葚、草莓、葡萄、菠菜和小白菜樣品中各添加3 個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按1.3.3 所述前處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)6 次，測(cè)得精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，不同添加濃度的平均回收率為88.83%～98.50%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～5.5%，這表明該方法的準(zhǔn)確度及精密度均可達(dá)到定量分析的要求。

表3 樣品中環(huán)酰菌胺的回收率和精密度（n=6）Table 3 Mean recoveries and precisions of fenhexamid in sample (n=6)

2.4 實(shí)際樣品分析

采用所建立的方法對(duì)市售的30 批（5 種基質(zhì)各6 批次）樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出2 批次（葡萄1 批次，小白菜1 批次），檢出值分別為0.082 mg/kg 和0.051 mg/kg。證明該方法準(zhǔn)確可靠，能夠有效的為市場(chǎng)把關(guān)。

3 結(jié)論

本文使用QuEChERS 前處理技術(shù)的分散固相萃取技術(shù)，經(jīng)離子對(duì)優(yōu)化選擇，建立易腐蔬菜和水果中環(huán)酰菌胺殘留的氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法用乙腈提取樣品中的環(huán)酰菌胺殘留，同時(shí)采用乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅烷鍵合相混合吸附劑對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。將此前處理方法結(jié)合GC-MS/MS 應(yīng)用于易腐果蔬中環(huán)酰菌胺的同時(shí)定性確證和定量檢測(cè)，結(jié)果較好。該方法具有簡(jiǎn)單快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，能完全滿(mǎn)足國(guó)際殘留限量的檢測(cè)要求。