向 雙，楊杰斌，沈昌瓊，任必勇，段 松

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)大規(guī)模流行的傳染性疾病，WHO(2020)報道我國新發(fā)病例數(shù)約83.3萬，為結(jié)核病高負擔(dān)國家之一。結(jié)核病常用影像學(xué)及免疫學(xué)方法進行診斷，但影像學(xué)鑒別肺部結(jié)核及感染性疾病較為困難，而采用痰液及分泌物涂片培養(yǎng)等相關(guān)檢查的時效性較差。此外，臨床工作中在肺外部位也多見結(jié)核感染，肺外結(jié)核感染尚缺乏有力的診斷方法，需取活檢進行病理學(xué)確診。傳統(tǒng)病理診斷結(jié)核依靠于鏡下形態(tài)和抗酸染色，但抗酸染色陽性率較低[1-2]。分子生物學(xué)檢測結(jié)核菌相關(guān)研究多集中在肺、分泌物、骨組織[3]等標(biāo)本類型，對病理工作中常見手術(shù)活檢樣本的研究較少。因此，本文著重探討一種準(zhǔn)確快速的病原學(xué)檢測方法輔助組織學(xué)診斷，以期提高結(jié)核病理診斷準(zhǔn)確性，為臨床和患者提供可靠診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年1～9月重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院經(jīng)病理診斷的結(jié)核病變手術(shù)標(biāo)本131例，男性69例，女性62例，年齡11～86歲；平均47.7歲。按部位分為五組，肺組：29例；胸膜組：22例；頭頸組：腮腺2例、頰部1例、鼻咽喉部4例、淋巴結(jié)20例(合計27例)；骨關(guān)節(jié)組：椎體12例、髖關(guān)節(jié)2例、足踝跟部8例(合計22例)；胸腹組：乳腺7例、盆腔3例、睪丸9例、腎7例、腸道5例(合計31例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)衛(wèi)健委WS 196-2017《結(jié)核病分類》中的肺及肺外結(jié)核[4]；(2)病理組織學(xué)表現(xiàn)符合中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS 288-2017)附錄C2.2條款[5]即可病理確診陽性；(3)患者入院同期進行免疫學(xué)結(jié)核感染T細胞檢測(TB-IGRA)。排除標(biāo)準(zhǔn)：樣本量<0.2 cm3。

1.2 方法選擇HE染色鏡下符合結(jié)核病變蠟塊(圖1)，標(biāo)本厚5 μm連續(xù)切片15張，置于EP管中，使用QIAGEN FFPE樣本提取試劑盒，按試劑盒說明書進行脫蠟消化。切下組織標(biāo)本量多時需按比例增加緩沖液和蛋白酶體積并震蕩混勻。組織體積小于0.5 cm3金屬浴56 ℃孵育2 h，大于0.5 cm3經(jīng)56 ℃孵育過夜。

圖1 肉芽腫性炎伴凝固性壞死，見多核巨細胞，HE染色 圖2 肉芽腫性炎伴凝固性壞死，見多核巨細胞，抗酸染色

1.3 抗酸染色選擇HE染色鏡下符合結(jié)核病變蠟塊，切片5 μm厚，使用邁新MST-8010進行抗酸染色，具體操作步驟按試劑盒說明書，并設(shè)陽性對照(圖2)。

1.4 Xpert MTB/RIF檢測樣本消化后經(jīng)90 ℃孵育1 h，取出待冷卻加入1 mL Xpert MTB/RIF配套SR試劑混勻靜置1 h。將處理好的樣本轉(zhuǎn)至試劑匣，再加入1 mL SR試劑，上機總體積為2.4 mL。試劑匣放入Cepheid GeneXpert儀器，按照SPO規(guī)程操作新建運行程序，判讀結(jié)果(圖3)。

圖3 Xpert陽性檢測：QC-1、QC-2：試劑盒質(zhì)控?zé)晒?，SPC:內(nèi)部質(zhì)控，ProbeA-E探針依次覆蓋rpoB基因81 bp 507-533密碼子

1.5 TB-IGRA檢測131例患者在住院期間，均進行免疫學(xué)結(jié)核T細胞感染檢測(TB-IGRA)。

1.6 結(jié)果判讀抗酸染色判讀由一位主管技師和一位主治醫(yī)師采用雙盲法閱片，以降低人為主觀漏診。Xpert結(jié)果為自動判讀，由主管技師對實驗內(nèi)對照和擴增曲線進行復(fù)核，降低實驗誤差。TB-IGRA結(jié)果為儀器自動判讀，由一位檢驗師進行實驗結(jié)果復(fù)核。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計算各組陽性率，計數(shù)資料以“n(%)”表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較時采用χ2分割，a =a/c，c為比較的總次數(shù)，即c=k(k-1)/2，k為試驗組數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 總體檢出率五組標(biāo)本合計131例，三種檢測方法的總陽性率從高到低依次為：TB-IGRA檢測陽性率93.12%(122例)，Xpert檢測陽性率67.17%(88例)，抗酸染色陽性率36.64%(48例)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)

2.2 抗酸、Xpert、TB-IGRA三種方法的比較肺、頭頸、骨關(guān)節(jié)、胸腹組中TB-IGRA、Xpert、抗酸染色兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。胸膜組TB-IGRA與抗酸染色、Xpert檢測比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。此外，胸膜組其抗酸染色和Xpert檢測陽性率低于肺、頭頸、骨關(guān)節(jié)及胸腹組，Xpert檢測法與其余四組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同部位組織及三種檢測方法陽性率比較

2.3 TB-IGRA與結(jié)核感染部位的關(guān)系分析131例患者TB-IGRA檢測結(jié)果，所有部位均有較高陽性率，且其陽性率與結(jié)核感染部位差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 石蠟樣本結(jié)核檢出率與檢測方法的關(guān)系本實驗結(jié)果顯示：石蠟樣本Xpert檢測陽性率67.17%(88/131)，抗酸染色陽性率36.64%(48/131)。該兩種方法檢出率在肺、頭頸、骨關(guān)節(jié)、胸腹各組間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示在不同部位活檢標(biāo)本中Xpert檢測和抗酸染色的檢測能力較一致。

2.5 聯(lián)合檢測TB-IGRA陰性患者分析131例患者TB-IGRA檢測陰性者9例，采用抗酸染色檢測9例陰性患者，其中有2例陽性；經(jīng)Xpert檢測9例陰性患者，其中4例陽性，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

2019年國家八部門聯(lián)合印發(fā)《遏制結(jié)核病行動計劃(2019～2022年)》，要求最大限度發(fā)現(xiàn)患者，推廣方便快捷的檢測技術(shù)，提高診斷準(zhǔn)確性。目前，結(jié)核實驗室檢查方法主要有抗酸染色、TB-IGRA、細菌培養(yǎng)、抗體檢測等方法。肺外結(jié)核因其感染位置深、病灶小的特點，以上方法診斷效果欠佳，臨床工作中需取組織進行病理確診[6]。此外，WS288-2017衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也指出病理學(xué)可確診結(jié)核陽性，不足的是組織形態(tài)學(xué)對結(jié)核只能達到Ⅱ類提示性診斷報告標(biāo)準(zhǔn)[7]，因此采取一種檢測方法支撐病理報告提升到Ⅰ類明確診斷水平，對臨床患者具有重要的實際意義。

病理工作中常在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上行抗酸染色，該染色為經(jīng)典結(jié)核分枝桿菌檢查方法，具有臨床使用早、應(yīng)用廣、染色快、價格便宜等優(yōu)點。不足的是其對抗酸類桿菌都能陽性染色，鑒別陽性菌是否為結(jié)核分枝桿菌存在困難。本實驗及相關(guān)研究中抗酸染色陽性檢出率為30%～60%[8-9]，總陽性率較低。2010年TB-IGRA檢測被寫入美國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核診療指南，現(xiàn)已逐漸成為臨床應(yīng)用的免疫學(xué)方法，對肺及肺外結(jié)核的檢出率均高于抗酸和Xpert染色(P<0.01)。對于臨床癥狀明顯有既往史或影像學(xué)支持的患者，可較好地輔助診斷活動期結(jié)核，而對癥狀不明顯無其它結(jié)果支持的病例，即使TB-IGRA陽性也無法鑒別患者活動期結(jié)核或既往感染。Xpert MTB/RIF為WHO推薦結(jié)核分枝桿菌檢測方法，其設(shè)計之初標(biāo)本類型僅適用于痰液，在病理診斷中應(yīng)用較少。賈晨光等[10]應(yīng)用骨組織檢測約34%陽性率，也有研究者將新鮮組織標(biāo)本用于Xpert平臺，其檢出率高于石蠟樣本[11]，這可能與石蠟樣本DNA質(zhì)量及儲存時間有關(guān)[12]。2017年Xpert MTB/RIF的升級版Xpert MTB/RIF Ultra也被WHO推薦使用，相關(guān)研究表明該平臺檢測石蠟標(biāo)本的效果優(yōu)于Xpert MTB/RIF，不足的是該機型在我國普及率較低，未在臨床中推廣使用。

本實驗Xpert檢測陽性率為67.17%，各組中對比抗酸染色均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。胸膜組22例樣本中內(nèi)鏡鉗取標(biāo)本10例，組織直徑0.2～0.5 cm，占45.45%(10/22)。胸膜組內(nèi)鏡標(biāo)本抗酸陽性者，在鏡下觀察抗酸桿菌均為散在少量分布。胸膜組抗酸染色與Xpert檢出率偏低，筆者認為其原因與胸膜標(biāo)本取材方式相關(guān)，取樣體積小，結(jié)核菌被取到幾率相對較低。另外，本組觀察抗酸陽性與Xpert陽性病例中，有4例為其中一種檢測陽性；這可能是因抗酸桿菌在組織病灶中分布不均，切片時的平面差異導(dǎo)致組織蠟塊結(jié)核菌檢出率降低。結(jié)合本實驗和實際工作，應(yīng)將第1張切片行抗酸染色，切15張行Xpert檢測有助于提高檢出率。

綜上所述，在病理診斷工作中，對疑似或初診結(jié)核患者應(yīng)盡早行組織標(biāo)本Xpert檢查。其是一種較好的輔助手段，可同時檢測結(jié)核感染與利福平耐藥。對無法取組織的患者可送檢膿液壞死物等，以彌補TB-IGRA檢測對結(jié)核感染狀態(tài)無特異性，抗酸染色無法確認結(jié)核菌的缺點。本試驗將細菌學(xué)抗酸染色、免疫學(xué)TB-IGRA、分子生物學(xué)Xpert三種方法進行聯(lián)合分析，初步探討了應(yīng)用范圍和效果，取得了較好臨床意義。不足的是因樣本量相對較少未檢出利福平耐藥的患者，對組織取樣大小與檢出率的關(guān)系尚需積累更多樣本進一步分析。