史春田，毛姝然，彭譯萱，肖志波

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 整形外科， 黑龍江 哈爾濱 150086)

增生性瘢痕(hyperplastic scar，HS)是一種由異常組織修復(fù)過(guò)程引起的皮膚纖維化疾病[1]，是皮膚損傷后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，其病因尚不清楚。成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖分化及細(xì)胞外基質(zhì)沉積是瘢痕形成的典型病理特征。據(jù)報(bào)道，高達(dá)70%的患者在燒傷后出現(xiàn)HS, 40%～70%的患者術(shù)后出現(xiàn)HS[2]。

皮膚纖維化的發(fā)病率與性別顯著相關(guān)，總體比例(女性:男性)約為6∶1，在生育期間達(dá)到10∶1[3-4]。雖然皮膚纖維化在女性中更常見(jiàn)，但來(lái)自歐洲硬皮病試驗(yàn)和研究(EUSTAR)組的數(shù)據(jù)顯示，男性皮膚纖維化表現(xiàn)出更嚴(yán)重的表型，且預(yù)后更差[3]。且證實(shí)Balb/C、C57BL/6和DBA/2雄性小鼠比雌性小鼠更容易發(fā)生明顯的纖維化[5]。盡管瘢痕形成過(guò)程中存在公認(rèn)的性別偏倚，但其確切作用及相關(guān)分子基礎(chǔ)仍然知之甚少。特別是性激素在調(diào)節(jié)瘢痕形成中的作用尚未明確。有研究表明，雌激素誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞功能障礙，并增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，而其他一些研究報(bào)道，雌激素治療后膠原蛋白的產(chǎn)生減少[6-7]。因此，更詳細(xì)探討干擾性激素在真皮纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用具有重要意義。鑒于他莫昔芬是一種雌激素受體調(diào)節(jié)劑，評(píng)估他莫昔芬對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的真皮成纖維細(xì)胞的病理性增生的影響，具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒，PV-9000(ZSGB-BIO公司)；TGF-β1(R&D公司)；他莫昔芬(Selleck公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScript RT Master Mix、Ex Taq(TaKaRa公司)；α-SMA抗體(Sigma-Aldrich公司)；MTS試劑盒(Promege公司)；Bradford Protein Assay試劑盒(Bio-Rad公司)；Trizol試劑、熒光標(biāo)記二抗(Invitrogen公司)；Alexa Flour594、DAPI、Fibronectin和α-SMA抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng):無(wú)菌條件下采集人皮膚成纖維細(xì)胞標(biāo)本(來(lái)自于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院)，浸于含5%鏈霉素的PBS中。用無(wú)菌剪刀剪至真皮層，將組織切成1 cm×1 cm×1 cm大小，均勻放入75 cm2培養(yǎng)皿中。加入含有10%胎牛血清和1%鏈霉素-青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，直至組織牢固附著于皿底(4～6 h)，然后在37 ℃、5% CO2的空氣中培養(yǎng)。每3 d換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合達(dá)到90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶使細(xì)胞傳代。3～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

所有患者已簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施(倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：KY2021-320)。

1.2.2 成纖維細(xì)胞鑒定:Vimentin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定成纖維細(xì)胞(PV-9000法，ZSGB-BIO公司)。具體步驟如下：

即貼壁細(xì)胞4 ℃冰丙酮固定 5 min；3% H2O2阻斷液 10 min；加兔抗人波形蛋白單克隆抗體一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；滴加試劑 1(Polymer Helper)，37 ℃恒溫箱孵育 20 min；滴加試劑 2 (poly peroxidase-anti rabbit IgG)，37 ℃恒溫箱孵育2 h；DAB顯色、蘇木精液復(fù)染，脫水、透明和中性樹(shù)膠封固。顯微鏡下觀察并拍照，細(xì)胞呈棕黃色顯色作為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞處理及分組:成纖維細(xì)胞分為3組，即：對(duì)照組、TGF-β1組和TGF-β1+他莫昔芬組。依此將成纖維細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)置于6孔板中，加入新鮮DMEM培養(yǎng)基12 h。對(duì)照組細(xì)胞不予以藥物干預(yù)，TGF-β1組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加入10 ng/μL的TGF-β1處理48 h，TGF-β1+他莫昔芬組先用他莫昔芬(10 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞24 h，后使用TGF-β1(10 ng/μL)處理48 h。

1.2.4 細(xì)胞遷移:通過(guò)傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，具體步驟如下：在6孔板中接種等量的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，用1 mL無(wú)菌微管尖端刮取細(xì)胞，用PBS溫和洗滌3次以清除細(xì)胞碎片，然后加入低血清的培養(yǎng)基。劃痕后立即用光學(xué)顯微鏡拍照。孵育24 h后再次拍攝。利用Image J軟件測(cè)量細(xì)胞遷移引起的刮傷面積變化，確定創(chuàng)面愈合能力。

1.2.5 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR):用Trizol reagent (Invitrogen公司)從細(xì)胞中提取總RNA，并用PrimeScript RT Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR引物序列見(jiàn)表1。采用SYBR預(yù)混劑ExTaq Ⅱ及real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測(cè)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn):經(jīng)過(guò)藥物處理的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min， 0.5% Triton X-100室溫穿透10 min，5% BSA室溫封閉1 h。α-SMA抗體孵育過(guò)夜。次日使用山羊抗小鼠的二抗AlexaFluor 594 及DAPI在室溫下進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 細(xì)胞活力檢測(cè):MTS按照說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞活性分析，將MTS/非那靜乙硫酸鹽混合試劑共10 μL加入96孔板的每個(gè)孔中，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h。使用TECAN GENIOS酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度。

1.2.8 免疫印跡:將細(xì)胞在預(yù)冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌1次，并在含有蛋白酶抑制劑(Roche公司)的裂解緩沖液中收集裂解液，通過(guò)高速離心(4 ℃，14 000 g, 10 min)收集上清。用Bradford protein assay 試劑盒測(cè)定裂解物的蛋白濃度。從每個(gè)樣品中提取等量的蛋白質(zhì)，SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在5%牛奶封閉1 h，一抗孵育4 ℃過(guò)夜。次日用熒光標(biāo)記二抗室溫下孵育1 h?？贵w結(jié)合用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行可視化。使用Image J軟件計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人成纖維細(xì)胞鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示(圖1)，倒置相差顯微鏡下細(xì)胞 Vimentin 染色呈陽(yáng)性符合人成纖維細(xì)胞特性。

A.×40；B.×100圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定人成纖維細(xì)胞Fig 1 Immunocytochemical identification of human- fibroblasts

2.2 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞增殖

MTS結(jié)果顯示(圖2)，與對(duì)照組相比，TGF-β1可以誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖。與TGF-β1組相比，10 μmol/L的他莫昔芬處理后，成纖維細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。

△P<0.05 compared with the control group,TGF-β1 induced proliferation of skin fibroblasts;*P<0.05 compared with TGF-β1 group, the proliferation ability of fibroblasts was significantly reduced after tamoxifen treatment圖2 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在490 nm處的吸光度值Fig 2 Absorbance value of cells at 490 nm detected

2.3 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞遷移

傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1組皮膚成纖維細(xì)胞傷口愈合能力增強(qiáng)(P<0.05)；與TGF-β1組相比，他莫昔芬處理組傷口愈合能力被抑制，細(xì)胞遷移能力降低(P<0.05)(圖3)。

△P<0.05 compared with the control group, the wound healing ability of skin fibroblasts in TGF-β1 group was enhanced; *P<0.05 compared with TGF-β1 group, wound healing ability was inhibited and cell migration ability was decreased in the tamoxifen treatment group

2.4 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化

免疫熒光染色結(jié)果表明，TGF-β1顯著促進(jìn)α-SMA的表達(dá)，而他莫昔芬處理后細(xì)胞α-SMA表達(dá)降低。說(shuō)明他莫昔芬抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化(圖4)。

圖4 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞分化Fig 4 Cell differentiation was detected by immunofluorescence assay (×400)

2.5 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人皮膚纖維化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

與TGF-β1組相比，他莫昔芬能夠顯著抑制COL1、COL3、肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的mRNA水平(P<0.05)(圖5)。

*P<0.01 compared with the control group, TGF-β1 promoted the mRNA expression levels of COL1, COL3 and α-SMA; #P<0.05 compared with the TGF-β1 group, tamoxifen could significantly inhibit the mRNA expression levels of COL1, COL3 and α-SMA

2.6 他莫昔芬抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人皮膚纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)皮膚纖維化相關(guān)蛋白fibronectin和α-SMA的表達(dá)。與 RT-qPCR結(jié)果一致，TGF-β1能夠促進(jìn)fibronectin和α-SMA蛋白水平，而他莫昔芬能夠顯著抑制fibronectin和α-SMA蛋白水平(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with the control group, TGF-β1 could promote the levels of fibronectin and α-SMA protein; #P<0.05 compared with TGF-β1 group, tamoxifen could inhibit fibronectin and α-SMA protein levels

2.7 他莫昔芬抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路參與瘢痕形成

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1組中的TGF-β1、Smad和p-Smad蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.05)；與TGF-β1組相比，他莫昔芬處理組TGF-β1、Smad和p-Smad蛋白表達(dá)均顯著抑制(P<0.05)(圖7)。

*P<0.05 compared with the control group, the protein expressions of TGF-β1, Smad and P-Smad were increased in TGF-β1 group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group, the protein expressions of TGF-β1, Smad and p-smad were significantly inhibited in tamoxifen treatment group

3 討論

HS不僅影響皮膚美觀，而且妨礙正常肌肉功能，給人們?cè)斐稍S多心理和生理困擾[8]。巨大經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)提示需對(duì)HS形成機(jī)制和預(yù)防措施進(jìn)行研究。

激活的肌成纖維細(xì)胞是組織纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞[9]。活化成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和蛋白酶，導(dǎo)致炎癥條件下正常組織結(jié)構(gòu)的異常破壞，是瘢痕形成的主要病理學(xué)過(guò)程。傷口過(guò)度修復(fù)過(guò)程中釋放的TGF-β是成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的主要驅(qū)動(dòng)因素[10]。因此，識(shí)別并阻止TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞形成的因子可能為治療異常組織重塑提供有新思路。

他莫昔芬是一種合成的選擇性雌激素受體(ER)調(diào)節(jié)劑。最近，由于性激素在瘢痕形成過(guò)程中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，關(guān)于性激素在皮膚瘢痕發(fā)展過(guò)程中作用的數(shù)據(jù)在不同的研究組織中是復(fù)雜和矛盾的。他莫昔芬因其抗纖維化特性引起了人們的關(guān)注[11-12]，其機(jī)制尚不清楚。在本研究中，發(fā)現(xiàn)了他莫昔芬抑制TGF-β在人皮膚成纖維細(xì)胞中的潛在作用。他莫昔芬能有效抑制TGF-β1驅(qū)動(dòng)的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá)和成纖維細(xì)胞的增殖活化以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，可能對(duì)病理?xiàng)l件下激活的肌成纖維細(xì)胞具有治療潛力。

許多研究表明他莫昔芬具有抗纖維化特性。他莫昔芬已被證明能抑制腎纖維化[11,13]，腹膜纖維化[14]、肥厚性瘢痕[15]以及硅誘導(dǎo)肺纖維化[12]。在這些研究中，他莫昔芬的作用與受影響組織中TGF-β和其他生長(zhǎng)因子的表達(dá)下調(diào)有關(guān)[12,16]。雖然在實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有探索其他自分泌生長(zhǎng)因子表達(dá)的變化，但實(shí)驗(yàn)證明，他莫昔芬可以阻止TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析磷酸化的Smad2和Smad3表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)他莫昔芬能夠抑制Smad通路的激活。提示除抑制TGF-β1的表達(dá)外，他莫昔芬還可以阻斷TGF-β/Smad信號(hào)通路的活化，從而發(fā)揮抑制成纖維細(xì)胞過(guò)度活化的作用。

此外，肌成纖維細(xì)胞除了是組織纖維化的效應(yīng)細(xì)胞外，還與癌發(fā)生高度相關(guān)[17]。在這種情況下，它們被稱為癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞，并已被證明釋放可溶性介質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移營(yíng)造有利的微環(huán)境[18-19]。肌成纖維細(xì)胞的這一功能是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。他莫昔芬在臨床上用于治療乳腺癌患者[20]。如果他莫昔芬抑制與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞的激活，那么還可能具有抗癌益處。因此，莫西芬對(duì)其他腫瘤中激活成纖維細(xì)胞的潛在作用也值得探索。