張 顏 周德勇 王 路 高艷艷 林天鳳 劉 斌 姜艷艷

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，102488)

中藥對(duì)照提取物是中藥的“標(biāo)準(zhǔn)”提取物，是一類非單體成分對(duì)照品，一般通過特殊的提取分離工藝制備而成[1]。具有化學(xué)成分組成相對(duì)明確、指標(biāo)成分含量確切、適合多成分分析等特點(diǎn)，可用于薄層色譜或其他色譜鑒別，以及高效液相色譜法的含量測(cè)定[2]。對(duì)照提取物首次在2005年版《中華人民共和國藥典》中作為中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出現(xiàn)，并且隨著藥典修訂工作的不斷推進(jìn)，更多的對(duì)照提取物被收載和應(yīng)用[3]。2020年版《中華人民共和國藥典·四部》中就收載了人參莖葉總皂苷、三七總皂苷、廣陳皮對(duì)照提取物、銀杏葉提取物等23種對(duì)照提取物[4]。美國藥典(US Pharmacopoeia，USP)和歐洲藥典(European Pharmacopoeia，EP)對(duì)于對(duì)照提取物也有相應(yīng)的收載和應(yīng)用[5-7]。雖然中藥對(duì)照提取物在對(duì)照物質(zhì)總數(shù)量中的比例并不大，但是中藥對(duì)照提取物具有一些特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，能夠彌補(bǔ)中藥化學(xué)對(duì)照品和對(duì)照藥材在生產(chǎn)、供應(yīng)、使用等環(huán)節(jié)中存在的不足，對(duì)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和檢測(cè)效率的提高具有促進(jìn)作用[8]。

中藥復(fù)方是中醫(yī)用藥的主要形式，在中醫(yī)藥醫(yī)療活動(dòng)中發(fā)揮著不可替代的作用。中藥復(fù)方的功效發(fā)揮是其所含有效成分綜合作用的結(jié)果，是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用的體現(xiàn)[9]。因此，中藥復(fù)方的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)研究應(yīng)依據(jù)其特點(diǎn)開展。近年來，中藥復(fù)方質(zhì)量控制方法研究成為中藥現(xiàn)代化的重要研究領(lǐng)域之一[10]。為了保障中藥復(fù)方制劑的安全性與有效性，中醫(yī)學(xué)者開展了大量的系統(tǒng)研究，旨在建立符合中藥復(fù)方特點(diǎn)的系統(tǒng)、科學(xué)、全面的質(zhì)量控制方法。

現(xiàn)階段，中藥質(zhì)量控制基本都是借鑒化學(xué)藥品的控制模式，采用單一對(duì)照品評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，由于中藥成分的多樣性及復(fù)雜性，這種方法往往具有一定的局限性。而對(duì)照提取物可以同時(shí)對(duì)多個(gè)組分進(jìn)行含量測(cè)定，體現(xiàn)了中藥整體質(zhì)量控制的思想。將中藥對(duì)照提取物應(yīng)用于中藥及中藥復(fù)方質(zhì)量控制具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：相對(duì)固定的化學(xué)組成，安全、穩(wěn)定的理化特性；專屬性較強(qiáng)；可以減少化學(xué)對(duì)照品的使用，降低檢驗(yàn)成本；配制操作簡(jiǎn)單，溶解于有機(jī)溶劑后可直接使用，使藥品檢測(cè)更加簡(jiǎn)便、快捷[11]。因此，開展中藥對(duì)照提取物研究并探索將其用于中藥及中藥復(fù)方的質(zhì)量控制具有較大的應(yīng)用價(jià)值，能夠解決目前中藥質(zhì)量控制研究中的諸多問題。

決明子為豆科植物鈍葉決明CassiaobtusifoliaL.或決明(小決明)CassiatoraL.的干燥成熟種子。具有清熱明目、潤腸通便的功效。臨床常用于目赤澀痛、羞明多淚、頭痛眩暈、目暗不明、大便秘結(jié)[12]。決明子作為脂康顆粒中的重要藥味，由決明子、枸杞子、桑椹、紅花、山楂四味中藥組成，具有滋陰清肝、活血通絡(luò)的作用，臨床上可用于治療肝腎陰虛挾瘀所引起的高脂血癥等疾病[12]。課題組前期系統(tǒng)開展了決明子萘并吡喃酮類對(duì)照提取物制備及定殖研究，并將其應(yīng)用于決明子藥材的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)[13-17]。文獻(xiàn)及前期研究結(jié)果顯示，將中藥對(duì)照提取物用于中藥及中藥復(fù)方的質(zhì)量控制，穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確度高、可行性強(qiáng)[18-21]。在此基礎(chǔ)上，以脂康顆粒為例，分別采用化學(xué)對(duì)照品法和對(duì)照提取物法，建立含有決明子的中藥制劑脂康顆粒的含量測(cè)定方法，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。進(jìn)一步探討決明子萘并吡喃酮類對(duì)照提取物用于中藥復(fù)方質(zhì)量控制中的可行性和適用性，為全面評(píng)價(jià)決明子藥材及復(fù)方質(zhì)量提供研究基礎(chǔ)，為中藥對(duì)照提取物在中藥復(fù)方質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)工作中的適用性和可行性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分析樣品 枸杞子、桑葚、山楂、紅花4種藥材和各批次脂康顆粒(批號(hào)：170310)樣品均由同仁堂(望京店)提供。

1.1.2 試劑 決明子苷B2對(duì)照品、決明子苷C2對(duì)照品、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷對(duì)照品、決明子苷C對(duì)照品由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院自制，經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定及色譜檢測(cè)計(jì)算，純度均大于98%；乙腈、甲醇為色譜純(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，美國，批號(hào)：155805)；純凈水；甲醇為分析純(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2020121025)；乙醇為分析純(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20190806)；乙酸為分析純(汕頭市西隴化工廠有限公司，批號(hào)：080312)。

1.1.3 儀器 循環(huán)水式多用真空泵(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：SHB-Ⅲ)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DE)；高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司，美國，型號(hào)：1525型)；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(安捷倫科技(中國)有限公司，美國，型號(hào)：ZORBAX SB-C18)；十萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司，型號(hào)：Sartorious BT 25S)。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品用于脂康顆粒含量測(cè)定

1.2.1.1 高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇乙腈(5∶4)混合溶液(A)-1%乙酸水(B)等度洗脫(0～30 min，19%A)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；柱溫：35 ℃。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取決明子苷B2對(duì)照品2.75 mg、決明子苷C2對(duì)照品2.35 mg、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷對(duì)照品4.73 mg、決明子苷C對(duì)照品7.96 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液A。精密吸取3 mL混合對(duì)照品溶液A，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液B；精密吸取3 mL混合對(duì)照品溶液B，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液C；重復(fù)以上步驟直至制得混合對(duì)照品溶液E。

1.2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱定脂康顆粒1 g，加入50 mL水溶解，上樣于內(nèi)徑為2 cm，高度為25 cm的大孔吸附樹脂柱，柱體積為80 mL，先用320 mL 20%乙醇洗脫除雜后，再用480 mL 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干燥，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加30%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.1.4 陰性樣品溶液的制備 取枸杞子、桑葚、山楂、紅花4味藥材適量，按照處方3∶3∶3∶1的比例，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，濾過，濾液合并，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.05～1.10(60 ℃)的浸膏，加入麥芽糊精適量，混勻，噴霧干燥；浸膏粉中加入麥芽糊精適量和硬脂酸鎂5 g，混勻，干法制粒，即得陰性樣品。按供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。

1.2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.1.2”項(xiàng)下制得的混合對(duì)照品溶液A～F各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸。

1.2.1.6 儀器精密度試驗(yàn) 分別精密稱取同一供試品溶液6份，每次進(jìn)樣10 μL，以色譜峰峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)。

1.2.1.7 中間精密度試驗(yàn) 分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1 g，按“1.2.1.3”項(xiàng)下方法由不同的分析人員在不同的時(shí)間制備脂康顆粒樣品溶液，分別采用Waters 1525-2998-2707和Waters 1525-2489高效液相色譜儀測(cè)定峰面積。

1.2.1.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“1.2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰峰面積。

1.2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1 g，按“1.2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。

1.2.1.10 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份0.5 g，加入對(duì)照品溶液適量，按“1.2.1.3”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。

1.2.2 對(duì)照提取物用于脂康顆粒含量測(cè)定

1.2.2.1 HPCL分析 色譜條件與對(duì)照品色譜條件相同。

1.2.2.2 對(duì)照提取物溶液的制備 精密稱取已標(biāo)定含量的決明子萘并吡喃酮類對(duì)照提取物12.88 mg，置于25 mL容量瓶中，加30%甲醇超聲溶解，靜置，定容，搖勻，即得對(duì)照提取物溶液A。精密吸取3 mL對(duì)照提取物溶液A于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對(duì)照提取物溶液B；精密吸取3 mL對(duì)照提取物溶液B于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對(duì)照提取物溶液C；重復(fù)以上步驟直至制得對(duì)照提取物溶液E。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定脂康顆粒1 g，加入50 mL水溶解，上樣于內(nèi)徑為2 cm，高度為25 cm的大孔吸附樹脂，柱體積為80 mL，320 mL 20%乙醇洗脫除雜后，用480 mL 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干燥，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取枸杞子、桑葚、山楂、紅花4味藥材適量，按照處方3∶3∶3∶1的比例，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，濾過，濾液合并，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.05～1.10(60 ℃)的浸膏，加入麥芽糊精適量，混勻，噴霧干燥；浸膏粉中加入麥芽糊精適量和硬脂酸鎂5 g，混勻，干法制粒，即得陰性樣品。按“1.2.1.3”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

1.2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照提取物溶液A～F各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸。

1.2.2.6 儀器精密度試驗(yàn) 分別精密稱取同一供試品溶液6份，每次進(jìn)樣10 μL，以色譜峰峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.2.7 中間精密度試驗(yàn) 分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法由不同的分析人員在不同的時(shí)間制備脂康顆粒樣品溶液，分別采用Waters 1525-2998-2707和Waters 1525-2489高效液相色譜儀測(cè)定峰面積。

1.2.2.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“1.2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h進(jìn)樣，測(cè)定4種指標(biāo)性成分的色譜峰峰面積。

1.2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1 g，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。

1.2.2.10 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份0.5 g，加入對(duì)照提取物溶液適量，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積。

1.2.3 復(fù)方脂康顆粒含量測(cè)定 精密稱取12批脂康顆粒粉末，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別以4個(gè)對(duì)照品和已知含量的決明子對(duì)照提取物為對(duì)照，采用高效液相色譜法，測(cè)定4種成分的含量，并對(duì)不同方法所得的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照品用于脂康顆粒含量測(cè)定結(jié)果

2.1.1 HPLC分析 混合對(duì)照品、供試品和陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品、脂康顆粒樣品及陰性樣品的HPLC色譜圖

2.1.2 線性關(guān)系 決明子苷B2線性范圍為0.004 5～0.550 0 μg；決明子苷C2線性范圍為0.003 8～0.470 0 μg；紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷線性范圍為0.007 7～0.946 0 μg決明子苷C線性范圍為0.012 9～1.592 0 μg。

2.1.3 儀器精密度 RSD值分別為0.58%、0.87%、0.90%、0.79%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 中間精密度 決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷及決明子苷C的含量分別為0.08%(RSD=0.77%)，0.010%(RSD=1.20%)，0.15%(RSD=0.93%)，0.04%(RSD=1.05%)，表明該方法中間精密度良好。

2.1.5 供試品溶液穩(wěn)定性 RSD值分別為1.01%，0.72%，1.23%和0.57%。表明該溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性 RSD值均小于3%，表明重復(fù)性良好。

2.1.7 回收率 RSD值均小于3%，表明回收率良好。見表1。

表1 加樣回收率考察結(jié)果(n=6)

2.2 對(duì)照提取物用于脂康顆粒含量測(cè)定

2.2.1 HPLC分析 對(duì)照提取物、供試品及陰性樣品溶液色譜圖見圖2。

圖2 對(duì)照提取物、脂康顆粒樣品及陰性樣品的HPLC色譜圖

注：A.對(duì)照提取物；B.供試品；C.陰性樣品；1.決明子苷B2；2.決明子苷C2；3.紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷4.決明子苷C

2.2.2 線性關(guān)系 決明子苷B2線性范圍為0.004 5～0.550 0 μg；決明子苷C2線性范圍為0.003 8～0.470 0 μg；紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷線性范圍為0.007 7～0.946 0 μg決明子苷C線性范圍為0.012 9～1.592 0 μg。

2.2.3 儀器精密度 RSD值分別為0.74%、0.91%、0.85%、1.20%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 中間精密度 決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷及決明子苷C的含量分別為0.08%(RSD=0.91%)，0.01%(RSD=1.23%)，0.151%(RSD=0.95%)，0.04%(RSD=1.02%)，表明該方法中間精密度良好。

2.2.5 供試品溶液穩(wěn)定性 RSD值分別為1.10%，1.43%，0.97%和1.24%。表明該溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性 RSD值均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 回收率 RSD值均小于3%，表明回收率良好。見表2。

表2 加樣回收率考察結(jié)果(n=6)

2.3 復(fù)方脂康顆粒含量測(cè)定 決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷和決明子苷C的P值分別為0.233、0.082、0.192、0.198，P值均大于0.05，說明對(duì)照提取物可以作為脂康顆粒質(zhì)量控制中的對(duì)照物質(zhì)，代替相應(yīng)的化學(xué)對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。見表3。

表3 12批脂康顆粒含量測(cè)定(%，n=3)

3 討論

中藥是在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下用于防治疾病的藥物，其質(zhì)量直接影響中醫(yī)臨床用藥的安全性和有效性。一方面，隨著中藥市場(chǎng)的擴(kuò)大、中藥品種及產(chǎn)地多元化，一些傳統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際需要；另一方面，隨著科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，中醫(yī)藥在國際上的地位和影響力不斷增強(qiáng)，因此為了更好地實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化和國際化，中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及質(zhì)量控制也正向著多指標(biāo)成分同步分析的方向發(fā)展[18]。而中藥對(duì)照提取物正是順應(yīng)了這一發(fā)展趨勢(shì)，在中藥整體的質(zhì)量控制中體現(xiàn)出了巨大的優(yōu)越性，為實(shí)現(xiàn)多成分測(cè)定的質(zhì)量控制新模式做出了貢獻(xiàn)。

本研究中首次建立了基于決明子萘并吡喃酮類對(duì)照提取物(主成分為決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷及決明子苷C)的中藥復(fù)方脂康顆粒含量測(cè)定方法，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)法分析比較對(duì)照提取物和對(duì)照品測(cè)定結(jié)果的異同，發(fā)現(xiàn)二者的結(jié)果不存在顯著差異，表明對(duì)照提取物法與對(duì)照品法所得結(jié)果一樣準(zhǔn)確可靠，決明子對(duì)照提取物可以作為脂康顆粒質(zhì)量控制中的對(duì)照物質(zhì)，代替相應(yīng)的化學(xué)對(duì)照品實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥復(fù)方的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。進(jìn)一步明確了對(duì)照提取物在決明子復(fù)方質(zhì)量控制中的適用性和可行性，為中藥對(duì)照提取物應(yīng)用于中藥復(fù)方質(zhì)量控制提供了參考。