李楚忠 鄭麗瓊 龔盛昭

廣州環(huán)亞化妝品科技股份有限公司,廣東廣州，510663

我國(guó)女性歷來(lái)崇尚“膚如雪、凝如脂”，民間更有“一白遮百丑”的說(shuō)法，東方女性素來(lái)有非常重的美白情節(jié)，誰(shuí)都想擁有水嫩、白皙和通透的迷人肌膚。保濕是一切護(hù)膚步驟的基礎(chǔ)，美白保濕類化妝品占據(jù)了整個(gè)化妝品市場(chǎng)份額的一半以上，具有皮膚美白、保濕等功能的化妝品是時(shí)下亞洲最暢銷(xiāo)的化妝品之一。

近年來(lái)，市場(chǎng)上出現(xiàn)了越來(lái)越多的皮膚美白劑，如曲酸、熊果苷和壬二酸等，它們作為酪氨酸酶抑制劑而廣泛用于美白化妝品中。但這些美白劑大都是作用于單一路徑，美白效果往往不明顯，另外，這些美白劑還具有一定的安全隱患，如熊果苷及曲酸可能會(huì)導(dǎo)致接觸性皮炎，壬二酸會(huì)刺激皮膚而產(chǎn)生短暫性紅斑。所以，開(kāi)發(fā)具有良好安全性、穩(wěn)定性，多通路美白機(jī)制的美白活性成分，已成為當(dāng)前化妝品行業(yè)的主要研究方向之一，具有非常好的發(fā)展前景。

本文研制了一種高效的美白祛斑組合物，通過(guò)幾種不同作用機(jī)制的美白活性成分進(jìn)行復(fù)配，研制出效果較好的美白祛斑組合物，并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及人體實(shí)驗(yàn)評(píng)估其美白、祛斑功效。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料與儀器

1.1.1 主要原料

B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞株、人角質(zhì)細(xì)胞HaCaT細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DPPH、鄰苯三酚、酪氨酸酶，L-酪氨酸，DMSO，購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基（FBS購(gòu)自Gibco，Lot：2276321）；美白祛斑組合物，由廣州環(huán)亞化妝品科技股份有限公司研制，該組合物的詳細(xì)組分見(jiàn)表1。

表1 美白組合物各成分組成及含量

1.1.2 主要儀器

分析天平，A N D F X 3 0 0 0 i；恒溫水浴鍋HWS-24，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTEK公司）；生化孵育箱、離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；生物安全柜（美國(guó)Thermo Scientific公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)MEMMERT公司）；皮膚生理無(wú)創(chuàng)檢測(cè)設(shè)備均為來(lái)自德國(guó)CK公司，日本美能達(dá)公司分光光度儀（Spectrophotometer CM-2500d）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 人角質(zhì)細(xì)胞 HaCaT細(xì)胞活力測(cè)試

將HaCaT細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，制備濃度為（0.8～1.0）×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)18～24 h；然后棄去孔中原培養(yǎng)液，每孔依次加入100 μl維持培養(yǎng)基（陰性對(duì)照），以及含有0.5%、1%、5%、10%、15%、20%美白組合物的維持培養(yǎng)基，返回培養(yǎng)箱孵育（48±1）h；取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μl MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育3～4 h，去除孔中液體，每孔加入100 μl DMSO，置于振蕩器振蕩10～15 min后，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。選擇細(xì)胞活力大于80%作為受試物的安全濃度。細(xì)胞存活率計(jì)算公式見(jiàn)式1。

2.2 體外細(xì)胞美白實(shí)驗(yàn)測(cè)試

2.2.1 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性測(cè)試

細(xì)胞培養(yǎng)方法同2.1。樣品作用濃度分別為2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%；藥物作用3 d后，舍棄上清液，用pH 7.0的PBS溶液沖洗兩遍，每孔加90 μl含1% Triton X-100的PBS。冰水浴中超聲破碎震蕩5 min溶解細(xì)胞，經(jīng)37 ℃預(yù)溫后，每孔加入1% L-DOPA 10 μl，37 ℃下培育60 min，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔樣品的吸光度。酪氨酸酶合成抑制率計(jì)算公式見(jiàn)式2。

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)黑色素含量測(cè)定

將B16黑色素細(xì)胞以10×104個(gè)/ml的密度接種于6板孔。每孔3 ml，培育24 h后，舍棄上清液，添加待測(cè)樣品，濃度分別為5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%；樣品作用3 d后，舍棄上清液，用PBS溶液洗滌，每孔加入胰酶0.5 ml消化細(xì)胞，加入2 ml培養(yǎng)液終止消化，分別計(jì)數(shù)每組細(xì)胞。將細(xì)胞懸液離心舍棄上清液，得到沉淀物，再加入含有10%的DMSO的1 mol/L NAOH溶液，震蕩5 min。在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔樣品的吸光度。黑色素的合成抑制率計(jì)算公式見(jiàn)式3。

2.2.3 自由基清除實(shí)驗(yàn)

（1）超氧陰離子自由基清除作用的測(cè)定：取0.05 mol/L pH=8.2的Tris-HCl 緩沖液4.5 ml，于25 ℃水浴鍋中預(yù)熱20 min。再加入1 ml試樣和0.4 ml 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后，于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mol/L的HCl 1.0 ml終止反應(yīng)。以Tris-HCl緩沖液作為參比，在299 nm處測(cè)吸光度值?？瞻讓?duì)照用1 ml試樣的溶劑來(lái)替代樣品。待測(cè)液對(duì)超氧陰離子自由基清除率的計(jì)算公式見(jiàn)式4。

式中A1為空白對(duì)照的吸光度值；A2為樣品的吸光度值。

（2）對(duì)羥自由基的清除能力測(cè)定：在25 ml比色管中依次加入2 mmol/L FeSO43 ml，1 mmol/L H2O23 ml，搖勻，接著加入6 mmol/L水楊酸3 ml，搖勻，于37 ℃水浴加熱15 min后取出，測(cè)其吸光度；分別加入一定濃度的待測(cè)液，搖勻，繼續(xù)水浴加熱15 min，取出測(cè)其吸光度。待測(cè)液對(duì)羧自由基（·OH）的清除率計(jì)算公式見(jiàn)式5。

式中A1為未加藥品前反應(yīng)體系的吸光度值；A2為樣品清除·OH后體系的吸光度值；A3為空白對(duì)照清除·OH后體系的吸光度值。

2.3 人體美白測(cè)試實(shí)驗(yàn)

（1）測(cè)試方法及志愿者招募：根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版化妝品祛斑美白功效測(cè)試方法的具體要求進(jìn)行檢驗(yàn)。招募受試者共33人，其中男性6人，女性27人，年齡22～59歲，平均年齡（40.5±5.2）歲，符合受試者志愿入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)。

（2）紫外線黑化模型建立：首先測(cè)試入組的合格受試者背部的最小紅斑量（minimal erythema dose，MED），然后在受試部位選定3個(gè)面積不小于6 cm2的試驗(yàn)區(qū)，分別為試驗(yàn)產(chǎn)品區(qū)、陰性對(duì)照區(qū)和陽(yáng)性對(duì)照區(qū)，每個(gè)試驗(yàn)區(qū)之間的間隔不小于1.0 cm，并在每個(gè)試驗(yàn)區(qū)內(nèi)選定面積不小于0.5 cm2的黑化測(cè)試區(qū)，用紫外線日光模擬儀按0.75倍MED劑量每天照射1次，連續(xù)照射4 d。

（3）膚色評(píng)測(cè)：照射結(jié)束后第5天，對(duì)各黑化測(cè)試區(qū)進(jìn)行產(chǎn)品使用前的膚色視覺(jué)評(píng)估、皮膚色度儀、皮膚黑素檢測(cè)儀的測(cè)試。以皮膚色度儀測(cè)試的L＊a＊b＊顏色空間數(shù)值計(jì)算ITA°值，計(jì)算公式見(jiàn)式6。

在涂抹試驗(yàn)物后每周對(duì)各黑化測(cè)試區(qū)皮膚顏色進(jìn)行視覺(jué)評(píng)估和儀器檢測(cè)，并記錄。

（4）試驗(yàn)物涂抹：根據(jù)隨機(jī)表在試驗(yàn)區(qū)按照（2.00±0.05）mg/cm2的用量涂抹試驗(yàn)物（陰性對(duì)照區(qū)不涂抹任何產(chǎn)品）。產(chǎn)品使用頻率為2次/d（2次涂抹間隔時(shí)間不小于4 h），連續(xù)涂抹試驗(yàn)物4周。

試驗(yàn)產(chǎn)品：含2%美白祛斑組合物的美白祛斑精華露。

陰性對(duì)照：黑化區(qū)空白對(duì)照。

陽(yáng)性對(duì)照：7%維生素C制品，按規(guī)范方法附錄Ⅰ配方制備（4 ℃冷藏、鋁管避光保存）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 人角質(zhì)細(xì)胞HaCaT細(xì)胞活力測(cè)試

測(cè)試美白祛斑組合物樣品濃度分別為20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%對(duì)B16細(xì)胞增殖率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同質(zhì)量濃度下樣品對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，組合物作用濃度在20%及以內(nèi)，人角質(zhì)細(xì)胞HaCaT細(xì)胞活力均大于80%，表明在20%作用濃度內(nèi)均為安全作用濃度。

3.2 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性抑制測(cè)試

通過(guò)體外酪氨酸酶實(shí)驗(yàn)測(cè)試美白祛斑組合物對(duì)酪氨酸酶的抑制效果，選擇組合物測(cè)試濃度分別為5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同質(zhì)量濃度下樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制率

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本文制備的美白祛斑組合物在作用濃度為0.05%的濃度下，酪氨酸酶抑制率達(dá)到了60.47%，對(duì)酪氨酸酶的抑制效果隨著美白組合物濃度的增加而提高，表現(xiàn)出良好的酪氨酸酶抑制作用。

3.3 細(xì)胞內(nèi)黑色素合成的抑制率結(jié)果

通過(guò)體外測(cè)試美白祛斑組合物對(duì)B16黑色素細(xì)胞合成黑色素的抑制效果，選擇測(cè)試濃度分別為5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同質(zhì)量濃度下樣品對(duì)黑色素生成的抑制率

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本文制備的美白祛斑組合物在作用濃度為0.05%的濃度下，對(duì)黑色素生成的抑制率達(dá)到了55.49%，黑色素生成的抑制效果隨著美白組合物濃度的增加而提高，表現(xiàn)出良好的抑制黑色素生成作用。

3.4 自由基清除實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

通過(guò)體外測(cè)試美白祛斑組合物對(duì)超氧陰離子自由基及羥自由基的清除效果，選擇測(cè)試濃度分別為5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同質(zhì)量濃度下樣品對(duì)自由基的清除效果

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本文制備的一種美白祛斑組合物對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基具有一定的清除作用。在作用濃度達(dá)到2%時(shí)，清除兩種自由基效果分別達(dá)到了75.35%和72.05%，其清除自由基的效果隨著美白組合作用濃度的增加而增強(qiáng)。

3.5 人體美白測(cè)試結(jié)果分析

表7 受試物使用前后皮膚ITA°差值（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

在做完美白組合物的體外酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)、黑色素抑制實(shí)驗(yàn)以及自由基清除實(shí)驗(yàn)后，選擇使用濃度為2%的美白祛斑組合物添加到精華露中，制備得到含有2%美白祛斑組合物的美白祛斑精華露，并通過(guò)人體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證樣品的美白效果。結(jié)果見(jiàn)表6～表8。

表6 受試物使用前后視覺(jué)膚色評(píng)估差值[中位數(shù)（最小值，最大值）]

表8 受試物使用前后皮膚MI差值（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

根據(jù)表6～表8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品（含2%美白祛斑組合物的美白祛斑精華露）紫外線誘導(dǎo)人體皮膚黑化模型祛斑美白功效測(cè)試的結(jié)果為：實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品涂抹3周、4周后，膚色視覺(jué)評(píng)分在涂抹前后差值與陰性對(duì)照相比有顯著改善（P＜0.05）；涂抹3周、4周后，ITA°在涂抹前后差值與陰性對(duì)照相比有顯著改善（P＜0.05）；涂抹1周、2周后，MI在涂抹前后差值與陰性對(duì)照相比有顯著改善（P＜0.05）；整體判斷實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品與陰性對(duì)照相比皮膚黑化顯著改善（P＜0.05），表明2%美白祛斑組合物的美白祛斑精華露具有祛斑美白功效。

4 結(jié)論

本文研制了一種具有高效美白效果的美白祛斑組合物并通過(guò)體外和人體實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了組合物的美白祛斑效果。

（1）采用人角質(zhì)細(xì)胞HaCaT細(xì)胞活力測(cè)試驗(yàn)證了組合物的安全性能，在作用濃度在20%及以內(nèi)，人角質(zhì)細(xì)胞HaCaT細(xì)胞活力均大于80%，表明在20%作用濃度內(nèi)均為安全使用濃度。

（2）采用體外酪氨酸酶及黑色素抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)試，結(jié)果得出，美白祛斑組合物對(duì)酪氨酸酶及黑色素合成抑制率最高可達(dá)到99.15%和91.37%。

（3）通過(guò)體外自由基清除實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證美白祛斑組合物具有一定的自由基清除功效，對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基的清除效果，最高可達(dá)到88.23%及86.65%

（4）采用2%美白祛斑組合物，制備得到美白祛斑精華露，并按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版化妝品祛斑美白功效測(cè)試方法，通過(guò)人體實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果可得出，2%美白祛斑組合物的美白精華露具有良好的美白祛斑效果，受試者在使用產(chǎn)品4周后，在膚色視覺(jué)評(píng)分、ITA°、黑色素MI值等多項(xiàng)指標(biāo)上具有顯著性的改善（P＜0.05），樣品具有良好的美白祛斑功效。