柳成航，徐增萊，李冬玲，鄭玉紅，汪 瓊,①，儲(chǔ)力群

〔1.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇 南京 210014；2.常州云卿生物科技有限公司，江蘇 常州 213004〕

隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，植物染料因無毒無害、環(huán)保綠色的優(yōu)點(diǎn)再次回到人們的視野中，尤其是植物靛藍(lán)的研究和應(yīng)用逐漸豐富起來。靛藍(lán)是一種歷史悠久的藍(lán)色染料，與常用中藥青黛為同一植物來源，收載于《中國藥典》[1]。在中國貴州和云南等省的山村地區(qū)，產(chǎn)靛植物的種植以及制靛染色行業(yè)已成為當(dāng)?shù)氐奶厣a(chǎn)業(yè)[2]。然而，當(dāng)前中國植物靛藍(lán)行業(yè)仍處于傳統(tǒng)的粗放生產(chǎn)經(jīng)營狀態(tài)，往往以農(nóng)戶為經(jīng)營單位，種植規(guī)模小，制靛技術(shù)水平較低，產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊。靛藍(lán)質(zhì)量全憑主觀經(jīng)驗(yàn)判斷，其真實(shí)含量無法有效檢測，產(chǎn)品質(zhì)量不能與價(jià)格相關(guān)聯(lián)，嚴(yán)重制約行業(yè)的健康發(fā)展。

近年來，靛藍(lán)含量的檢測方法包括高效液相色譜(HPLC)法[3,4]、液質(zhì)聯(lián)用法[5]和定量核磁共振氫譜法[6]等，其中廣泛使用的HPLC法具有測量準(zhǔn)確、分離度好、消耗樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，但也存在著測試成本高昂、溶劑消耗量大、測試時(shí)間偏長、設(shè)備價(jià)格較高等問題。由于產(chǎn)靛植物種植地區(qū)往往經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)，直接面向種植與靛藍(lán)初加工的企業(yè)均為涉農(nóng)小微企業(yè)，經(jīng)營規(guī)模較小，技術(shù)水平較低，因此，開發(fā)一種廉價(jià)快速、高效準(zhǔn)確的檢測植物靛藍(lán)樣品中靛藍(lán)含量的方法很有必要。

本研究使用分光光度法對(duì)收集的32個(gè)靛藍(lán)樣品進(jìn)行了靛藍(lán)含量測定，將該方法與HPLC法和高錳酸鉀滴定法進(jìn)行對(duì)比，并對(duì)32個(gè)樣品中的靛藍(lán)含量及其與產(chǎn)靛植物的種類和制備工藝等因子的關(guān)系進(jìn)行了分析。以期提供一種操作簡便、成本低廉、結(jié)果準(zhǔn)確的靛藍(lán)含量測定和評(píng)價(jià)方法，進(jìn)一步提升山村地區(qū)植物靛藍(lán)行業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量，推動(dòng)行業(yè)良性健康發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

于2018年至2021年收集植物靛藍(lán)樣品，樣品的詳細(xì)信息見表1。樣品為膏狀半固體，冷凍干燥后粉碎過40目篩，置于避光陰涼處保存、備用。

主要儀器：UV-8000紫外-可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)和Agilent1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。主要試劑：靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)、甲醇(色譜純，美國Tedia公司)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF，分析純，廣東光華科技股份有限公司)、2,6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚(BHT，分析純，國藥集團(tuán))。

1.2 方法

1.2.1 分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取1.1 mg靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶。用含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%BHT的DMF溶液溶解并定容，得到22.00 mg·L-1的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品母液。將配制好的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品母液用含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%BHT的DMF溶液稀釋，得到1.38～14.67 mg·L-1的系列靛藍(lán)溶液。以含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%BHT的DMF溶液作為空白對(duì)照，于波長610 nm處測定不同濃度的靛藍(lán)溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(y)、靛藍(lán)濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=0.077 54x+0.013 08(r2=0.999 6)，在1.38～14.67 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2 樣品溶液配制及檢測分析 稱取靛藍(lán)樣品約5 mg，置于25 mL容量瓶。加入15 mL含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%BHT的DMF溶液，室溫下超聲(300 W，35 kHz)5 min促進(jìn)溶解，冷卻后用含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%BHT的DMF溶液定容。重復(fù)取樣，同一樣品配置3個(gè)樣品溶液，按上述方法配制樣品溶液。分析前用尼龍微孔濾膜(孔徑0.45 μm)過濾。以含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%BHT的DMF溶液為空白對(duì)照，于波長610 nm處測定樣品溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液濃度并計(jì)算樣品中的靛藍(lán)含量。

1.2.3 HPLC法和高錳酸鉀滴定法測定靛藍(lán)含量 參考董娟娥等[7]報(bào)道的色譜條件和分析方法對(duì)M1、M2、M3、M4、M12、M14、M16、M25和M27 9個(gè)植物靛藍(lán)樣品中的靛藍(lán)含量進(jìn)行測定。參考化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HG/T 2750—2012《靛藍(lán)》中描述的高錳酸鉀滴定法，對(duì)植物靛藍(lán)樣品M14的靛藍(lán)含量進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用EXCEL 2019軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。

2 結(jié)果和分析

2.1 樣品中靛藍(lán)含量的比較

分光光度法的測定結(jié)果(表1)表明：32個(gè)樣品中的靛藍(lán)含量為0.34%～8.69%，均值為3.95%。靛藍(lán)含量最高的樣品為貴州三都的M25，含量最低的樣品為四川涼山的M1，前者為后者的25.6倍。濕法工藝下，8個(gè)來源于蓼藍(lán)〔Persicariatinctoria(Aiton)Spach〕的樣品M3至M10中靛藍(lán)含量為1.10%～7.99%，均值為4.05%；17個(gè)來源于板藍(lán)〔Strobilanthescusia(Nees)Kuntze〕的樣品M16至M32中靛藍(lán)含量為1.69%～8.69%，均值為4.16%；2個(gè)來源于菘藍(lán)(IsatistinctoriaLinn.)的樣品M11和M12中靛藍(lán)含量分別為1.93%和4.95%，均值為3.44%；2個(gè)來源于野青樹(IndigoferasuffruticosaMill.)的樣品M14和M15中靛藍(lán)含量分別為3.43%和7.31%，均值為5.37%；1個(gè)來源于木藍(lán)(IndigoferatinctoriaLinn.)的樣品M13中靛藍(lán)含量為4.65%。

表1 采用分光光度法測定不同來源的植物靛藍(lán)樣品中的靛藍(lán)含量(n=3)1)

2.2 與HPLC法和高錳酸鉀滴定法的比較

HPLC法測定結(jié)果顯示：四川涼山的樣品M1，日本德島的樣品M2，江蘇南通的樣品M3、M4和M12，臺(tái)灣南投的樣品M14和M16，貴州三都的樣品M25和M27中靛藍(lán)含量分別為0.26%、0.53%、3.54%、2.61%、4.77%、2.97%、2.76%、8.33%和7.44%。HPLC法和分光光度法測得的靛藍(lán)含量接近，分光光度法的測量結(jié)果比高效液相色譜法高0.03%～0.52%。高錳酸鉀滴定法測定結(jié)果顯示：樣品M14中靛藍(lán)含量為2.81%，測定的結(jié)果與HPLC法接近。

3 討論和結(jié)論

溶液中和織物上的靛藍(lán)會(huì)被氧氣緩慢氧化，生成靛紅、鄰氨基苯甲酸和色胺酮等產(chǎn)物[8]，導(dǎo)致靛藍(lán)溶液或織物褪色。為了抑制靛藍(lán)氧化，本研究在溶劑中加抗氧化劑BHT，少量BHT能有效抑制靛藍(lán)氧化，增加靛藍(lán)溶液穩(wěn)定性[9]。

本文中，分光光度法測得的靛藍(lán)含量比HPLC法的高0.03%～0.52%。這可能是由于分光光度法沒有選擇性，樣品中的少量伴生成分靛玉紅及其他雜質(zhì)對(duì)波長610 nm處的吸光度有一定貢獻(xiàn)，造成分光光度法的測量結(jié)果偏高。但分光光度法操作簡單，儀器普及。高錳酸鉀滴定法的測定結(jié)果盡管與HPLC法接近，但其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差較大(SD=0.25%，RSD=8.88%，n=3)。這是由于天然靛藍(lán)樣品純度不高，成分復(fù)雜[10]，其中存在的靛玉紅等色素成分影響高錳酸鉀滴定終點(diǎn)的顏色變化，導(dǎo)致滴定終點(diǎn)突躍不明顯，影響終點(diǎn)的判斷?？傮w而言，高錳酸鉀滴定法僅適用于純度較高的合成靛藍(lán)樣品的含量測定。

植物靛藍(lán)的制備工藝分為干法和濕法，干法是將收割后的產(chǎn)靛植物進(jìn)行堆積發(fā)酵；濕法是將產(chǎn)靛植物體浸泡于水中任其發(fā)酵，發(fā)酵后加入石灰水并鼓入空氣進(jìn)行“打靛”[11]。本研究中采用干法制備的樣品M1和M2顏色灰暗，靛藍(lán)含量較低(低于1.0%)。而同樣源自蓼藍(lán)，采用濕法工藝得到的樣品M3至M10的靛藍(lán)含量均高于1.0%，說明制備工藝對(duì)植物靛藍(lán)樣品中的靛藍(lán)含量有較大影響。此外，沉淀劑石灰的量也會(huì)影響靛藍(lán)含量。本研究收集的樣品M4、M3和M7在制靛時(shí)加入了相當(dāng)于蓼藍(lán)質(zhì)量2.5%、2.0%和0.8%的石灰，發(fā)現(xiàn)加入石灰的量越多，靛藍(lán)樣品中的靛藍(lán)含量越低。

植物靛藍(lán)樣品中靛藍(lán)含量與來源植物種類有關(guān)。濕法工藝下，來源于蓼藍(lán)、板藍(lán)、菘藍(lán)、野青樹和木藍(lán)的樣品中靛藍(lán)含量的均值分別為4.05%、4.16%、3.44%、5.37%和4.65%。不同植物靛藍(lán)樣品中靛藍(lán)含量從高至低依次為野青樹、木藍(lán)、馬藍(lán)、蓼藍(lán)、菘藍(lán)。

綜上所述，分光光度法測量快速、準(zhǔn)確，可用于染料、藥品等行業(yè)的快速檢測。采用濕法工藝得到的樣品中靛藍(lán)含量明顯高于干法工藝，樣品中靛藍(lán)含量與產(chǎn)靛植物種類有關(guān)。

致謝：江蘇南通水色染坊、臺(tái)灣南投自然色手作坊、貴州亙藍(lán)母圖民族布藝蠟染開發(fā)有限公司提供了部分樣品，謹(jǐn)致謝忱！