熊 爽, 張 麗,2, 黃益嘉, 彭麗芳, 邵歡歡, 勾 洵*

(1. 四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101; 2. 內江衛(wèi)生與健康職業(yè)學院 基礎醫(yī)學部, 四川 內江 641100)

我國作為畜禽養(yǎng)殖大國,抗生素被大規(guī)模地用于預防、治療禽畜疾病和促進禽畜生長,每年被應用于畜禽養(yǎng)殖的抗生素約占我國抗生素使用總量的46.1%[1-3].但相關研究表明,一半以上進入到動物體內的抗生素因無法被吸收而以原藥或糞便、尿液等代謝物的形式排出體外.這些抗生素逐漸進入生態(tài)環(huán)境后,很難完全得到轉化或降解[4-5].隨著使用時間的增加,一些微生物產生抗生素抗性基因,而后病原菌對抗生素的抗性也隨之增加,環(huán)境細菌的耐藥性增加,給人類健康帶來威脅[6-7].另一方面,微量金屬元素作為飼料添加劑被養(yǎng)殖場使用,畜禽糞便中的重金屬殘留也是養(yǎng)殖場土壤中重金屬污染的主要來源[8].這些重金屬污染不僅嚴重危害畜禽的健康、食品的安全,也對周圍土壤環(huán)境和地下水循環(huán)造成威脅.高濃度的重金屬污染被證實與抗生素抗性基因的豐度密切相關,細菌耐藥性水平隨著重金屬污染水平增加而增加.畜禽養(yǎng)殖場及周圍土壤環(huán)境受到重金屬和抗生素的復合污染,對環(huán)境細菌的抗生素抗性水平表現出交互影響,促進或抑制細菌抗生素抗性的污染,但具體影響尚不清楚,相關研究較少,且缺乏系統(tǒng)性[9-10].

本研究從某畜禽養(yǎng)殖場土壤中篩選具有抗生素抗性的菌株,研究在抗生素(慶大霉素、阿莫西林、頭孢拉定、四環(huán)素)濃度一定情況下,不同濃度梯度的典型重金屬(Cu2+、Cr6+、Cd2+)對其抗生素抗性水平的影響,為研究重金屬和抗生素復合污染對畜禽養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的影響及利用微生物法進行防治提供科學支撐[11].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品 樣品采集于成都市某廢棄畜禽養(yǎng)殖場土壤,質控菌株分別為銅綠假單胞菌ATCC 27853和大腸桿菌ATCC 35218.

1.1.2主要儀器 SW-CJ-2F超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);H1850R高速冷凍臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);HH-S6電子恒溫水浴鍋(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠);GHP-9050隔水式培養(yǎng)箱(上海和羽電子科技有限公司);UV1000紫外可見分光分析儀(上海天美科學儀器有限公司);JD200-3電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司);PHS-25B數字酸度計(上海大普儀器有限公司);S1000 PCR儀(Bio-Rad);酶標儀(SpectraMax i3x);微型離心機(杭州奧盛儀器有限公司,Mini-6K);恒溫震蕩機(SPH-200B);水平電泳槽(Bio-Rad).

1.1.3主要試劑及培養(yǎng)基 培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基,基礎培養(yǎng)基,MH瓊脂培養(yǎng)基,重金屬離子實驗培養(yǎng)基等.

重金屬標準液:配制質量濃度為104mg/L的CdCl2·2.5H2O、CuSO4·5H2O和K2Cr2O7重金屬標準溶液,用于調節(jié)選擇培養(yǎng)基中重金屬的濃度.

藥敏紙片:頭孢拉定(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片),購于杭州微生物試劑有限公司.

1.2 方法

1.2.1土壤菌的篩選與分離純化 稱取10 g土壤溶于90 mL無菌水,20 ℃振蕩培養(yǎng)24 h.向99 mL的LB液體培養(yǎng)基中加入1 mL土壤培養(yǎng)液的上清液,30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h.培養(yǎng)基平板上均勻涂布50 μL稀釋菌液,菌液干燥后倒置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中.挑取形態(tài)不一樣的單菌落,轉移至液體基礎培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h.經劃線分離后,在30 ℃生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng).甘油管藏保存分離出的單菌落.

1.2.2標準曲線的測定及繪制 按照麥氏比濁管的不同比濁管配制相應濁度的硫酸鋇溶液,分光光度計測量625 nm時,空白、0.5、1、2、3和4時各個濁度的硫酸鋇溶液的光吸收值,每個樣測3個平行樣,制作標準曲線.

菌株平板劃線接種后,在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)18 h.按照1%的接種量,接種到液體基礎培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至第2、4、8 h時,分別測定625 nm時光吸收值,得到菌株的生長曲線,以確定1.5×108cfu·mL-1的懸菌液合適的培養(yǎng)時間,用于重金屬最小抑制濃度(Minimal Inhibition Concentration,MIC)測定及抗生素抗性研究.

1.2.3抗性菌株的篩選及鑒定 采用K-B紙片擴散法做抗生素耐藥試驗[12].初篩過程篩選出10株具有抗生素抗性的菌.移取比濁后的100 μL懸菌液,均勻涂布到MH試驗培養(yǎng)基上,放置15 min后,將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面,各紙片中心距離大于24 mm,平板邊緣到紙片邊緣的距離大于15 mm.每個平板貼3片相同的抗生素紙片作為對照,靜置18 min后37 ℃培養(yǎng)18 h,測量抑菌圈直徑.

1.2.416S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取模板DNA,采用細菌16S rRNA通用引物進行PCR擴增.PCR反應體系(25 μL):2×Taq PCR Master-mix KT20112.5 μL,27F 1μL,1492R 1μL,ddH2O 7.5 μL,模版DNA3 μL.

引物序列27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GGTTACCT TGTTACGACTT-3′.

PCR程序:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進行35個循環(huán),72 ℃終延伸10 min.

PCR產物送成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序,后將基因序列提交GenBank,采用BLAST分析所測序列同源性,通過EzBioCloud網站(www.ezbiocloud.net/)對該菌株進行初步的菌株確定,并利用MEGA 5.0構建菌株系統(tǒng)進化樹.

1.2.5重金屬最小抑制濃度的測定 在基礎培養(yǎng)基中分別添加不同量的重金屬標準液,Cd2+的質量濃度變化范圍為0～200 mg·L-1，Cr6+的質量濃度變化范圍為0～400 mg·L-1，Cu2+的質量濃度變化范圍為0～1 600 mg·L-1,將100 μL菌懸液涂布到各培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h.記錄抑制菌株生長的最低重金屬濃度,即為重金屬最小抑制濃度MIC.

1.2.6重金屬與抗生素交叉抗性的研究 本試驗設計在抗生素濃度一定時(慶大霉素10 μg/片、阿莫西林20 μg/片、頭孢拉定30 μg/片、四環(huán)素30 μg/片),不同濃度的重金屬對菌株的抗生素抗性的影響.根據3種重金屬的MIC值,分別添加一定量的重金屬標準液至MH培養(yǎng)基中,凝固后取100 μL菌懸液滴加至含重金屬的試驗培養(yǎng)基上,涂布均勻.15 min后,取藥敏紙片貼在涂好菌液的培養(yǎng)基上,每個平板上貼3片,37 ℃培養(yǎng)18 h,測定抑菌圈大小，并計算抑菌圈的直徑變化率.

1.2.7統(tǒng)計分析 利用SPSS 20.0對數據進行單變量多因素方差分析(P<0.05).通過加入重金屬前后的抑菌圈直徑比值計算抑菌圈直徑變化率.利用origin 8.5繪制不同濃度Cd2+、Cu2+、Cr6+對抗生素抗性水平影響的柱形圖.

2 結果與分析

2.1 抗性菌株的篩選和鑒定實驗前期共篩選出38種菌,對其進行抗性研究,其中編號10-③的菌對4種抗生素抗性相對較高,命名為C32.革蘭氏染色陰性，呈桿狀,單個或成對.生化性質鑒定結果見表1.菌落為圓形,灰白色,表面濕潤,有光澤,不透明,邊緣不規(guī)則,較黏稠.易挑取,中央部位比邊緣顏色深.偶爾可見黏液或粗糙型(見圖1).

表1 C32的生化試驗結果

圖1 C32的形態(tài)觀察

注:C32在基礎培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)1天

2.2 C32的16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析使用NCBI數據庫中的BLAST軟件對C32的16S rDNA序列進行比對分析,結果表明C32菌株與Citrobacterfreundiistrain NBRC 12681 (NR 113596.1)和Citrobacterfreundiistrain JCM 1657(NR 113340.1)的相似度為99.71%,通過EzBioCloud網站比對分析發(fā)現C32最可能是Citrobacterfreundii菌株,同時系統(tǒng)進化樹結果也發(fā)現C32與C.freundiistrain NBRC 12681和C.freundiistrain JCM 1657親緣關系最近,因此,C32菌株很有可能是Citrobacterfreundii菌株(見圖2).

圖2 菌株C32的16S rDNA系統(tǒng)進化樹

2.3 重金屬最小抑制濃度的確定測得C32對Cd2+、Cr6+、Cu2+的MIC分別為125、125和1 600 mg/L,并在此基礎上研究重金屬對其抗生素抗性的影響.根據C32的重金屬MIC值分別設置3種重金屬的濃度梯度,Cd2+和Cr6+的質量濃度梯度設置為0、0.1、2、10、50、100和150 mg/L,Cu2+的質量濃度梯度設置為0、0.1、2、10、50、150、300、500、1 000、1 200、1 400和1 600 mg/L.

2.4 測定C32對重金屬與抗生素的交叉抗性

2.4.1C32抗生素抗性的測定 抗性菌的藥敏實驗結果見表2.由表2可知,C32對阿莫西林、四環(huán)素和對頭孢拉定表現耐藥,而對慶大霉素表現敏感.

表2 C32的抗生素敏感性

2.4.2重金屬種類和濃度與抗生素抗性的相關性分析 單變量多因素方差分析結果顯示F種類=1 728.803,P種類<0.05,表明重金屬種類對抑菌圈直徑的變化影響顯著;另外F濃度=26.509,P濃度<0.05,也表明重金屬濃度對抑菌圈直徑的變化影響顯著.此外,不同類型的二維交互效應對抑菌圈直徑也有顯著的影響(P<0.05),重金屬濃度×重金屬種類×抗生素種類之間的三維交互效應同樣顯著影響抑菌圈直徑(F=14.023,P<0.05),說明重金屬與抗生素之間具有交互作用,同時交互效應的影響也表明重金屬脅迫對菌株抗生素抗性水平有一定的影響(表3).

表3 主效應方差分析

2.4.3重金屬濃度對抗生素抗性的影響 1) Cd2+濃度對C32的抗生素的抗性影響.圖3A顯示,與阿莫西林共存時,隨著Cd2+濃度升高,抑菌圈直徑由12.35 mm(0.1 mg/L)逐漸增大到19.59 mm(100 mg/L),表明隨Cd2+濃度的升高,協(xié)同殺菌作用逐漸增強;頭孢拉定與Cd2+共存時,抑菌圈直徑的相對變化率依次為1.12%(0.1 mg/L)、-16.80%(2 mg/L)、-19.92%(10 mg/L)、-13.84%(50 mg/L)、52.16%(100 mg/L),結果表明低濃度Cd2+與頭孢拉定表現協(xié)同抗性作用,較高濃度Cd2+與頭孢拉定表現協(xié)同殺菌作用;四環(huán)素與Cd2+共存時,抑菌圈直徑變化率為-6.67%～16.06%,表明Cd2+存在時抑菌圈直徑變化率很小,但抑菌作用隨Cd2+濃度的升高而增強;慶大霉素與Cd2+共存時,抑菌圈的直徑變化率為4.89%～22.58%,結果表明Cd2+存在時表現協(xié)同殺菌作用,且抑菌能力隨Cd2+濃度的升高而升高.

A

2) Cr6+濃度對C32的抗生素的抗性影響.圖3B顯示,阿莫西林與Cr6+共存時,抑菌圈直徑變化率分別為51.05%(0.1 mg/L)、64.72%(2 mg/L)、35.79%(10 mg/L)、96.46%(50 mg/L),表明隨Cr6+濃度的升高,協(xié)同殺菌作用逐漸增強;頭孢拉定與Cr6+共存時,抑菌圈直徑由10.5增大到15.13 mm,抑菌圈直徑變化率范圍為-15.95%～21.02%,結果表明低濃度Cr6+與頭孢拉定表現協(xié)同抗性作用,較高濃度Cr6+與頭孢拉定表現協(xié)同殺菌作用;四環(huán)素與Cr6+共存時,抑菌圈的直徑變化率范圍為-5.45%～4.18%,表明Cr6+存在時抑菌圈直徑變化率很小,但抑菌作用隨Cr6+濃度的升高而增強.慶大霉素與Cr6+共存時,抑菌圈直徑變化率為0.53%(0.1 mg/L)、-1.97%(2 mg/L)、-9.68%(10 mg/L)、-10.88%(50 mg/L),表明Cr6+存在,主要表現協(xié)同抗性作用.

B

3) Cu2+濃度對C32的抗生素的抗性影響.圖3C顯示,當Cu2+與阿莫西林共存時,抑菌圈直徑變化率范圍為-10.10%～15.08%(0.1～1 200 mg/L),說明低濃度Cu2+共存對C32的阿莫西林抗性影響很小;但當Cu2+質量濃度為1 400和1 600 mg/L時,抑菌圈變化率分別為74.10%和87.01%,說明高濃度Cu2+與阿莫西林表現為協(xié)同殺菌,且隨Cu2+濃度升高而增大;Cu2+與頭孢拉定共存時,抑菌圈直徑變化率范圍為-37.92%～-3.73%(0.1～500 mg/L),27.73%～42.08%(1 000～1 600 mg/L),結果表明低濃度Cu2+與頭孢拉定表現協(xié)同抗性作用,較高濃度Cu2+與頭孢拉定表現協(xié)同殺菌作用;Cu2+與四環(huán)素共存時,抑菌圈的直徑變化率范圍為-14.12%～31.21%(0.1～1 600 mg/L),表明Cu2+存在時,表現低濃度為協(xié)同抗性作用,高濃度為協(xié)同殺菌作用;慶大霉素與Cu2+共存時,抑菌圈的直徑變化率范圍為-4.36%～46.40%(0.1～1 600 mg/L),結果表明低濃度Cu2+與慶大霉素表現協(xié)同抗性作用,較高濃度Cu2+與慶大霉素表現協(xié)同殺菌作用.

C

2.4.4C32抗生素抗性與重金屬種類之間的關系 由表4可知,菌株的抗生素抗性變化可能只與重金屬種類相關,Cd2+的共存導致菌株的四環(huán)素、阿莫西林和頭孢拉定抗性減弱;Cr6+存在時,使菌株阿莫西林抗性明顯減弱;而Cu2+的共存導致菌株的四環(huán)素抗性明顯減弱.敏感程度變化見表4.

表4 重金屬共存對抗生素敏感性的影響

3 討論

抗生素是一種天然或人工條件下產生的可以抑制其他細菌生長的物質.畜禽養(yǎng)殖過程中飼喂抗生素會導致抗性基因的出現,且飼喂抗生素的種類和濃度與細菌的抗生素抗性基因有明顯的正相關性[7,13],抗生素的長期濫用易引起環(huán)境細菌抗生素抗性基因擴散,這已成21世紀威脅人類健康的最大挑戰(zhàn)之一[14],微量金屬元素隨畜禽飼料添加劑進入環(huán)境,金屬元素的含量也影響著抗生素抗性基因的豐度,使環(huán)境細菌同時具備重金屬抗性與抗生素抗性,加劇了細菌耐藥水平[15-17].為研究重金屬和抗生素復合污染對畜禽養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的影響,本研究通過實驗室條件從成都市某廢棄畜禽養(yǎng)殖場土壤中篩選出抗生素抗性菌株C32,并對其進行了耐藥性質的鑒定及重金屬脅迫對其抗生素抗性影響的測定.結果發(fā)現:C32耐藥性質的鑒定表明其具有四環(huán)素、頭孢拉定和阿莫西林抗性,經16S rDNA鑒定C32屬于Citrobacterfreundii,屬條件致病菌,在適宜的條件下可引起人體腦膜炎、創(chuàng)面感染和敗血癥等疾病,亦可引發(fā)食物中毒,造成食源性污染,故對畜禽養(yǎng)殖而言有較高風險.重金屬和抗生素間的交互作用表現為抗生素抗性隨重金屬濃度增加而減弱的協(xié)同抗性作用和抗生素抗性隨重金屬濃度增加而增強的協(xié)同殺菌作用.方差分析表明,不同的重金屬種類和濃度對C32的抑菌圈直徑有顯著影響(P<0.05),說明C32的抗生素抗性水平與重金屬的種類和濃度有著密切的關系.重金屬和抗生素之間的吸附和絡合作用可能影響其協(xié)同作用,Wang等[18]研究表明四環(huán)素與Cu2+之間能形成絡合物,并在土壤中顯著影響環(huán)境化學行為,改變Cu2+的生物有效性,如Cu2+可以增強阿莫西林的殺菌效果,以及四環(huán)素可以增加Cu2+在畜禽養(yǎng)殖土壤上的吸附量[18-19].楊統(tǒng)一等[20]報道的Cu2+與頭孢拉定的交叉組合對細菌的抗性作用表現為:低濃度時表現協(xié)同抗性作用,高濃度時表現協(xié)同殺菌作用,本研究中Cu2+與頭孢拉定、Cu2+與阿莫西林、Cu2+與四環(huán)素及Cu2+與慶大霉素分別交叉組合時的抗性作用結果與其他的結果表現較為一致,可能是因為在畜禽養(yǎng)殖過程中,低濃度的重金屬作為營養(yǎng)素能刺激細菌的生長,而在高濃度時與菌株的酶或DNA結合,抑制細菌生長[21],但這與抗生素的抑菌作用機制不同,導致不同重金屬對其影響也不同,如阿莫西林和頭孢拉定主要抑制細胞壁的合成[13].孫建平[22]研究表明重金屬與抗生素的毒性可以發(fā)生疊加,使得菌株的抗生素的敏感性降低,從而表現為協(xié)同殺菌作用.當Cr6+與頭孢拉定交叉組合時,低濃度時表現協(xié)同抗性作用,高濃度時表現協(xié)同殺菌作用;當Cr6+與阿莫西林交叉時,表現為協(xié)同殺菌作用;當Cr6+與慶大霉素或四環(huán)素分別交叉組合時,重金屬離子從低濃度開始即表現為協(xié)同抗性;可能是Cr6+既有毒性,又有致突變性,Cr6+會引起細菌DNA損傷[23],Cr6+的毒性與頭孢拉定或阿莫西林的殺菌效果有相加作用,表現為協(xié)同殺菌作用,而大部分的微生物都能依賴其自身特殊的結構,發(fā)生氧化還原反應,可使Cr6+轉化成Cr3+的形態(tài),從而達到降低毒性的效果,這就可能使得高濃度的Cr6+與四環(huán)素或慶大霉素組合表現為協(xié)同抗性.Cd2+與慶大霉素或阿莫西林組合時具有協(xié)同殺菌作用;Cd2+與頭孢拉定或四環(huán)素分別交叉組合，表現為低濃度和協(xié)同抗性作用,高濃度表現為協(xié)同殺菌作用;可能是抗生素能使Cd2+在畜禽養(yǎng)殖土壤上富集[19],使殺菌效果增強而表現協(xié)同殺菌.可是,也有一些研究結果表明，重金屬離子可以降低細菌的抗生素敏感性[24],從本研究結果來看,Cd2+的共存導致菌株的四環(huán)素、阿莫西林和頭孢拉定抗性減弱;Cr6+存在時,菌株阿莫西林抗性明顯減弱;Cu2+的共存導致菌株的四環(huán)素抗性明顯減弱,而此時重金屬濃度對抗生素抗性表現無顯著影響,表明C32的某些耐藥性與重金屬濃度無關.由此,高濃度的重金屬離子雖然能降低抗生素的敏感性,達到降低耐藥性的目的,但重金屬會在環(huán)境中富集,并且難以降解,污染畜禽養(yǎng)殖的生態(tài)環(huán)境.畜禽飼料添加劑的重金屬應避免加入大劑量的Cu2+,Cr6+與阿莫西林和Cd2+與慶大霉素或阿莫西林在低濃度狀態(tài)下即能達到殺菌和降低抗生素敏感性的效果,可聯(lián)合使用以降低細菌的耐藥性,具有一定的應用價值.本研究雖然對部分金屬離子對抗生素抗性的影響有探究,但針對重金屬與不同抗生素復合效用的基因定位等仍需進一步研究.因此,探究細菌的多重抗性、重金屬和抗生素的交互效應對修復重金屬與抗生素的復合污染、探明治理過程中的微觀機制起著重要作用[25].

4 結論

從成都市某廢棄畜禽養(yǎng)殖場土壤中篩選出一株具有抗生素抗性菌株C32,經鑒定屬于檸檬酸桿菌屬(Citrobacter),具有阿莫西林、頭孢拉定和四環(huán)素多重抗性,對重金屬Cd2+、Cr6+、Cu2+的MIC分別為125、125和1 600 mg/L.研究表明重金屬的濃度及種類均會對C32的抗生素抗性影響顯著(P<0.05),在Cu2+、Cd2+與頭孢拉定、Cd2+與四環(huán)素及Cu2+、Cr6+與慶大霉素交叉組合時,重金屬低濃度時表現協(xié)同抗性作用,高濃度時表現協(xié)同殺菌作用.Cr6+、Cd2+與阿莫西林及Cd2+與慶大霉素交叉組合，表現為協(xié)同殺菌，且隨著重金屬濃度升高,抑菌能力逐漸增強.