謝婉玉，王永明，紀(jì)紅梅，黃 茜，徐永記，紀(jì) 洋*，馮彥房

秸稈還田種類對(duì)稻田N2O排放及硝化反硝化微生物的影響①

謝婉玉1,2，王永明1，紀(jì)紅梅3，黃 茜1,2，徐永記1，紀(jì) 洋1*，馮彥房4

(1 南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院，南京 210044；2 南京信息工程大學(xué)長(zhǎng)望學(xué)院，南京 210044；3 山東省德州市陵城區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東德州 253500；4 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江下游平原農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)

以太湖流域典型單季稻田的原狀土柱為研究對(duì)象，通過(guò)設(shè)置溫室土柱試驗(yàn)，同步監(jiān)測(cè)3種秸稈(水稻秸稈RS、小麥秸稈WS、玉米秸稈MS)施用下水稻各生長(zhǎng)期N2O排放、水稻產(chǎn)量和土壤理化因子，同時(shí)定量化分析多個(gè)N2O排放相關(guān)菌群及功能基因的豐度，以闡明N2O排放對(duì)不同種類秸稈施用引發(fā)的微生物響應(yīng)機(jī)制，篩選控制單季稻田N2O減排增效最佳的秸稈種類。結(jié)果表明：與對(duì)照相比，RS、WS和MS處理下水稻生長(zhǎng)期N2O排放量分別增加162.32%、107.11% 和9.48%，其中RS處理顯著高于MS處理。水稻生育期內(nèi)，土壤氨氧化菌(AOA、AOB)和反硝化菌群落(、)豐度均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。與對(duì)照相比，拔節(jié)期RS處理顯著增加AOA、AOB、和拷貝數(shù)，MS和WS處理對(duì)上述功能基因豐度均無(wú)顯著影響。各生育期土壤NH4+-N含量整體高于NO3–-N含量，二者均在水稻分蘗期達(dá)到峰值，而后隨水稻生長(zhǎng)不斷降低，同一時(shí)期不同秸稈處理之間二者無(wú)顯著性差異。相關(guān)性分析和結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)結(jié)果表明，土壤AOB豐度和土壤NH4+-N含量是直接影響稻田土壤N2O排放的主要因素。綜合考慮不同類型秸稈還田后土壤理化因子、水稻產(chǎn)量和微生物豐度變化，玉米秸稈是減緩太湖流域單季稻田N2O排放且提高產(chǎn)量的最優(yōu)秸稈還田種類。

秸稈種類；N2O排放；土壤微生物；結(jié)構(gòu)方程模型；稻田

地球大氣中溫室氣體濃度呈現(xiàn)長(zhǎng)期持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，對(duì)氣候變化造成嚴(yán)重危害。自20世紀(jì)中期以來(lái)，全球平均表面溫度上升源于3種主要溫室氣體(CO2、CH4和N2O)濃度的增加[1]。N2O在大氣中含量雖少，但在100年尺度上其相對(duì)增溫潛勢(shì)是CO2的298倍[2]。2019年，全球N2O的平均濃度已達(dá)到0.332 μmol/mol，是1750年工業(yè)化前水平(0.27 μmol/mol) 的123%[3]。人類在過(guò)去40年內(nèi)向農(nóng)田施氮，使得人為N2O排放量增加30%，是造成N2O負(fù)擔(dān)增長(zhǎng)的主要原因[4]。我國(guó)稻田排放產(chǎn)生的N2O約占農(nóng)田N2O排放總量的7% ～ 11%[5]。因此，控制稻田N2O排放是減緩溫室效應(yīng)的主要措施之一。

我國(guó)稻田的水分管理模式主要是以前期淹水、烤田、干濕交替和排水落干為特征的間隙灌溉[6]。土壤微生物好氧的硝化作用過(guò)程和厭氧的反硝化作用過(guò)程是稻田土壤N2O排放的重要來(lái)源[7]。一般認(rèn)為烤田期和排水落干期水分條件適宜，土壤硝化菌和反硝化菌的活性增強(qiáng)，是產(chǎn)生N2O的主要階段[8]。硝化作用由氨氧化過(guò)程和亞硝酸氧化過(guò)程組成，其中氨氧化過(guò)程是反應(yīng)的限速步驟，而氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)是催化氨氧化過(guò)程的重要菌種[9]。反硝化作用是指在厭氧條件下，微生物將硝酸鹽及亞硝酸鹽還原為NO、N2O和N2的過(guò)程，其中由亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)镹O的過(guò)程是反硝化作用的關(guān)鍵步驟[10]，亞硝酸鹽還原酶是調(diào)控該過(guò)程的關(guān)鍵酶，其功能基因由和編碼[11]。N2O還原酶是調(diào)控N2O轉(zhuǎn)變?yōu)镹2的關(guān)鍵酶，其功能基因由編碼[12]。通過(guò)研究與N2O排放相關(guān)的土壤微生物功能基因可從分子生物學(xué)角度探尋N2O的排放規(guī)律[13]。

秸稈還田作為一項(xiàng)保護(hù)地耕作措施，具有培肥地力、固碳增產(chǎn)的作用[14]。當(dāng)前有關(guān)秸稈還田對(duì)稻田N2O排放影響的報(bào)道尚未達(dá)成一致結(jié)論。有研究表明，相比秸稈不還田處理，秸稈還田處理顯著增加稻田N2O排放[15]；施氮促進(jìn)稻田N2O排放，而配施小麥秸稈則會(huì)抑制稻田N2O排放[16]；添加水稻秸稈促進(jìn)稻田N2O排放[17]。以上研究多從土壤理化性質(zhì)角度分析秸稈還田對(duì)稻田N2O排放的影響，但與其微生物學(xué)機(jī)制相關(guān)聯(lián)的研究較少。一方面，秸稈還田使微生物可利用碳源增加，增強(qiáng)微生物活性，加快氧氣消耗從而形成厭氧環(huán)境，有利于進(jìn)行反硝化作用，增加N2O排放[18]；另一方面，由于秸稈碳氮比較高，加入土壤后會(huì)促進(jìn)微生物對(duì)氮的固定，減少N2O排放[19]。因此，不同種類秸稈的施用對(duì)稻田N2O排放的影響具有不確定性，對(duì)硝化反硝化微生物的影響有待進(jìn)一步研究。

基于此，本研究以典型單季稻田的原狀土柱為研究對(duì)象，設(shè)置土柱試驗(yàn)，同步監(jiān)測(cè)3種秸稈施用(水稻秸稈RS、小麥秸稈WS、玉米秸稈MS)下水稻各生長(zhǎng)期N2O排放通量、水稻產(chǎn)量、土壤理化因子，同時(shí)利用分子生物學(xué)技術(shù)，將上述因子與N2O產(chǎn)生的微生物過(guò)程相耦合，定量化研究5個(gè)N2O排放相關(guān)菌群及功能基因(氨氧化古菌AOA、氨氧化細(xì)菌AOB、反硝化菌功能基因、、)的豐度，以闡明N2O排放對(duì)不同種類秸稈施用引發(fā)的微生物響應(yīng)機(jī)制，篩選單季稻田N2O減排效果最佳的秸稈還田模式，為稻田溫室氣體排放估算與減排措施的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土樣采集

供試原狀土樣，采自江蘇省宜興市周鐵鎮(zhèn)(31.4765°N，119.9861°E)典型單季稻田，土柱試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代化溫室進(jìn)行，供試驗(yàn)水稻品種南粳46，于2020年6月29日移栽，同年11月9日收獲。供試土壤由0 ～ 20、20 ～ 40和40 ～ 60 cm三個(gè)深度的土壤各自混合均勻后得到，稱取35 kg依次裝入半徑為15 cm、有效高度為50 cm的土柱內(nèi)。土壤的基本理化性質(zhì)為：pH 6.38(土壤∶水=1∶2.5)，有機(jī)質(zhì)含量29.2 g/kg，全氮含量1.72 g/kg，有效磷含量23.09 mg/kg，速效鉀含量159.28 mg/kg，CEC 22.61 cmol/kg。選用水稻、小麥和玉米3種作物秸稈作為供試秸稈，其基本性質(zhì)如表1所示。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置4個(gè)處理：空白對(duì)照(CK)、水稻秸稈還田(RS)、小麥秸稈還田(WS)、玉米秸稈還田(MS)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共12個(gè)盆栽。本試驗(yàn)中水稻秸稈由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，小麥和玉米秸稈由山東省德州市陵城區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心提供。還田秸稈采用尼龍網(wǎng)袋法處理，即將秸稈粉碎至1 ～ 2 cm大小后裝入尺寸為15 cm×20 cm的350目尼龍網(wǎng)袋中密封，按照每盆280 g的施用量(0.8% 每克干土，相當(dāng)于田間施入量約8 t/hm2)施用至盆栽內(nèi)部5 ～ 10 cm處。

表1 供試秸稈基本性質(zhì)

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(<0.05)，下同。

綜合當(dāng)?shù)厥┓使芾矸绞?，氮?尿素)施用量為N 240 kg/hm2，基肥、分蘗肥和穗肥分別在2020年6月30日、7月15日和8月13日按50%、25% 和25% 比例施用；磷肥P2O596 kg/hm2和鉀肥K2O 192 kg/hm2，作基肥一次性施用。水分管理采用間隙灌溉模式，并將水稻生長(zhǎng)期分為前期淹水(2020年6月30日—7月29日)、烤田(7月30日—8月12日，通常土壤水分含量達(dá)到50% ～ 60% 田間最大持水量時(shí)結(jié)束烤田)、干濕交替(8月13日—10月14日)和排水落干(10月15日—11月9日)4個(gè)時(shí)期。

在水稻生長(zhǎng)的4個(gè)典型生育期(分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期)原位采集0 ～ 10 cm深度土壤樣品。一部分烘干磨碎過(guò)篩后用于基本理化性質(zhì)分析，剩余部分在–20 ℃條件下保存用于土壤微生物分析。4個(gè)典型生育期采樣時(shí)間分別對(duì)應(yīng)前期淹水、排水烤田、干濕交替和排水落干時(shí)期。分別于施用基肥、分蘗肥和穗肥后7 d內(nèi)每天17:00—19:00用50 ml塑料瓶采集田面水水樣，過(guò)濾后測(cè)定NH4+-N和NO3–-N含量。土壤和田面水無(wú)機(jī)氮含量由荷蘭SKALAR SAN++ SYSTEM 流動(dòng)分析儀測(cè)定(Skalar, the Netherlands)測(cè)定。水稻收獲時(shí)計(jì)算水稻產(chǎn)量。

1.2 氣樣采集與測(cè)定

本研究采用密閉靜態(tài)暗箱法[20]采集氣體，用氣相色譜儀測(cè)定N2O濃度。采樣箱(長(zhǎng)25 cm×寬21 cm×高80 cm)由PVC材料制成，外覆鋁膜，具有不透光性。采樣箱內(nèi)置小型風(fēng)扇以使采集氣體更均勻、更準(zhǔn)確，同時(shí)配備溫度計(jì)以記錄采樣時(shí)溫度變化。采樣前先倒置采樣箱，使其邊緣與盆栽盆凹槽密閉連接，然后向盆栽盆凹槽注水，密封采樣箱，隔絕外界氣體。選擇上午08:00—10:00采集樣品，一組采樣設(shè)置4個(gè)采集時(shí)段，在45 min內(nèi)完成，即用20 ml注射器每15 min向采樣箱抽集氣體。水稻生長(zhǎng)季內(nèi)水分變化劇烈的烤田及復(fù)水期每2 ～ 3 d采樣1次，其他時(shí)間每隔4 ～ 5 d采樣1次，水稻收獲前1個(gè)月間隔7 d采樣1次。

將采集的氣樣注入氣相色譜儀(Shimadzu, GC14B)，N2O濃度由放射源為63Ni的電子捕獲(ECD)檢測(cè)器以恒電流方式測(cè)量。對(duì)每組氣樣檢測(cè)后的4個(gè)濃度值進(jìn)行線性回歸分析得到N2O排放通量，再通過(guò)積分求出水稻各生育期N2O的累積排放量。

根據(jù)N2O濃度與時(shí)間關(guān)系曲線計(jì)算排放通量：

=×/×d/d×273/(273+) (1)

式中：代表N2O排放通量(N, μg/(m2·h))；為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下N2O密度(1.25 kg/m3)；為采氣箱內(nèi)有效空間體積(m3)；為采氣箱覆蓋的土壤面積(m2)；d為氣體濃度差(nl/L)；d為時(shí)間間隔(h)；為采樣時(shí)箱溫(℃)。

N2O排放通量用每次觀測(cè)的3個(gè)重復(fù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。N2O平均排放通量是將3個(gè)重復(fù)的每次觀測(cè)值按時(shí)間間隔加權(quán)平均后再平均。N2O總排放量按下式計(jì)算：

=∑[(F1+F)/2]×(D1–D)×24/1000 (2)

式中：代表N2O排放總量(N，g/m2或mg/m2)；F和F1分別為第和+1次采樣時(shí)N2O平均排放通量(N，μg/(m2·h))；D和D1分別為第和+1次采樣時(shí)間(d)。

1.3 土壤微生物豐度分析

稱取水稻各典型生育期土樣0.5 g，用Fast DNA SPIN KIT試劑盒(MP Biomedicals, Eschwege, Germany)提取總DNA[21]。DNA純度和濃度檢測(cè)方法均為NanoDrop2000，DNA完整性檢測(cè)方法為瓊脂糖凝膠電泳。操作按照說(shuō)明書的提取步驟進(jìn)行，將樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣品進(jìn)行檢測(cè)。將提取得到的微生物總DNA在電壓5 V/cm條件下通過(guò)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間為20 min，稀釋10倍后進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

使用Lighe Cycler ST300(Roche Diagnostics，Germany)定量PCR儀分別對(duì)成功提取的AOA、AOB及反硝化菌功能基因、、的特定DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。AOA和AOB的擴(kuò)增引物分別為Arch-amoAF/Arch-amoAR和amoA1F/amoA2R[22]，、和的擴(kuò)增引物分別為Cd3aF/R3cdR[23]、COPPER583F/COPPER909R[24]和nosLb/nosRb[25]，按照定量試劑盒說(shuō)明書設(shè)置程序。

使用CFX96C100?熱循環(huán)器(Bio-Rad, Hercules, CA)進(jìn)行擴(kuò)增。AOA和AOB的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性3 min；然后 35個(gè)循環(huán)為95 ℃變性45 s，53 ℃(AOA)或55 ℃(AOB)退火1 min，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃處理7 min[26]。的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性10 min；先進(jìn)行6個(gè)循環(huán)：95 ℃變性15 s，63 ～ 58 ℃(–1℃/循環(huán))處理30 s，72 ℃和80 ℃分別延伸30 s；再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃和80 ℃分別延伸30 s[27]。的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性5 min；先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，72 ～ 67 ℃(–1℃/循環(huán))處理1 min，72 ℃延伸1 min；再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，67 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃處理7 min[28]。的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；然后 35個(gè)循環(huán)為94 ℃變性1 min，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃處理5 min[29]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)、LSD法進(jìn)行多重比較、Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，采用R-4.0.4和Amos 24.0進(jìn)行結(jié)構(gòu)方程模型(Structral Equation Modeling)構(gòu)建與分析，采用Origin 2021繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 N2O排放通量變化

圖1表示不同處理下水稻生長(zhǎng)期N2O排放通量隨水稻移栽天數(shù)的變化。各處理N2O排放通量變化趨勢(shì)基本相同，在水稻移栽后20 d內(nèi)基本沒(méi)有N2O的產(chǎn)生，即盡管前期淹水時(shí)大量施用含氮的基肥和分蘗肥，但各個(gè)處理排放量較為穩(wěn)定，秸稈還田處理與CK基本沒(méi)有差異。施用分蘗肥后6 d至烤田開(kāi)始期間，N2O排放通量逐漸穩(wěn)步增長(zhǎng)?？咎锲陂g各處理N2O排放急劇增加，與CK相比，3個(gè)施用秸稈的處理N2O排放通量增加顯著，且施用秸稈處理于移栽后33 d時(shí)達(dá)到峰值，之后急劇下降。其中，RS處理N2O排放通量峰值高達(dá)N 2 387.92 μg/(m2·h)，是整個(gè)水稻生長(zhǎng)期所有處理的最大值。隨著烤田期的結(jié)束進(jìn)入穗肥期，N2O的排放再次進(jìn)入較低水平。施用穗肥后N2O排放通量有小幅波動(dòng)，在水稻移栽后81 d時(shí)RS與WS處理的排放峰值分別為N 215.58 μg/(m2·h)和187.14 μg/(m2·h)，但遠(yuǎn)小于烤田期峰值，此次波動(dòng)處于穗肥期結(jié)束后的常規(guī)時(shí)期(不施肥)。

(BF：基肥，TF：分蘗肥，PIF：穗肥，MSA：烤田期；下同)

2.2 N2O排放總量與水稻產(chǎn)量

由表2可知，各處理N2O排放主要集中在烤田期，烤田期N2O排放量占水稻生育期總排放量的51.52% ～ 57.21%，其次是排水落干時(shí)期，占排放量的31.52% ～ 38.67%。與CK相比，RS、WS和MS處理分別增加N2O排放總量6.85、4.52和0.40 mg/m2，增幅分別為162.32%、107.11% 和9.48%，其中僅RS處理與CK處理N2O排放總量有顯著性差異(<0.05)。施用秸稈均能顯著增加水稻產(chǎn)量，與CK相比增產(chǎn)0.24 ～ 0.41 kg/m2，增幅16.78% ～ 28.67%(<0.05)。相比CK，RS處理顯著增加了水稻單位產(chǎn)量N2O排放量的111.34%(<0.05)，而其他處理的增加效果不顯著。

表2 2020年各處理不同水分管理時(shí)期N2O排放量、N2O排放總量、水稻產(chǎn)量和單位產(chǎn)量N2O排放量

2.3 土壤氨氧化菌和反硝化菌的群落豐度

熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果表明(圖2)，稻田土壤AOA和AOB數(shù)量分別介于1.91×105～ 1.41×107copies/g和3.36×103～ 1.81×105copies/g，AOA拷貝數(shù)比AOB多出2 ～ 3個(gè)數(shù)量級(jí)，可知本試驗(yàn)中水稻土壤環(huán)境更利于AOA生長(zhǎng)。、和三種反硝化菌功能基因數(shù)量分別介于2.50×105～ 1.43× 107、7.86×104～ 1.74×106copies/g和6.56×104～ 4.60× 106copies/g，拷貝數(shù)比和多1個(gè)數(shù)量級(jí)，是反硝化過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)功能基因。在水稻生育期內(nèi)，除WS處理下豐度一直降低外，其他各處理氨氧化菌和反硝化菌群落豐度隨水稻生育期變化趨勢(shì)大致相同，均為先上升后下降。在拔節(jié)期，相比CK，RS處理下AOA、AOB、、豐度分別顯著增加了6.14倍、8.26倍、4.82倍和16.96倍(<0.05)，MS和WS處理對(duì)上述功能基因豐度均無(wú)顯著影響；不同處理均對(duì)豐度沒(méi)有顯著影響。同一生育期不同處理(+)/比值基本無(wú)顯著性差異；CK和RS處理不同生育期該比值沒(méi)有顯著性差異；WS和MS處理分蘗期該比值顯著高于其他3個(gè)時(shí)期(<0.05)，而其他3個(gè)時(shí)期之間沒(méi)有顯著性差異。

(圖中不同大寫字母表示同一處理不同時(shí)期間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示同一時(shí)期不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同)

2.4 土壤和田面水無(wú)機(jī)氮含量

圖3表明，本研究中土壤NH4+-N和NO3–-N含量均隨水稻生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，且NH4+-N含量整體高于NO3–-N含量。CK、RS、WS、MS處理下，土壤NH4+-N含量隨生育期變化的極差分別為27.26、21.11、40.75、42.60 mg/kg；土壤NO3–-N含量的極差分別為19.32、12.41、11.00、6.43 mg/kg。不同生育期間比較，各處理下土壤NH4+-N和NO3–-N含量均在分蘗期達(dá)到峰值，其中CK處理分蘗期土壤NH4+-N含量顯著高于其他3個(gè)生育期；RS處理各生育期之間土壤NH4+-N含量沒(méi)有顯著性差異；而WS和MS處理下，分蘗期土壤NH4+-N含量?jī)H顯著高于成熟期；除MS處理外，其余處理分蘗期土壤NO3–-N含量均顯著高于其他3個(gè)生育期(<0.05)。不同處理間比較，抽穗期CK處理的土壤NH4+-N含量顯著高于RS和MS處理(<0.05)，抽穗期MS處理的土壤硝態(tài)氮含量顯著高于CK和WS處理(<0.05)，其他生育期內(nèi)各處理之間均無(wú)顯著性差異。

圖3 水稻生長(zhǎng)期土壤NH4+-N、NO3–-N含量變化

如圖4所示，田面水NH4+-N濃度整體明顯高于NO3–-N濃度。各個(gè)處理3個(gè)肥期田面水NH4+-N濃度變化趨勢(shì)基本一致。水稻基肥期，1 ～ 4 d田面水NH4+-N濃度先大幅升高后迅速下降，且各個(gè)處理間峰值出現(xiàn)的時(shí)間存在差異，4 ～ 7 d內(nèi)呈現(xiàn)先下降后升高趨勢(shì)，變化幅度較上個(gè)時(shí)期小。水稻蘗肥期，田面水NH4+-N濃度每日以不同速率急劇下降。水稻穗肥期，NH4+-N濃度總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，變化速率先急后緩，其中1 ～ 4 d下降速率較快，4 ～ 7 d基本保持穩(wěn)定。各個(gè)處理3個(gè)肥期田面水NO3–-N濃度變化趨勢(shì)亦較為一致。水稻基肥期，1 ～ 2 d內(nèi)各處理田面水NO3–-N濃度幾乎沒(méi)有增長(zhǎng)，在2 ～ 4 d逐漸升高到達(dá)峰值，4 ～ 6 d緩慢下降，6 ～ 7 d 內(nèi)CK處理濃度下降而其余處理濃度升高。水稻蘗肥期，1 ～ 7 d內(nèi)田面水NO3–-N濃度逐漸增長(zhǎng)，其中CK處理在2 ～ 3 d和5 ～ 6 d出現(xiàn)小幅下降。水稻穗肥期，各處理在1 ～ 3 d內(nèi)濃度升高后又下降，且在3 ～ 6 d內(nèi)呈現(xiàn)同樣趨勢(shì)，其中WS處理變化幅度較大，6 ～ 7 d內(nèi)除RS處理濃度緩慢升高其余處理均緩慢下降。

2.5 相關(guān)性分析和結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，N2O排放量與田面水NH4+-N和NO3–-N濃度相關(guān)性不顯著，因此對(duì)除此以外的其他因素進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。N2O排放量與、AOB、、AOA、拷貝數(shù)分別在<0.01水平顯著正相關(guān)(按相關(guān)性由大到小排序)；與土壤NH4+-N含量在<0.01水平顯著負(fù)相關(guān)；與土壤NO3–-N含量在<0.05水平顯著負(fù)相關(guān)。

圖4 水稻生長(zhǎng)期田面水NH4+-N、NO3–-N 濃度季節(jié)變化

以N2O排放量為中心，建立路徑分析模型研究各因子對(duì)N2O排放量的影響，本研究中整個(gè)生育期土壤理化和微生物定量數(shù)據(jù)為影響因素的結(jié)構(gòu)方程模型如圖5所示，可見(jiàn)，AOB拷貝數(shù)和土壤NH4+-N含量對(duì)N2O排放量的影響起主導(dǎo)作用，顯著性<0.05，標(biāo)準(zhǔn)化路徑系數(shù)分別為0.64和–0.35，即AOB拷貝數(shù)增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差時(shí)N2O排放量增加0.64個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，土壤NH4+-N含量增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差時(shí)N2O排放量減少0.35個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。和AOB、和、AOB和拷貝數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.92、0.83和0.81；土壤NH4+-N和NO3–-N含量的相關(guān)系數(shù)為0.63。由此可見(jiàn)，AOB豐度和土壤NH4+-N含量是直接影響太湖地區(qū)單季稻田N2O排放的主要因素。

表3 N2O排放量與土壤微生物種群數(shù)量和土壤理化因子的相關(guān)性

注：Pearson雙尾顯著性檢驗(yàn)，=48；*和**分別表示在<0.05和<0.01水平上相關(guān)性顯著。

(路徑旁邊顯示標(biāo)準(zhǔn)化的路徑系數(shù)；實(shí)箭頭和虛箭頭分別表示P<0.05和P>0.05；箭頭的寬度與路徑系數(shù)的程度成正比；箭頭上數(shù)值的正負(fù)分別表示正相關(guān)關(guān)系和負(fù)相關(guān)關(guān)系)

3 討論

研究表明，N2O主要由土壤微生物參與的硝化和反硝化過(guò)程產(chǎn)生，其調(diào)控過(guò)程與土壤含水量和通氣性密切相關(guān)[30]。稻田長(zhǎng)期淹水時(shí)，O2供應(yīng)不足，N2O主要通過(guò)反硝化作用產(chǎn)生，產(chǎn)生的N2O在強(qiáng)還原條件下進(jìn)一步被還原為N2；而烤田和排水落干期稻田處于非淹水狀態(tài)，良好的通氣環(huán)境有利于硝化和反硝化作用同時(shí)進(jìn)行，N2O排放通量大幅增加[31]。由表2可知，在前期淹水、烤田、干濕交替、排水落干4個(gè)階段各處理N2O平均排放通量分別為N 1.02、3.37、0.59、2.29 mg/(m2·h)，即N2O主要集中在烤田期排放，與前人研究結(jié)論一致[32]。

本研究中，施用秸稈顯著促進(jìn)了單季稻整個(gè)生育期N2O的排放(圖1)，且增排效果RS>WS>MS，與單位產(chǎn)量N2O排放量從大到小排序一致。這可能是由于秸稈施入土壤，提供的易分解有機(jī)質(zhì)可以促進(jìn)硝化和反硝化微生物活動(dòng)，有利于N2O產(chǎn)生。秸稈在土壤中的降解速率受其化學(xué)組成的影響，適宜微生物分解的秸稈C/N比為28左右[33]。本研究供試水稻、小麥和玉米秸稈的C/N比分別為26.35、30.06和34.59。秸稈C/N比較高時(shí)微生物所需氮源受限，參與硝化和反硝化作用的底物供應(yīng)不足，減緩了N2O的排放[34]。盡管秸稈在水稻生長(zhǎng)前期腐解時(shí)固持土壤氮素導(dǎo)致作物缺氮，影響早期分蘗，但在水稻生長(zhǎng)后期，秸稈進(jìn)一步腐解，釋放其中儲(chǔ)存的養(yǎng)分，在水稻灌漿期提高根系活力，促進(jìn)光合物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，增加水稻產(chǎn)量[35]。有研究表明，后續(xù)作物吸收利用是秸稈還田的去向之一[36]；秸稈分解過(guò)程中的殘留物有助于維持農(nóng)業(yè)土壤中微生物的多樣性，并影響碳的相關(guān)轉(zhuǎn)化過(guò)程[37]。因此，秸稈分解不僅會(huì)發(fā)生在當(dāng)季，還會(huì)延續(xù)到后續(xù)作物及土壤微生物，因此N2O周年排放亟待進(jìn)一步研究。

本研究中，施用秸稈處理時(shí)各菌群基因豐度均在水稻拔節(jié)期達(dá)到最大(圖2)。結(jié)合以往研究分析可得，在水稻生長(zhǎng)前期，氮肥分解為硝化和反硝化作用提供底物，氨氧化菌和反硝化菌數(shù)量增多，至拔節(jié)期水稻生長(zhǎng)旺盛，菌群數(shù)量達(dá)到峰值，隨著氮素的消耗，水稻生長(zhǎng)后期氨氧化菌和反硝化菌數(shù)量減少[38]。施用秸稈可以培肥地力，為相關(guān)功能微生物提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、能源和底物，促進(jìn)拔節(jié)期氨氧化菌和反硝化菌的生長(zhǎng)和繁殖，大幅增加N2O排放通量，從而增加整個(gè)水稻生長(zhǎng)期的N2O排放總量。研究表明，高NH4+-N的中性土壤中AOB主導(dǎo)N2O產(chǎn)生，而低NH4+-N的酸性土壤中AOA對(duì)硝化作用貢獻(xiàn)較大[39]，這是由于酸性條件下AOA對(duì)氨的親和性較高[40]。本試驗(yàn)中，稻田土壤pH為6.38，相關(guān)性分析得到AOB拷貝數(shù)與N2O排放量相關(guān)性顯著，表明AOB主導(dǎo)氨氧化過(guò)程，且烤田期土壤通氣性好，AOB數(shù)量增多促進(jìn)硝化作用進(jìn)行，從而產(chǎn)生大量N2O。盡管和執(zhí)行的功能相同，但由于的豐度與磷或鉀的供應(yīng)量有關(guān)，而的豐度由氮的供應(yīng)量決定[41]，因此施用秸稈提供氮底物顯著增加的豐度而對(duì)的豐度沒(méi)有顯著影響。(+)/比值反映了反硝化產(chǎn)物N2O和N2的比例。本試驗(yàn)中拔節(jié)期各處理拷貝數(shù)增加，N2O排放通量卻并未減少，且秸稈處理下N2O排放通量均高于CK處理，而該比值則反之，進(jìn)一步說(shuō)明烤田期N2O主要通過(guò)硝化作用產(chǎn)生。本研究中N2O排放量與豐度和豐度呈顯著正相關(guān)，與以往研究一致[42-43]。

水稻生育期內(nèi)不同處理土壤NH4+-N和NO3–-N含量的變化趨勢(shì)表明，前期淹水期由于基肥和分蘗肥的施用，在適宜的條件下，尿素水解為NH4+-N，NH4+-N被氧化為NO3–-N。各處理分蘗期土壤NH4+-N和NO3–-N含量分別在25.87 ～ 48.92 mg/kg和8.62 ～ 20.73 mg/kg，為各生育期最大值。進(jìn)入拔節(jié)期之后，水稻由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)為生殖生長(zhǎng)，對(duì)氮素的需求量增加，隨著硝化作用和反硝化作用的進(jìn)行，土壤NH4+-N和NO3–-N含量均呈減少趨勢(shì)。分蘗期秸稈中的養(yǎng)分分解釋放較快，小麥和玉米秸稈處理下的土壤NH4+-N含量高于CK處理，拔節(jié)期之后CK處理下的土壤NH4+-N含量整體稍高于秸稈處理，與秸稈所含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等成分較難礦化、水稻生育后期分解緩慢有關(guān)[44]。分蘗期CK處理下的土壤NO3–-N含量高于秸稈處理，可能受秸稈腐解產(chǎn)生的有機(jī)酸抑制NO3–-N形成的影響[45]，也可能是秸稈還田初期稻田淹水條件下NO3–-N易流失所致[46]。相關(guān)性分析和SEM表明，N2O排放量與土壤NH4+-N和NO3–-N含量均呈負(fù)相關(guān)，而各生育期不同處理間反硝化作用底物NO3–-N和硝化作用底物NH4+-N含量基本沒(méi)有顯著性差異，這表明底物含量差異對(duì)N2O排放量的影響較小，與N2O排放相關(guān)的土壤微生物功能基因拷貝數(shù)的差異可能在N2O排放過(guò)程中產(chǎn)生更為重要的作用。因此，不同種類秸稈還田下與N2O排放相關(guān)的土壤微生物群落多樣性仍需進(jìn)一步研究，以明晰秸稈種類影響水稻生育期N2O排放的微生物機(jī)理。

4 結(jié)論

水稻拔節(jié)期(對(duì)應(yīng)烤田期)，與CK相比，RS處理顯著增加AOA、AOB、、豐度(<0.05)，從而增加水稻生長(zhǎng)期N2O排放量，WS和MS處理對(duì)上述功能基因豐度均無(wú)顯著影響，不同處理對(duì)豐度均沒(méi)有顯著影響。相關(guān)性分析表明，本試驗(yàn)條件下稻田N2O排放量與土壤中AOA、AOB、、和拷貝數(shù)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(<0.01)，與土壤NH4+-N含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(<0.01)，與土壤NO3–-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(<0.05)。利用結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)進(jìn)一步探究變量間的直接和間接作用發(fā)現(xiàn)，AOB豐度直接促進(jìn)N2O的排放，土壤NH4+-N含量則對(duì)其產(chǎn)生直接抑制作用。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)條件下AOB豐度和土壤NH4+-N含量對(duì)稻田土壤N2O排放起直接主導(dǎo)作用。綜合考慮單季稻田秸稈還田后水稻產(chǎn)量、土壤理化因子和微生物變化，本試驗(yàn)條件下玉米秸稈還田為減少N2O排放量、提高水稻產(chǎn)量的最優(yōu)處理。

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Effects of Returned Straw Type on N2O Emission, Nitrification and Denitrification Microorganisms from Paddy Field

XIE Wanyu1,2, WANG Yongming1, JI Hongmei3, HUANG Xi1,2, XU Yongji1, JI Yang1*, FENG Yanfang4

(1 College of Applied Meteorology, Nanjing University of Information Technology, Nanjing 210044, China; 2 College of Changwang, Nanjing University of Information Technology, Nanjing 210044, China; 3 Extension Center of Agricultural Technology in Lingcheng District, Dezhou, Shandong 253500, China; 4 Key Laboratory of Argo-Environment in Downstream of Yangtze Plain, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Agricultural Resources and Environment, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The original soil columns of a typical single-cropping paddy field in the Taihu Lake Basin were used as the research object, N2O emission, rice yield and soil physiochemical properties were monitored under the application of three straw types (rice straw-RS, wheat straw-WS and maize straw-MS), and the abundances of multiple functional genes related to N2O emission were quantified to clarify soil microbial mechanism of N2O emission under different straw types. The results showed that RS, WS and MS treatments increased N2O emissions by 162.32%, 107.11% and 9.48%, respectively, in which RS was significantly higher than those from MS treatment. The abundance of ammonia oxidizing bacteria and ammonia oxidizing archaea (AOA, AOB) and denitrifiers communities (,) all showed a similarly change, increasing first and then decreasing with rice growth. Compared with CK treatment (no straw), RS treatment significantly increased the abundances of AOA, AOB,andby 6.14, 8.26, 4.82 and 16.96 times in the elongation stage, respectively, while no significant response was found in either MS or WS treatment. Soil NH4+-N content was generally higher than NO3–-N during rice growth, with an increasing pattern until the tillering stage, and then decreased with rice growth, while no significant difference was found among different straw treatments. The results of correlation analysis and the Structural Equation Modeling (SEM) showed that AOB abundance and soil NH4+-N content were the main factors affecting N2O emission in paddy field. Considering the comprehensive results of soil physiochemical properties, rice yield and soil microbial abundance, maize straw is the most appropriate for N2O emission mitigation and yield enhancement of single-cropping paddy field in the Taihu Lake Basin.

Straw type; N2O emission; Soil microorganisms; Structural equation modeling; Paddy field

S154.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.04.015

謝婉玉, 王永明, 紀(jì)紅梅, 等. 秸稈還田種類對(duì)稻田N2O排放及硝化反硝化微生物的影響. 土壤, 2022, 54(4): 769–778.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(42077043)、江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃(自然科學(xué)基金)項(xiàng)目(BK20191400)和江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(20)3178)資助。

(jiyang@nuist.edu.cn)

謝婉玉(2000—)，女，河南南陽(yáng)人，本科生，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)田溫室氣體排放及微生物機(jī)理。E-mail: 201883310089@nuist.edu.cn