劉冬暉，李鳳巧，靳志麗，李孝剛*

煙草根表可培養(yǎng)細菌群落組成及典型菌群的促生特性研究①

劉冬暉1，李鳳巧1，靳志麗2*，李孝剛1*

(1 南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，南京 210037；2 湖南省煙草公司永州市公司，湖南永州 425000)

植物微生物組是維護植物生長發(fā)育、提升抗逆防病的重要調(diào)控因素。為發(fā)揮植物微生物促進煙草生長、改善煙草根區(qū)微生態(tài)功能作用，本研究從煙草根表分離篩選可培養(yǎng)細菌組，并對不同菌株的促生能力進行測定。結(jié)果表明：①從煙草根表分離并鑒定出可培養(yǎng)菌株310株，隸屬于31個屬，其中主要為芽孢桿菌屬()、假單胞菌屬()；②對比分析發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬()和成對桿菌屬()為4種供試土壤煙草根表共有的細菌類群；③對進一步篩選得到的16株菌株進行促生能力的測定，發(fā)現(xiàn)6株菌具有固氮能力，5株菌產(chǎn)鐵載體，4株菌可溶解無機磷，4株菌產(chǎn)IAA；④盆栽試驗驗證16株菌株的促生效果，其中37.5% 的菌株對煙草生長具有顯著促進作用，煙草株高、總鮮物質(zhì)量和地下部干物質(zhì)量分別比對照提高35.1%、27.9% 和30.7%?？傊瑥臒煵莞矸蛛x獲得多種具有促生能力的菌株，為未來構(gòu)建促進煙草健康生長的復合菌劑提供了理論基礎(chǔ)。

煙草根表；可培養(yǎng)細菌；促生篩選；植物微生物組

煙草作為一種重要的經(jīng)濟作物，在我國黃淮、西南、東南等地區(qū)有著廣泛的種植[1]。然而，由于不合理的種植制度、施肥和水分管理等因素，對植煙區(qū)煙株生長有益的促生菌難以在植物根部定殖和增殖，導致煙葉產(chǎn)量降低、品質(zhì)持續(xù)下降[2-3]。對此，一般采取輪作、添加土壤改良劑和實行不同的施肥方式等措施，但效果有限，且針對性不強[3-5]。

根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指生活在根際或根表區(qū)域內(nèi)對植物的生長起促進作用的微生物[6-7]。已有研究證明，根際“有益菌群”在促進植物生長、提升抗逆性、抗病等方面發(fā)揮重要作用[8-10]。例如，何斐等[11]從健康的魔芋根際中發(fā)現(xiàn)2種優(yōu)勢細菌B18和B17，對魔芋生長具有促生和抗病能力。張從宇和孔德樹[12]從大豆根際分離出20株對植物病原真菌具有拮抗作用的細菌，表現(xiàn)出對多種病害的良好防效。然而，已有研究大多采用“抖根法”獲取植物根際土壤樣品，無法避免非根際土壤或植物根表土對根際土壤樣品的“污染”或影響。例如，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，花生根際微生物數(shù)量顯著低于根表，這說明根表微生物與根系生理生化代謝活性密切相關(guān)，是植物健康狀況關(guān)鍵指示器[13]。因此，根據(jù)其自身生態(tài)位特性，分離篩選植物根表定殖力強的功能微生物，是未來獲取高效微生物資源、優(yōu)化根區(qū)生態(tài)功能和改善植物生長健康的重要基礎(chǔ)。對此，從樣品采集及分析方法上對“根表”與“根際”土進行區(qū)別研究，有助于利用關(guān)鍵微生物種群對植物生長健康開展精確調(diào)控。

本研究采集了湖南永州煙草種植區(qū)代表性田塊壤樣品，通過溫室盆栽試驗結(jié)合16S rRNA基因序列鑒定和對比分析，分析煙草根表可培養(yǎng)微生物群落特征。由于分離獲得的微生物群落組成之間存在較大差異，為尋找更多具有促生能力的菌株，從3種及以上代表性土壤中共同存在的屬中，選擇代表性菌株開展促生能力分析[14]。研究旨在獲得植煙根表穩(wěn)定定殖的微生物菌群，鑒別對煙草生長具有促進能力的菌株，為改善煙草根區(qū)微生物生態(tài)功能提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與煙草

供試土壤選自湖南省永州市烤煙產(chǎn)區(qū)藍山、江華、冷水灘等4種代表性的煙田，在每種田塊中選取多點采集耕層土壤100 kg，共采集4種不同質(zhì)地代表性土壤樣品用于后續(xù)盆栽試驗，各土壤樣品的具體理化性質(zhì)見表1。供試煙草(L.)為永州當?shù)責焻^(qū)普遍栽植的云煙87。

表1 四種供試土壤理化性質(zhì)

注：同列小寫字母不同表示不同土壤間差異顯著(<0.05；Tukey HSD test)。

1.2 盆栽試驗及根表微生物組獲取

在溫室進行盆栽試驗，每個土壤處理設(shè)置10盆重復，每盆栽種1株煙苗，盆缽隨機擺放，期間定時定量澆水。移栽40 d后，選取長勢一致的煙株進行破壞性取樣，拔出整棵植株以獲得完整根系，抖落根部明土。按照Edwards等[15]方法將根系放入裝有磷酸鹽緩沖液(PBS)的無菌燒瓶中，用無菌鑷子搖動根系，以清除根系殘留的根際土壤。用PBS緩沖液沖洗根部3次后將根系放入裝有PBS緩沖液的錐形瓶中振蕩，40 KHz超聲1 min，使根表微生物全部進入緩沖液中，得到煙草根表微生物懸液，離心后去掉上清液即獲得煙草根表微生物組。

1.3 根表微生物分離及鑒定

根表微生物分離所用培養(yǎng)基為胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和TSA液體培養(yǎng)基。吸取0.2 ml根表微生物懸液，梯度稀釋后，在1/10 TSA培養(yǎng)基上涂布，每個土壤處理3個重復。在20 ℃下培養(yǎng)7 d后，選擇形態(tài)各異的菌株，用無菌接種環(huán)挑取單個菌落到TSA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。純化多次后，即可得到單個菌株，根據(jù)平板細菌形態(tài)觀察，舍棄重復菌株。

用細菌基因組DNA提取試劑盒(購于天根生物試劑公司)提取細菌總DNA，采用16S rRNA基因的通用引物：上游引物16S F：5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′；下游引物16S R：5′-GGCTACCTT GTTACGACTT-3′對菌株進行16S rRNA基因序列擴增。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至上海生工測序，測序結(jié)果在NCBI上進行Blast比較分析，并與Genbank中的其他菌株基因序列進行同源性比較。

1.4 根表微生物促生能力測定

菌株接種到TSA液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)48 h(30 ℃，170 r/min)，活化得到種子液。吸取2 μl種子液分別點接在無氮培養(yǎng)基、CAS檢測培養(yǎng)基、無機磷培養(yǎng)基上，封口膜封口后于25 ℃下培養(yǎng)7 d。觀察是否出現(xiàn)水解圈，以鑒定菌株的固氮、產(chǎn)鐵載體以及溶解無機磷能力。用水解圈直徑()與菌落直徑()的比值(/)初步比較菌株促生能力強弱[16]。每個處理設(shè)置4個重復。

IAA產(chǎn)生能力測定：按1% 的接種量將種子基接入含有5 mmol/L色氨酸的TSA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，取1 ml菌液，10 000 r/min離心5 min。取上清液，加入等量Salkawski顯色劑，黑暗中顯色30 min后用酶標儀測定吸光值(OD530nm)，同時制作濃度為0、10、20、30、40和50 μg/ml的標準曲線，計算IAA濃度[17]。

1.5 根表微生物促生效果驗證

無菌煙苗制備：煙草種子于75% 酒精浸泡3 ～ 5 min，5% 次氯酸鈉再次浸泡3 min，最后用無菌水沖洗3次。無菌種子轉(zhuǎn)移至鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每個皿中加入5 ml無菌蒸餾水。置于培養(yǎng)箱中30 ℃下培養(yǎng)10 d，每48 h檢查是否污染雜菌。將發(fā)芽的煙苗移栽至滅菌基質(zhì)中，培養(yǎng)到合適苗齡，用于后續(xù)促生效果試驗。

無菌土獲得：盆栽所用土壤同樣是來自于永州市烤煙產(chǎn)區(qū)典型煙田土，高溫高壓滅菌后備用。

菌懸液制備：將上述通過促生能力測定篩選到的菌株進行溫室盆栽促生效果驗證。菌株種子液以1% 接種量接入到100 ml TSA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，調(diào)整菌液濃度為OD600=1；離心8 min，沉淀用無菌水洗滌一次后重振，定容到50 ml以獲得菌懸液。

將苗齡50 d的無菌云煙87幼苗移植裝有200 g土壤的無菌紙杯中，每株幼苗根部接種5 ml菌劑，以根部接種5 ml無菌水為對照組(CK)。每種菌株處理設(shè)置7個重復，在無菌室中培養(yǎng)，隨機擺放并定時改變擺放位置，45 d后測量煙草株高、地下部干物質(zhì)量等相關(guān)促生指標。同時，在煙株收獲時挑選部分處理的煙株，獲得根系微生物組懸液，利用稀釋平板涂布法測定菌株在根部的定殖情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用 Microsoft Excel 2010和IBM SPSS Statistics 26進行數(shù)據(jù)處理，并利用GraphPad Prism 8和Origin 2021進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根表微生物組獲取

植煙根表共分離純化出細菌310株，經(jīng)16S rRNA基因序列比對分析，分離的可培養(yǎng)微生物組主要有變形菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、厚壁菌(Firmicutes)和放線菌(Actinobacteria)4個細菌門(圖1A)。在4種土壤中，變形菌門均是煙草根表的優(yōu)勢菌門，占總分離菌株的60.0%。綱水平上，4種土壤中的可培養(yǎng)微生物主要包含芽孢桿菌綱(Bacilli)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、噬纖維菌綱(Cytophagia)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)、放線菌綱(Actinobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)等(圖1B)。其中，從土壤1中分離鑒定出的放線菌門和擬桿菌門明顯少于其余3種土壤，而土壤2和土壤3中厚壁菌門分離數(shù)量較少。從土壤1和2中分離鑒定γ-變形菌綱的數(shù)量明顯少于其他兩種土壤，而β-變形菌綱呈相反趨勢。土壤2中未分離出鞘脂桿菌綱微生物，土壤3中未分離出α-變形菌綱的微生物。

圖1 不同土壤中煙草根表可培養(yǎng)微生物門(A)和綱(B)水平上的組成

在屬水平上，這些可培養(yǎng)微生物組共包括31個細菌屬類。其中，變形菌門中的假單胞菌屬()和寡養(yǎng)單胞菌屬()，擬桿菌門中的成對桿菌屬()，以及厚壁菌門中的芽孢桿菌屬()為4種供試土壤植煙根表共有的細菌類群。進一步結(jié)合維恩圖分析發(fā)現(xiàn)，4種代表性土壤中煙草根表微生物群落在屬水平上具有較大的差異(圖2)。因此，為更多獲得在煙草根表穩(wěn)定定殖的、具有潛在促生作用的菌株，本研究選取了同時存在于3種及以上土壤中的細菌屬類群來進行菌株篩選，對此挑選出代表性菌株共16株，隸屬于4個門、6個綱、9個屬(表3)。

圖2 不同土壤中植煙根表微生物類群Venn圖(屬水平)

表3 煙草根表分離鑒定的代表性菌株

2.2 代表性菌株的促生能力分析

測定結(jié)果表明，16株菌中6株有固氮能力，其中菌株YC8表現(xiàn)出較強的固氮能力；有5株菌株具有產(chǎn)鐵載體能力，其中YC8和YC15表現(xiàn)出了較強的產(chǎn)鐵載體能力；4株菌株可以對無機磷進行溶解，其中YC8、YC9和YC21三株菌株具有較強的解無機磷的能力(表4)。有4株菌可產(chǎn)IAA，分別是YC1、YC8、YC21、YC36(圖3)。其中菌株YC8產(chǎn)IAA能力最強，菌液中IAA含量為18.40 μg/ml；其次是YC1，菌液中IAA含量為15.27 μg/ml；分泌IAA能力最弱的是菌株YC21，含量為6.50 μg/ml。

2.3 溫室盆栽試驗

將16株菌株進行溫室盆栽試驗，通過對比煙草苗移栽前和采收后的促生指標的變化(圖4)，YC3、YC4、YC8、YC15、YC17和YC18處理下的煙草在多個指標中都表現(xiàn)出顯著促進作用，占總接種菌株的37.5%。與CK處理相較，接種這6株菌株對煙草株高、總鮮物質(zhì)量和地下部干物質(zhì)量分別提高35.1%、27.9% 和30.7%。

3 討論

植物根系微域微生物對促進植物生長、防治病害具有重要作用[18-20]。已有研究表明，煙草根系區(qū)域有多種不同的微生物類群，是煙草生長發(fā)育的關(guān)鍵影響因素[21-22]。周亞男等[23]從不發(fā)病煙田中的K326煙草根際分離篩選屬于4個門、17個屬的可培養(yǎng)微生物160株，其中γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱和β-變形菌綱為主要優(yōu)勢類群，假單胞菌屬和芽孢桿菌屬是主要優(yōu)勢菌。在本研究中，從湖南省永州市烤煙產(chǎn)區(qū)4種代表性土壤的煙草根表分離鑒定出310株可培養(yǎng)細菌，分屬于4個門、8個綱、31個屬。相較于煙草根際可培養(yǎng)細菌類群，本研究在煙草根表發(fā)現(xiàn)了黃桿菌綱和噬纖維菌綱，而γ-變形菌綱、β-變形菌綱和芽孢桿菌綱在根際和根表中共同存在，但相對豐度明顯不同，這種差異可能是由煙草根系對微生物的選擇所造成。在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)多樣性更高的根表微生物，而假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、成對桿菌屬和芽孢桿菌屬為4種供試土壤煙草根表共有的細菌類群。目前有研究表明，很多來自于假單胞菌屬和芽孢桿菌屬等的菌株能通過溶磷、解鉀和產(chǎn)IAA等方式促進煙草的生長[24-25]。因此，煙草根表共有的細菌種群可能包含對煙草健康生長有益的菌株。

表4 菌株的促生能力

注：+：0

(柱狀圖上不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05))

(柱狀圖上的*表示處理組與對照組差異顯著(P<0.05))

為獲得的功能菌具有廣譜適用性，本研究所選菌株以同時在3種及以上供試土壤中存在為篩選原則，從獲得的根表微生物組挑選出代表性菌株進行微生物促生能力測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各微生物菌株在固氮能力、產(chǎn)鐵載體能力、無機磷溶解及產(chǎn)IAA均具有一定功能特性，其中假單胞菌屬的菌株YC8和YC21促生特性更為突出。孫曉瑩等[26]發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬耐鹽菌YZX4在不同鹽濃度下同時具有較強的ACC脫氨酶活性、IAA合成能力、嗜鐵素合成能力、固氮能力和溶磷(有機磷和無機磷)能力。假單胞菌株因具有多種促生能力可能會成為促進植物生長的潛在生物資源。進一步通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，有6株菌株在株高、總鮮物質(zhì)量、地下部干物質(zhì)量等指標中表現(xiàn)出顯著的促進作用，其主要屬于假單胞菌屬、成對桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和微桿菌屬。因此，除了假單胞菌外，其他菌屬也具有很多促進植物生長的細菌類型[27-28]。如，Kumar等[29]分離出sp.可通過根際生物固氮的方式促進植物氮素的獲取。Egamberdieva等[30]發(fā)現(xiàn)嗜根寡養(yǎng)單胞菌DSM 14405T能促進植物的生長。同時，假單胞菌屬、成對桿菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬為本研究4種代表性土壤中煙草根表共有的細菌屬類，這為改善煙草根區(qū)微生態(tài)功能提供了依據(jù)和新思路。

綜上所述，本研究通過煙草根表微生物組進行規(guī)?；蛛x鑒定，并獲得了多株具有促生潛力的菌株，為后續(xù)應(yīng)用研究提供了微生物資源和研究思路，也為進一步研究不同微生物之間的協(xié)同互作促進植物生長，改善植物根系微觀微生物生態(tài)功能提供理論基礎(chǔ)。

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Culturable Bacterial Community of Tobacco Root Surface and Their Growth-promoting Characteristics

LIU Donghui1, LI Fengqiao1, JIN Zhili2*, LI Xiaogang1*

(1 College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2 Yongzhou Tobacco Company of Hunan Province, Yongzhou, Hunan 425000, China)

Plant microbiome is an important factor in plant growth, stress resistance and disease prevention. In order to find the role of plant microbiome in promoting growth and improving root microecology of tobacco, in this study, culturable bacteria were isolated from the root surface of tobacco, and the growth promoting ability of different strains was determined. The results showed that: 1) 310 culturable strains were isolated from the root surface of tobacco, belonging to 31 genera, in which most areand. 2) Comparative analysis showed that,,, andare the common bacteria in tobacco root surface of different tested soils. 3) Within 16 strains obtained by further screening, 6 strains have the ability to fix nitrogen, 5 strains can produce siderophores, 4 strains can dissolve inorganic phosphorus, and 4 strains can produce IAA. 4) Pot experiment verified the growth promoting effect of the strains, the six strains increased the plant height, total fresh weight and underground dry weight by at least 35.1%, 27.9% and 30.7%, respectively, accounting for 37.5% of all inoculated strains. In short, a variety of strains with growth-promoting ability can be isolated from the root surface of tobacco, which provides a theoretical basis for the construction of microbial community to promote tobacco growth in the future.

Tobacco root surface; Cultivable bacteria; Growth promotion screening; Plant microbiome

Q939.96

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.04.012

劉冬暉, 李鳳巧, 靳志麗, 等. 煙草根表可培養(yǎng)細菌群落組成及典型菌群的促生特性研究. 土壤, 2022, 54(4): 750–755.

中國煙草總公司湖南省公司科技項目(18-20Aa03)資助。

(jinzhili666@126.com; xgli@njfu.edu.cn)

劉冬暉(1997—)，女，山東濟南人，碩士研究生，主要研究方向為微生物生態(tài)。E-mail: 984526870@qq.com