任 濤 龐玉蓮 薛詩夏 陳 旭 張雨涵 楊 劍 譚艾娟 呂世明*

（1貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；2貴州大學生命科學學院，貴州貴陽 550025）

細菌性腹瀉是人和動物的常見疾病，細菌毒素引起的劇烈腹瀉、多器官損傷和脫水是細菌性腹瀉的主要危害[1]。目前，臨床主要通過抗菌、支持療法治療細菌性腹瀉，但抗菌藥物治療在殺死細菌的同時也可造成細菌內(nèi)毒素突擊釋放而危及生命[2]。革蘭氏陰性細菌在死亡后釋放的內(nèi)毒素為細菌細胞壁的脂多糖成分，過多的細菌內(nèi)毒素可在動物機體內(nèi)發(fā)生一系列嚴重的病理反應(yīng)。因此，在探索抗菌治療的同時降低細菌毒素危害的途徑，對安全、有效地指導(dǎo)治療細菌性腹瀉具有重要意義，目前對這方面的研究鮮有報道。

金銀花是重要的中藥材，其具有良好的抗炎[3-7]、抗菌[8-11]、抗病毒[12-16]等作用。已有研究表明，金銀花能減輕腹瀉時細菌毒素導(dǎo)致的危害[17]。在前人研究報道中發(fā)現(xiàn)，金銀花的體外抑菌活性較好，但是目前對金銀花體外抗細菌內(nèi)毒素的研究較少?；诖?，本試驗擬研究金銀花不同提取物如水提取物、醇提取物、石油醚提取物等的體外抗細菌內(nèi)毒素作用，以期為后續(xù)金銀花抗細菌內(nèi)毒素的作用機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料。供試材料有：金銀花干花，購自北京同仁堂（安國）中藥飲片有限公司；乙酸乙酯、石油醚、無水乙醇、濃鹽酸、醋酸，均為國產(chǎn)分析純；顯色基質(zhì)鱟試劑（end-point chromogenic tachypleus amebocyte lysate，EC TAL），購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司。

1.1.2 儀器。供試儀器包含旋渦混合器（濟南歐萊博科學儀器有限公司）、LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、FA2004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）、分光光度計（南京菲勒儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、250 mL玻璃蛇形索氏提取器（崇州市蜀?？茖W儀器有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 金銀花提取液的制備。分別采用水提法、乙醇回流提取法和石油醚回流提取法制備金銀花的提取液。

（1）水提法。將金銀花干花粉碎制成細粉，取10 g金銀花細粉溶于160 mL蒸餾水中，提取溫度為80℃，煎煮1次用時1.5 h。得到的水提物經(jīng)紗布過濾4次，然后抽濾1 h，再經(jīng)轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心8 min取上清液，得到水提取物。

（2）乙醇回流提取法。準確稱取10 g金銀花細粉并用濾紙封閉，加入160 mL 75%乙醇中，提取溫度為95℃，回流2次，用時200 min。將提取液抽濾10 min，在95℃條件下分餾出無水乙醇回收處理，再經(jīng)轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心8 min，取上清液，獲得乙醇提取物。

（3）石油醚回流提取法。精確稱取金銀花干花10 g加入160 mL石油醚，50℃回流提取2次，用時1 h。再將提取液在52℃下分餾出石油醚進行回收，再用無水乙醇稀釋，經(jīng)轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心8 min取上清液，得到石油醚提取物。

1.2.2 測定內(nèi)容與方法。金銀花中對細菌內(nèi)毒素清除效果最佳的主要有效成分為綠原酸。本試驗先制作綠原酸標準曲線，再對其含量進行測定。

（1）綠原酸標準曲線制作。參考李 坤等[18]、李耀倉等[19]文獻報道進行綠原酸標準曲線的制作：稱取1.0 mg綠原酸標準品與無水乙醇置于10 mL容量瓶中并搖勻，再從中分別吸取 500、1 000、1 500、2 000、3 000 μL于另一10 mL容量瓶中，再用無水乙醇對綠原酸進行定容。將不同濃度的綠原酸溶液分別裝入干凈的試管中并編號。調(diào)至綠原酸最大吸收波長328 nm處測量吸光度，以5個不同濃度樣本的吸光度值為縱坐標、以綠原酸標準品溶液的濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。

（2）綠原酸含量測定。取醇提法獲得的提取液1.5 mL（其對細菌內(nèi)毒素的清除率最高），加入蒸餾水40 mL進行稀釋后，采用紫外分光光度法對其吸光度值（OD328）進行測定，并記錄數(shù)值。根據(jù)綠原酸標準曲線方程，得出金銀花醇提物中主要有效成分綠原酸的含量。

1.2.3 金銀花提取物與細菌內(nèi)毒素的作用。分別取0.75 mL不同方法提取的金銀花提取液與0.75 mL細菌內(nèi)毒素標準品（5 EU/mL）進行混合后，放置于37℃溫育12 h，使3種金銀花提取物與細菌內(nèi)毒素發(fā)生作用，取出備用。

1.2.4 鱟試驗（終點顯色法）檢測內(nèi)毒素清除效果。以標準曲線為基礎(chǔ)，通過鱟試驗測定不同金銀花提取物對內(nèi)毒素的清除作用。

（1）標準曲線的建立。以15 EU/mL的內(nèi)毒素標準溶液為母液，用細菌檢查用水將其稀釋成0.10、0.25、0.5、1.0 EU/mL的濃度梯度。取無熱原試管，加入100 μL細菌內(nèi)毒素檢查用水、設(shè)計好的內(nèi)毒素標準溶液和供試品。再加入100 μL鱟試劑溶液，混勻后蓋上試管蓋，37℃溫育6 min。溫育結(jié)束后再加入100 μL顯色基質(zhì)溶液，混勻，37℃溫育6 min。溫育結(jié)束后向其加入500 μL偶氮化試劑1溶液，混勻；再加入500 μL偶氮化試劑2溶液，混勻；最后加入500 μL偶氮化試劑3溶液，混勻后靜置5 min。將分光光度計調(diào)至545 nm波長處讀取待測樣本的吸光度值。以吸光度值作為縱坐標、細菌內(nèi)毒素濃度作為橫坐標建立內(nèi)毒素標準曲線。

（2）鱟試驗測定不同金銀花提取物對內(nèi)毒素的清除作用。3種提取方法所得到的金銀花提取液與細菌內(nèi)毒素作用后，參照鱟試劑說明書，通過鱟試劑、顯色基質(zhì)反應(yīng)和偶氮化試劑的顏色反應(yīng)，測定水提取法、乙醇提取法、石油醚提取法所得提取物中內(nèi)毒素的殘留含量。根據(jù)以下公式得出3種提取物對內(nèi)毒素的清除率[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同金銀花提取物中綠原酸含量的測定結(jié)果

以綠原酸標準品溶液的吸光值為縱坐標、綠原酸標準品溶液的濃度（μg/mL）為橫坐標制作出標準曲線，如圖1所示。該曲線的回歸方程為y=0.032 5x-0.011 6，R2=0.999 8。

不同金銀花提取液中綠原酸的濃度如表1所示，金銀花水提取液、乙醇提取液、石油醚提取液中綠原酸含量分別為 11.536±0.036、12.347±0.099、11.752±0.047 μg/mL。結(jié)果表明，3種提取液中，乙醇提取液中綠原酸含量極顯著高于水提取液和石油醚提取液中綠原酸含量。

表1 不同金銀花提取物中綠原酸含量（n=3）

2.2 不同金銀花提取物對細菌內(nèi)毒素的清除率

以細菌內(nèi)毒素標準溶液的吸光度值作為縱坐標、細菌內(nèi)毒素標準溶液的濃度作為橫坐標，建立細菌內(nèi)毒素標準溶液的標準曲線，如圖3所示。標準曲線的回歸方程為y=0.88x+0.103 4，R2=0.998 3。測得陰性對照組吸光度平均值y=0.056，低于標準曲線最低點的y值，滿足試劑盒測定要求；同時，對供試品進行干擾試驗，測得供試品的回收率為98%，符合試劑盒說明書中50%～200%的要求，因而在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。

3種提取方法得到的金銀花提取液與標準細菌內(nèi)毒素作用后，進行顯色基質(zhì)反應(yīng)和偶氮化試劑的顏色反應(yīng)。將水提取法、乙醇提取法、石油醚提取法提取物的吸光值代入回歸方程（y=0.88x+0.103 4），計算出3種提取液中內(nèi)毒素殘留量。結(jié)果表明，水提取液、乙醇提取液、石油醚提取液中內(nèi)毒素殘留量分別為 0.799±0.005、0.164±0.001、0.175±0.002 EU/mL。根據(jù)清除率方程計算，水提取液對細菌內(nèi)毒素的清除率為84.02%±0.10%，乙醇提取液對細菌內(nèi)毒素的清除率為96.71%±0.02%，石油醚提取液對細菌內(nèi)毒素的清除率為96.50%±0.04%（表2）。

表2 不同金銀花提取物對細菌內(nèi)毒素的清除作用（n=4）

3 結(jié)論與討論

細菌性腹瀉危及人和動物的健康，導(dǎo)致劇烈腹瀉、多器官損傷和脫水。雖然可以通過抗菌藥物進行治療，但伴隨抗菌藥物在臨床上長期的廣泛使用，各種類型的耐藥菌株也相繼產(chǎn)生?？咕幬镌诎l(fā)揮治療作用而殺死細菌的同時，也會造成細菌內(nèi)毒素突然釋放，可能對人和動物生命造成威脅[21]。在抗菌治療時降低細菌毒素的危害，對安全、有效地指導(dǎo)治療細菌性腹瀉具有重要意義。

本試驗采用水提法、乙醇回流提取法、石油醚提取法得到3種金銀花提取物，測得綠原酸含量分別為 11.536±0.036、12.347±0.099、11.752±0.047 μg/mL。將3種金銀花提取物與5 EU/mL的標準大腸桿菌內(nèi)毒素作用12 h，通過鱟試驗測定各提取物中殘留內(nèi)毒素的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水提取法、乙醇提取法、石油醚提取法所得提取物中殘留內(nèi)毒素的含量分別為0.799±0.005、0.164±0.001、0.175±0.002 EU/mL。 水提取液對細菌內(nèi)毒素的清除率為84.02%±0.10%，乙醇提取液對細菌內(nèi)毒素的清除率為96.71%±0.02%，石油醚提液對細菌內(nèi)毒素的清除率為96.50%±0.04%。由此表明，乙醇提取液對大腸桿菌內(nèi)毒素的清除作用最佳，其次為石油醚提取液和水提取液。

研究指出，金銀花水提物能夠破壞細菌內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)，從而起到抗炎作用；其中綠原酸為金銀花中主要抗菌成分，其對細菌內(nèi)毒素也有一定的對抗作用[22]。本試驗采用鱟試驗法篩選出的金銀花乙醇提取物對細菌內(nèi)毒素清除效果最佳，并且乙醇提取物中綠原酸含量最高，這說明金銀花中主要成分之一的綠原酸可能在細菌內(nèi)毒素清除方面發(fā)揮重要作用。

綜上所述，金銀花乙醇提取液對大腸桿菌內(nèi)毒素的清除效果最佳，其清除作用可能與金銀花乙醇提取物中較高的綠原酸含量有關(guān)，具體機制需進一步研究。